許曉輝

蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院

王小喬*

蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院

趙波

蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院

朱仁愿

蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院

潘秀麗

蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院

面部痤瘡也稱為青春痘，是一種發(fā)生在毛囊皮脂腺及其周圍組織的炎癥病變，在年輕人中發(fā)生較為普遍，主要發(fā)生在面部。近年來，祛痘類化妝品的消費量逐年上升，許多化妝品企業(yè)推出了種類繁多的祛痘類產(chǎn)品，主要以硫磺、水楊酸、視黃醇棕櫚酸酯、尿囊素等物質(zhì)作為主要祛痘活性物質(zhì)，或者采用中藥（如丹參、苦參、甘草、黃芩和金銀花等）提取物，從祛痘、預防、養(yǎng)膚等關(guān)鍵環(huán)節(jié)入手，使痤瘡得到有效緩解[1]?；前奉愃幬锞哂徐疃弧⒖狗鄞?、除螨等功效，一些不法商家為了提升祛痘類化妝品的功效，存在向產(chǎn)品中違法添加磺胺類藥物的情況[2-8]，長時間使用含磺胺類藥物的產(chǎn)品可導致其在人體內(nèi)蓄積，易引起接觸性皮炎、抗生素過敏等，還易產(chǎn)生耐藥性，對人體產(chǎn)生危害。我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015年版）》中明確規(guī)定了磺胺類藥物為化妝品禁用組分。目前，對于化妝品中磺胺類藥物檢測方法，已經(jīng)頒布的國家法定標準只有GB/T 24800.6-2009《化妝品中二十一種磺胺的測定 高效液相色譜法》，液質(zhì)聯(lián)用法的法定標準尚未發(fā)布。有關(guān)化妝品中磺胺類藥物檢測的常用前處理方法包括液液萃取和固相萃取等傳統(tǒng)方法，這些檢測方法和樣品前處理方法均各具優(yōu)勢和缺陷[9-10]。近年來，PRiME HLB 固相萃取小柱因無需活化和平衡步驟，直接過濾即可有效去除蛋白質(zhì)、磷脂和色素等干擾物質(zhì)，已成為化妝品中違法添加物質(zhì)檢測凈化的主要技術(shù)手段[11-12]，目前雖有高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定化妝品中磺胺類藥物的相關(guān)文獻報道[9-10]，但基于PRiME HLB 固相萃取小柱凈化測定化妝品中磺胺類藥物的檢測方法文獻報道還相對缺乏。為了判定祛痘類化妝品中磺胺類藥物的使用風險，本研究采用飽和氯化鈉溶液破乳，使用乙腈提取樣品，以PRiME HLB 固相萃取小柱凈化提取液，ACQUITY BEH C18 柱進行分離，基于超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術(shù)，建立了測定祛痘類化妝品中9 種磺胺類藥物的檢測方法，并應(yīng)用于實際樣品的快速篩查。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

標準物質(zhì)：磺胺間甲氧嘧啶購自北京曼哈格生物科技有限公司；磺胺甲 唑、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺喹沙啉、磺胺氯噠嗪、磺胺甲基嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶均購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶購自中國食品藥品檢定研究院。甲酸、乙酸銨（色譜純，東京化成工業(yè)株式會社）；乙腈、甲醇（色譜純，德國Merck 公司）；水為超純水器自制超純水；其他試劑為分析純；PRiME HLB 固相萃取小柱（6cc，500mg，美國沃特世公司）。

實際檢測祛痘類化妝品樣品均隨機購于化妝品專賣店，劑型為膏霜類、乳液類。

1.1.2 儀器

1290-6460 超高效液相色譜-三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源，美國安捷倫有限公司）；MS105DU 分析天平（瑞士梅特勒托利多）；SBL-10DT 超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Vortex-genie2 渦旋混合器（美國Scientific Industries 公司）；Milli-Q 超純水器（美國Millipore公司）；5810R 離心機（德國Eppendorf 公司）。

1.2 實驗條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY BEH C18 柱（1.7 μ m，2.1mm×100mm）；樣品室溫度：10 ℃；柱溫：35 ℃；進樣量：2μl；流速：0.3ml/min；流動相：A 為含0.1% 甲酸-2mmol/L 乙酸銨的水溶液，B 為含0.1%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脫：0～2.0min，15%B；2.0～3.0min，25%B；3.0～4.0min，30%B ；4.0～5.0min，45%B ；5.0～7.0min，60%B；7.0～9.0min，90%B；9.0～10.0min，90%B；10.0～11.0 min，15%B ；11.0～12.0min，15%B。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：正離子噴射流電噴霧離子源（AJS ESI）；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；霧化氣壓力：45psi；氣流速度：6L/min；氣流溫度：325 ℃；噴霧電壓：500V；毛細管電壓：4000V；鞘氣流速：12L/min；鞘氣溫度：350℃；標準物質(zhì)的母離子、子離子、碎裂電壓及碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。

表1 標準物質(zhì)的質(zhì)譜測定條件

1.3 實驗方法

1.3.1 對照溶液制備

精密稱取磺胺類藥物對照品各10.0mg，分別置于10ml 棕色容量瓶中，用乙腈溶解，并定容至刻度，配制成磺胺甲 唑、磺胺氯噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹沙啉、磺胺甲基嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶濃度分別為 1.031、1.093、1.026、1.100、1.088、1.129、0.9831、1.094、1.129mg/ml的單一對照品溶液，然后分別準確吸取上述單一對照品溶液0.10ml，置同一100ml 棕色容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度，配制成各磺胺類藥物濃度均約為 1μg/ml的混合對照品中間液；最后精密移取該混合對照品中間液1.00ml，置10ml 棕色容量瓶，用乙腈稀釋并定容至刻度，配制成各藥物濃度均約為0.1μg/ml的混合對照品溶液，置 4℃冷藏備用。

1.3.2 供試品溶液制備

準確稱取樣品0.5g 于50ml離心管中，加入10ml 飽和氯化鈉溶液，放入陶瓷均質(zhì)子，渦旋混合1min，然后準確加入乙腈10ml，渦旋混合1min，在300W 功率下超聲提取5min，以3900r/min 離心10min，取上清液2ml 過PRiME HLB 固相萃取小柱，保持一秒一滴的流速，收集凈化流出液，過0.22μm 有機相濾膜，作為供試品溶液，然后將供試品溶液轉(zhuǎn)移至進樣瓶中，進超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件選擇

本研究中考察的磺胺類藥物屬于中等極性物質(zhì)，這些物質(zhì)在甲醇和乙腈中具有良好的溶解性。液質(zhì)聯(lián)用儀流動相的有機相一般都為甲醇和乙腈，考慮到乙腈為中等極性溶劑，與大多數(shù)被測化合物極性接近，因此本研究選擇乙腈作為提取溶劑。加入與提取溶劑等量的氯化鈉飽和溶液分散破乳，同時，在高速離心作用下，飽和氯化鈉溶液與乙腈分層，從而使被提取物質(zhì)進入到有機層，干擾性雜質(zhì)進入到水層。選擇PRiME HLB 固相萃取小柱對提取液進行直接過濾式凈化，為的是有效去除提取液中蛋白質(zhì)、磷脂等非極性雜質(zhì)，降低基質(zhì)效應(yīng)以增強質(zhì)譜響應(yīng)，同時該凈化方法直接過濾凈化，無需進行活化、清洗和洗脫等傳統(tǒng)固相萃取步驟，簡化了前處理流程，節(jié)約了時間。

2.2 色譜條件優(yōu)化

本研究中考察的磺胺類藥物屬于中等極性物質(zhì)，因此，選擇了適用于中等極性物質(zhì)通用的ACQUITY BEH C18 超高效色譜柱。在正離子模式下，在流動相中添加甲酸能夠提高目標化合物的離子化效率，添加乙酸銨能夠穩(wěn)定水相和改善峰型。因此，本研究中在水相中加入0.1%甲酸和2mmol/L 乙酸銨顯著改善了峰型、提高了靈敏度，在有機相中加入0.1%甲酸穩(wěn)定了保留時間，提高了重復性。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

本研究將被檢測的磺胺類藥物分別配制成單個標準溶液，在正離子模式下，直接注入質(zhì)譜儀，進行全掃描（Scan），確定母離子后，進行選擇性離子掃描（SIM），確定碎裂電壓，其次進行子離子掃描（Pro），選取豐度最高且相對穩(wěn)定的2 個碎片離子分別作為定性離子和定量離子，其中以峰型好、干擾小、信噪比高的離子對作為定量離子對，最后利用MassHunter 采集軟件及定性軟件，同時優(yōu)化定性和定量離子的碰撞能量參數(shù)，建立MRM 方法。

2.4 9 種磺胺類藥物的總離子流圖

以MRM 模式測定9 種磺胺類藥物的定性和定量離子對色譜圖，共有18 個離子監(jiān)測通道。圖1為濃度為10ng/ml的混合標準品的總離子流圖，由圖1可見，各個物質(zhì)響應(yīng)良好，峰形對稱，定量準確可靠。

圖1 9 種磺胺類藥物MRM 總離子流圖

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性關(guān)系、檢出限、定量下限

精密移取混合對照品溶液適量，用乙腈-水（20 ∶80，體積比）稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為0、2、5、10、20、40、60 ng/ml的系列標準曲線溶液，外標法定量。在優(yōu)化的實驗條件下，以待測物的峰面積（y）為縱坐標，以其質(zhì)量濃度（x，ng/ml）為橫坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明，各物質(zhì)在0～60ng/ml 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.9959。將混合對照品溶液加入空白基質(zhì)中，加標濃度逐級遞減，按 “1.3.2” 進行樣品前處理，以 3 倍信噪比時計算檢出限（LOD），10 倍信噪比時計算定量下限（LOQ）。結(jié)果顯示，LOD在0.0171～1.222μg/kg 范圍，LOQ 在0.0543～4.400μg/kg范圍，結(jié)果詳見表2。

表2 9 種磺胺類藥物的線性關(guān)系、檢出限、定量下限、回收率及RSD（n=6）

續(xù)表

2.5.2 回收率與相對標準偏差

在優(yōu)化的實驗條件下，對陰性樣品進行3 個濃度水平的加標回收實驗，加入的混合對照品中間液含量分別為100、200、400μg/kg，每個含量水平平行制備6 份樣品，每份樣品重復測定3 次，經(jīng)提取凈化后進行測定，外標法定量，計算平均回收率和相對標準偏差（RSD）。結(jié)果顯示，9 種磺胺類藥物的平均回收率為 62.4%～89.4%，RSD為2.3%～9.4%，結(jié)果詳見表2。結(jié)果表明，該方法的準確度良好，符合定量檢測要求。

2.6 實際樣品篩查

應(yīng)用本法對市售的15 批祛痘類化妝品中9 種磺胺類藥物進行檢測，結(jié)果顯示均未檢出。

3 結(jié)論

PRiME HLB 固相萃取小柱可以吸附樣品中非極性干擾物而不影響任務(wù)目標物的回收率，特別是對于造成基質(zhì)干擾的脂肪和磷脂，去除效率效果良好，可以達到用最簡單的過濾式樣品制備流程實現(xiàn)最潔凈樣品凈化的目標。本文采用飽和氯化鈉溶液分散破乳樣品，然后加入乙腈進行提取，在離心作用下，飽和氯化鈉溶液和乙腈溶液分層，乙腈層處于上層，上層溶液直接過PRiME HLB 固相萃取小柱凈化，UPLC-MS/MS 法檢測，外標法定量，實現(xiàn)了對祛痘類化妝品中磺胺類藥物的快速測定。實驗表明該方法前處理操作簡單、耗時短、抗干擾能力強，能夠滿足祛痘類化妝品中違法添加9 種磺胺類藥物的快速檢測需求。