董峻池，鄭慧玲，衛(wèi)羽雯，馬 騫

生物活性玻璃(bioactive glasses，BGs)由Larry Hench在1969年發(fā)明，是一類以SiO2-Na2O-CaO-P2O5氧化物體系為基礎(chǔ)的材料，有良好的生物活性與生物相容性。此外，BGs的抗菌作用顯著，除了對常見致病菌有抗菌效果外，對口腔細菌也有顯著抗菌作用，可作為潛在的抑菌劑用于治療細菌相關(guān)的口腔疾病。然而目前對于BGs的抑菌機制尚未見總結(jié)性研究報告，因此本文對口腔疾病常見致病菌以及BGs的抗菌機制和影響因素作一簡要綜述。

1 口腔常見致病菌

迄今為止發(fā)現(xiàn)的人類口腔細菌約有700多種，它們黏附在牙齒表面形成生物膜，在正常情況下與口腔固有環(huán)境維持動態(tài)平衡，當平衡被打破時，會導(dǎo)致口腔疾病[1]。牙菌斑生物膜黏附在牙齒或修復(fù)體表面，是由基質(zhì)包裹的、細菌相互黏附的微生物群落[2]，主要分為齦上牙菌斑生物膜和齦下牙菌斑生物膜，齦上菌斑以革蘭氏陽性兼性厭氧菌為主，是齲病的始動因子；齦下菌斑中的優(yōu)勢群落為革蘭氏陰性厭氧菌，與牙周病的發(fā)展密切相關(guān)[2]。

目前研究認為，具有耐酸和產(chǎn)酸能力的變形鏈球菌與乳酸桿菌是齲病發(fā)病的主要原因，此外，部分學(xué)者認為雙歧桿菌、放線菌、韋榮球菌、普氏菌等同樣參與了齲病的形成[3]。變形鏈球菌能通過疏水作用黏附于牙齒表面，形成具有高親和力的生物膜[4-5]。當糖分攝入過多時，微生物酵解糖產(chǎn)生有機酸，生物膜中的pH值下降，酸性環(huán)境有利于變異鏈球菌和乳酸桿菌的增殖，進而更促進酸性代謝產(chǎn)物的釋放，當pH值低于5.5時會導(dǎo)致牙釉質(zhì)脫礦發(fā)生齲病[6]。由此可推斷，導(dǎo)致齲病的并不是細菌本身，而是它們創(chuàng)造的微環(huán)境，針對致病菌的抗菌劑或改善微環(huán)境的材料都可能對齲病產(chǎn)生治療效果。

牙周病是指發(fā)生在牙周支持組織導(dǎo)致的各種疾病，目前各項研究已證明，齦下菌斑中的細菌及其產(chǎn)物是導(dǎo)致牙周病發(fā)生發(fā)展必不可少的因素[2]。齒垢密螺旋體、牙齦卟啉單胞菌和福賽坦氏菌構(gòu)成的紅色復(fù)合體和具核梭桿菌、伴放線聚集桿菌、中間普氏菌等[7]共同參與牙周病的形成，其中牙齦卟啉單胞菌是公認的牙周致病菌，可破壞宿主的免疫系統(tǒng)[8]。

牙周病時牙菌斑生物膜的形成呈動態(tài)，主要包括細菌的定植、細菌之間相互附著與共聚、斑塊成熟三大過程[9]。牙周病的發(fā)展伴隨著革蘭氏陽性菌的減少和革蘭氏陰性菌的富集。通常認為革蘭氏陽性鏈球菌是生物膜形成中的初始定植者[6]，其中血鏈球菌是公認的最早定植的鏈球菌，可維護口腔健康；除此以外變形鏈球菌能使表面的環(huán)境變?yōu)閰捬醐h(huán)境，為后續(xù)厭氧菌黏附做準備[4]，還能產(chǎn)生胞外聚合物如葡聚糖，使生物膜對抗菌劑具有更強的抵抗力[6]；戈登氏鏈球菌也可促進革蘭氏陰性厭氧菌的黏附，如可以通過鏈球菌抗原Ⅰ/Ⅱ蛋白與牙齦卟啉單胞菌的次要菌毛抗原Mfa1相互介導(dǎo)發(fā)揮作用[10]。

牙周病后期定植的厭氧菌增加，種類繁多，共同促進生物膜的成熟。如具核梭桿菌可表現(xiàn)為共生菌，通過表面的黏附素連接早期的革蘭氏陽性菌與晚期的革蘭氏陰性菌[11]。卟啉單胞菌屬、普氏菌屬和齒狀密螺旋體可以為其他厭氧菌提供氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，在生物膜的形成中發(fā)揮重要作用[12]。

除了上述與齲病、牙周病相關(guān)的致病菌，口腔中還有一些細菌在常見的感染性疾病中扮演重要的角色。如糞腸球菌與根尖周炎的發(fā)展和根管治療后再次感染相關(guān)[13-14]；普氏菌、梭桿菌、消化鏈球菌在干槽癥患者的拔牙窩內(nèi)含量較高[15]。

2 BGs的分類及抗菌作用

BGs按組成成分的不同分為硅酸鹽系、磷酸鹽系和硼酸鹽系[16]，硅酸鹽系根據(jù)硅含量差異又可分為45S5 BGs、S53P4 BGs和58S BGs等多種類型，不同類型BGs的抗菌能力有一定差異。BGs對多種細菌有快速殺菌效果，不僅可作用于常見的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等，也可作用于口腔內(nèi)的部分重要致病菌。

45S5 BGs是Hench等[17]首次發(fā)現(xiàn)的組成為45.0% SiO2、24.5% Na2O、24.5% CaO、6.0% P2O5的四元結(jié)構(gòu)的BGs，國內(nèi)外對45S5 BGs的抗菌效果也有廣泛的研究和討論。Allan等[18]將血鏈球菌、變形鏈球菌和黏性放線菌這三種齦上細菌分別加入3種不同的培養(yǎng)基，并暴露于BGs顆粒，1 h后殺菌率>65%；對牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、中間普氏菌和伴放線聚集桿菌這四種齦下細菌進行處理也得到類似結(jié)果。許玉婷等[19]測定了45S5 BGs對血鏈球菌、變形鏈球菌和黏性放線菌3種常見齦上菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)，分析得45S5 BGs對3種細菌的抑制能力順序為：黏性放線菌>變形鏈球菌>血鏈球菌；殺菌能力順序為：變形鏈球菌>血鏈球菌>黏性放線菌，由此可見，相比于其他兩種齦上菌，血鏈球菌對45S5 BGs不夠敏感，但有研究表明45S5 BGs可明顯降低血鏈球菌生物膜的活力[20]。

S53P4 BGs(53% SiO2、23% Na2O、20% CaO、4% P2O5)被認為是BGs中抗菌能力最強的一類，對多重耐藥菌株也有很大的抗菌潛力[21]，在耐藥菌橫行的當下有極佳的臨床應(yīng)用前景。S53P4 BGs糊劑對口腔齦上及齦下菌斑有廣譜抗菌作用，可使內(nèi)氏放線菌在暴露后10 min內(nèi)失去活性，伴放線聚集桿菌、牙齦卟啉單胞菌和變形鏈球菌在60 min內(nèi)喪失活力，血鏈球菌在60 min內(nèi)活性顯著降低[22]。

58S BGs(58% SiO2、33% CaO、9% P2O5)抗菌性較其他幾類BGs弱[23]。但在評估58S、63S、72S BGs納米粉末的抗菌效果時，58S BGs作用相對較強，對銅綠假單胞菌、大腸桿菌混合金黃色葡萄球菌的MBC分別為100 mg/mL和50 mg/mL，63S BGs的MBC為100 mg/mL，而72S BGs未表現(xiàn)出抗菌作用，當濃度低于50 mg/mL時，三者都沒有顯示出抗菌性[20]。表1總結(jié)了幾種BGs的抗菌效果。

表1 不同類型BGs的抗菌效果Tab.1 Antibacterial effect of different kinds of BGs

由于BGs具有上述抗菌作用，具有作為口腔抑菌劑的良好前景，因此，對BGs抗菌機制及其抗菌效果的影響因素的研究也顯得更有意義。

3 BGs的抗菌機制

目前公認的BGs抗菌機制主要是形成針狀玻璃碎片、釋放離子增加溶液pH值、增加滲透壓三大方面，其余還有：擾亂細菌膜電位、活性氧(reactive oxygen species，ROS)的作用、抗生物膜活性、Ca/P沉積、作為載體摻入抗菌劑等。

3.1 形成針狀玻璃碎片

細菌可以通過靜電作用黏附在BGs表面[24]，繼而BGs的針狀玻璃碎片可破壞細菌的細胞壁，致細胞內(nèi)容物流出，細菌死亡。

Hu等[20]在鏡下觀察到細菌大部分附著在BGs表面，黏附的細菌數(shù)量與BGs濃度成正比，這表明BGs具有細菌黏附性且黏附具有濃度依賴性。在透射電子顯微鏡下可見，BGs表面和靠近細胞的區(qū)域有大量針狀碎片，能夠刺破細菌的細胞壁，使細菌失去完整的結(jié)構(gòu)，此時膜電位也可能發(fā)生改變[25]。這種BGs碎片質(zhì)地均勻，染色較深，極有可能是BGs在液體環(huán)境中釋放出的離子聚集形成的富硅層[24]，但其具體形成、成分等仍有待進一步研究。

另外有研究表明，BGs的部分碎片可以在不破壞細菌的細胞膜的情況下直接進入細胞體內(nèi)與胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，細胞質(zhì)出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，這可能也是導(dǎo)致其抗菌的原因之一[24]。

相對于BGs，臨床常用的抗生素作用機制主要分為干擾蛋白質(zhì)合成、抑制細胞壁合成、影響細胞膜的通透性和抑制核酸轉(zhuǎn)錄復(fù)制這幾方面[26]，細菌對于抗生素的耐藥性可通過降低細胞膜通透性、增強抗生素滅活酶和藥物外排泵的表達、形成生物膜、抗性基因水平轉(zhuǎn)移或突變使抗生素吸收減少或靶點改變等方式產(chǎn)生[27]。而BGs可通過機械損傷細菌細胞膜產(chǎn)生抗菌作用，因此不易產(chǎn)生耐藥性。

3.2 增加溶液的pH值

BGs在液體環(huán)境中釋放Na+、Ca2+等離子，與周圍的H+或H3O+發(fā)生交換，增加pH值[28-30]。堿性環(huán)境可以減少體內(nèi)細菌在表面的定植[18]。當pH值增加時，細胞膜中的磷脂或不飽和脂肪酸受損，破壞了膜的完整性破壞以及蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，膜蛋白變性使膜pH梯度發(fā)生變化，細胞內(nèi)外的酶喪失生物活性，細胞代謝減弱；堿性溶液中的氫氧根離子能與細菌DNA發(fā)生反應(yīng)，使基因丟失，抑制DNA復(fù)制，引起基因致死性突變[31-32]。

BGs也可能通過增加溶液的pH值，改變部分細菌的超微結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄水平從而發(fā)揮其抗菌作用。糞腸球菌在堿性環(huán)境下生存的生化機制的實驗中，可見其Na+-K+-ATPase活性、細胞表面疏水性和生物膜形成增加，且此時大部分的基因轉(zhuǎn)錄水平隨pH值的提高呈倍數(shù)增長，如與ATP酶活性相關(guān)的atpb、atpE；與糞腸球菌在堿性環(huán)境下形態(tài)的適應(yīng)性改變有關(guān)的salB、FtsZ；與細菌黏附有關(guān)并參與生物膜形成的efa、ace、gelE、esp等[33]。這些基因?qū)A性環(huán)境下糞腸球菌的存活和生物膜形成有重要貢獻，有助于更好地理解糞腸球菌的致病機制，優(yōu)化BGs的抗菌效果。當溶液的pH值增加時，糞腸球菌的上述基因表達率增加，有利于其適應(yīng)堿性環(huán)境，因此糞腸球菌對BGs的抵抗力較強；而當pH超過11時，編碼與抑制ATP酶活性有關(guān)蛋白的atpE等大幅度增加，對糞腸球菌幾乎具有致死效應(yīng)。

3.3 增加滲透壓

BGs釋放出Na+、Ca2+、Si4+等可以提高環(huán)境的滲透壓[29]，使細胞內(nèi)容物流出，從而導(dǎo)致細菌死亡[30]，這一過程與pH值的增加幾乎同時發(fā)生。

通常情況下，細胞內(nèi)的離子濃度高于周邊環(huán)境，從而對細胞膜產(chǎn)生正壓。BGs釋放出的離子可使環(huán)境中的離子濃度升高，根據(jù)滲透壓計算公式Π=RTC(Π代表滲透壓，R指氣體常數(shù)，T指絕對溫度，C是液體中的分子與離子濃度)，隨著離子濃度的升高，滲透壓也顯著上升，使細胞內(nèi)外壓力差減小，細胞膜上壓力下降，細菌細胞內(nèi)水分流失，大小、形狀、膜應(yīng)力水平等均發(fā)生變化，產(chǎn)生抗菌效果[34]。如Drago等[21]將多重耐藥菌株(multiple drug resistant strain, MDR)與400 mg/mL的S53P4 BGs接觸2 h，在掃描電鏡下可見細菌收縮和胞膜結(jié)構(gòu)扭曲，與未經(jīng)處理的細菌相比，大小差異較大，這可能是細菌對BGs引起的高滲環(huán)境的反應(yīng)。

3.4 ROS的作用

ROS在抗菌和細菌耐藥方面發(fā)揮重要作用，有文獻表明BGs的抗菌機制與ROS的產(chǎn)生密切相關(guān)[29]。

ROS是氧的單電子還原產(chǎn)物，細菌有氧呼吸會產(chǎn)生一部分ROS[35]，同時生成超氧化物歧化酶等中和、抵御之前的ROS。BGs組成體系中含有SiO2，可通過在應(yīng)變表面打開Si—O—SiO三元環(huán)誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生ROS膜蛋白并擾亂細胞膜電位[36-37]，并進入細胞內(nèi)與酶、代謝和遺傳物質(zhì)等反應(yīng)[38]，當ROS產(chǎn)生過多，超出抗氧化酶系的負荷能力時，細菌產(chǎn)生較大的氧化應(yīng)激壞死[39]。Tsamesidis等[40]研究溶膠—凝膠法制得的生物活性玻璃陶瓷(bioactive glass ceramic，BGC)對紅細胞的毒性時，用熒光分析法檢測到所有BGC在濃度為0.125～0.500 g/L、37 ℃的環(huán)境下4 h后都會使ROS的生成增加，而增加的ROS也許是其抗菌的機制之一。ROS會對紅細胞造成一定傷害，但BGC對紅細胞的毒性具有濃度依賴性，在一定限度內(nèi)，BGC能增加紅細胞內(nèi)的谷胱甘肽以對抗這種損傷。

3.5 擾亂細菌膜電位

BGs釋放出的高濃度Ca2+可能會引起細菌膜電位的擾動或攻擊細胞膜上的某些靶點，使細胞內(nèi)容物流出，抑制細菌各種生理活動，這也可能是BGs的抗菌機制之一[30,34]。

膜電位是指細胞膜內(nèi)外兩側(cè)的電位差，是由于細菌胞膜兩側(cè)離子分布不均以及不同離子順各自電化學(xué)梯度擴散而形成的，對許多功能性膜蛋白具有調(diào)節(jié)作用，與ATP的合成、細胞增殖和分裂、細胞代謝、信號傳導(dǎo)等生理活動有密切聯(lián)系[41]。BGs在液體中釋放的高濃度離子使細菌細胞膜兩側(cè)的電化學(xué)梯度發(fā)生變化[42]并對細胞膜施加一定壓力，通道蛋白打開以減輕壓力防止細胞裂解，細胞內(nèi)的K+、Ca2+等順濃度梯度被動流出[43]，膜電位改變，三磷酸腺苷酶(ATPase)、呼吸鏈脫氫酶等的活性降低，導(dǎo)致ATP合成減少，細胞的代謝活動受到抑制[42]。

3.6 Ca/P沉積

Zehnder等[44]用S53P4 BGs懸浮液處理被糞腸球菌定植的離體前磨牙根管，10 d后在掃描電鏡下觀察到S53P4 BGs均勻地黏附在根管內(nèi)壁上，且細菌表面呈現(xiàn)出鈣化外觀，排除其他因素后可推測BGs的抗菌作用可能與細菌表面鈣化有一定相關(guān)性。細菌表面的沉積物可能對細胞膜造成不規(guī)則的損傷或?qū)毎植渴┘虞^大的壓力，導(dǎo)致細胞壞死[45]。

3.7 作為載體釋放抗菌離子

BGs不僅本身可以釋放出離子發(fā)揮作用，也可作為載體摻入Ag+、Cu2+、Zn2+、Li+等金屬離子[46]，此時被稱為介孔生物活性玻璃(mesoporous bioactive glass, MBG)。MBG是在生物活性玻璃和二氧化硅(MS)基礎(chǔ)上研制的新型材料，其內(nèi)部存在大量的納米級孔道，因此具有更大的比表面積、更好的生物相容性及生物活性[47]。MBG因有序的介孔通道結(jié)構(gòu)、較大的表面積和體積、較高的孔隙率作為釋放抗菌劑的載體而備受關(guān)注[46]。

MBG負載的金屬離子主要是通過破壞細菌的細胞壁和細胞膜、使細菌產(chǎn)生過多的ROS發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)等幾種主要機制來達到持久的抗菌效果。例如常見的Ag+主要是通過和細菌細胞壁的—SH相互作用，停止呼吸鏈電子轉(zhuǎn)移，使呼吸鏈的關(guān)鍵酶(如琥珀酸脫氫酶)失活，或者抑制細菌細胞壁蛋白質(zhì)以及細菌DNA、RNA的合成和其他代謝途徑，最終導(dǎo)致細胞死亡[20]。

當MBG作為載體時，緩釋時間延長且釋放率高，是骨科抗感染的重要材料之一[48]。但由于高濃度的金屬離子會產(chǎn)生一定的細胞毒性[16]，因此需要維持抗菌性能與生物相容性的平衡。

4 BGs抗菌作用影響因素

不同的BGs由于發(fā)揮作用的環(huán)境和條件不同，對不同細菌的抗菌效果也有很大差異，基于BGs的作用機制，它的生物活性主要受到玻璃組成、結(jié)構(gòu)與釋放出的離子濃度的影響[17]。

4.1 BGs自身因素

BGs的組成與結(jié)構(gòu)：BGs按組成成分劃分為硅酸鹽系、磷酸鹽系和硼酸鹽系BGs，硼酸鹽可抑制細菌蛋白質(zhì)的合成，因此比一般的硅酸鹽系BGs抵抗大腸桿菌的作用更強[49]；硅酸鹽系BGs按二氧化硅含量不同劃分的45S5 BGs、S53P4 BGs、58S BGs等BGs中，S53P4 BGs目前被認為抗菌效果最強。Munukka等[29]通過比較6種不同的BGs和2種溶膠-凝膠衍生的材料對29種典型需氧菌的殺菌作用，發(fā)現(xiàn)這幾種材料中，抵抗力最強的糞腸球菌僅在暴露于S53P4 BGs時完全失去生存能力，S53P4 BGs甚至還可以殺死多種耐藥菌。

BGs的濃度：BGs的抗菌能力與濃度成正比，較低濃度的BGs在液體環(huán)境下也可抑菌和殺菌，隨著BGs濃度增加，pH值升高速度加快，抗菌效果更好。Hu等[28]將不同含量的45S5 BGs加入到1 mL細菌懸浮液中，比較他們對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌作用，發(fā)現(xiàn)隨著BGs濃度的增加，溶液的pH值也隨之增加，抗菌作用增強，超過50 mg/mL的BGs可擁有98%以上的殺菌率，該研究證實濃度對BGs抗菌效果的影響，也表明了BGs的有效抗菌濃度，在后續(xù)的BGs抗菌效果測定中被廣泛應(yīng)用。此外，許玉婷等[19]用不同濃度的BGs處理24 h血鏈球菌菌斑和48 h混合菌斑10 min后，在場發(fā)射掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡下均可見菌斑中的細菌數(shù)目、菌斑密度和厚度隨著BGs濃度的增加而減少。

BGs的材料學(xué)：BGs的物理性質(zhì)如粗糙度、孔隙率和顆粒尺寸等可通過改變細菌黏附和比表面積等影響材料的抗菌性能[20]。粗糙度增加，BGs表面黏附的細菌增多[50]，溶液中BGs顆粒周圍較高的pH值或針狀玻璃碎片更容易作用于細菌；此外，粗糙度、孔隙率增加與顆粒尺寸降低都能使比表面積增大，擴大BGs與液體環(huán)境的接觸面積，離子擴散速度增加，局部pH和滲透壓增大，抗菌效果更好[30]。

4.2 細菌因素

4.2.1 浮游細菌與生物膜細菌 生物膜主要包括內(nèi)部的菌體和位于外周的自身分泌的胞外基質(zhì)等物質(zhì)，可吸附于物體表面[51]，它的形成有利于細菌的生長，抵抗外界的藥物，造成長期感染[33]，BGs對浮游細菌的抗菌效果明顯優(yōu)于菌斑生物膜[52]。王夢婷等[52]用不同濃度的BGs處理血鏈球菌、具核梭桿菌、伴放線聚集桿菌這3種浮游細菌及其形成的單菌種菌斑和混合菌斑，結(jié)果得出BGs對菌斑的最小菌斑清除濃度明顯大于對浮游細菌的MIC和MBC，這也許是因為生物膜的多糖基質(zhì)可以充當物理屏障減緩抗菌劑進入菌斑內(nèi)部[30]。

4.2.2 革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌 相對于革蘭氏陽性菌，BGs對革蘭氏陰性菌的抗菌效果更好，這可能是兩種細菌之間細胞壁成分的差異導(dǎo)致的[28]。肽聚糖是革蘭氏陽性菌細胞壁的主要成分，革蘭氏陰性菌的細胞壁主要由磷脂、脂多糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，有一層外膜。有報道顯示，納米顆粒對大腸桿菌的損傷主要發(fā)生在外膜，因此革蘭氏陰性菌對BGs有更高的敏感性可能是外膜損傷導(dǎo)致周質(zhì)滲漏的原因[53]。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，BGs對口腔中常見的致病菌有抑菌和殺菌效果，并且因為BGs作用的機制是通過細胞損傷來破壞微生物，不會產(chǎn)生耐藥性，所以作為口腔抑菌劑有強大的臨床應(yīng)用前景。

目前人們對BGs抗菌機制的研究多集中在相對宏觀的層面，對于BGs是否影響了口腔致病菌基因改變的實驗較少。此外，也有研究表明pH值升高并非BGs發(fā)揮抗菌作用的主要原因[54]，且由于人體緩沖系統(tǒng)的存在，BGs抗菌作用的研究也難以在體內(nèi)完成，目前主要以體外實驗為主，因此需要加強和拓展BGs對細菌基因的作用和抗菌效應(yīng)的體內(nèi)實驗研究，使BGs抑菌抗菌機制的研究更加深入透徹，也為BGs在臨床上得到有效的應(yīng)用奠定更強的理論基礎(chǔ)。