李建梅，孫靜宜，馬英橋，趙 月，李建柱

miRNAs是一類長(zhǎng)度約為18．25個(gè)堿基的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可降解mRNA并抑制翻譯，主要通過與其靶mRNA的3' 端結(jié)合從而達(dá)到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的目的[1]。miRNAs可參與細(xì)胞增殖、凋亡、代謝等生物學(xué)過程，在腫瘤等多種疾病中表達(dá)失調(diào)[2]。miRNAs也是乳腺癌的重要調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)改變與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)[3]。有趣的是，miR-328還被發(fā)現(xiàn)在RB143人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞分離出的ABCG2+(干細(xì)胞樣)中水平比ABCG2-(非干樣)中低，而miR-328在乳腺癌干細(xì)胞中的作用依然未知[4-5]。本研究旨在分析miR-328-5p在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及上調(diào)miR-328-5p表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系 乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231及正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF10A均購于美國ATCC細(xì)胞庫。

1.2主要試劑與儀器 胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)購自上海碧云天公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司，Transwell小室(批號(hào)：845116)購自吳江康寧生命科學(xué)有限公司，Matri-gel基質(zhì)膠及細(xì)胞培養(yǎng)基均購自美國BD公司，miR-328-5p和miR-con(批號(hào)：121547)均購自上海美軒生物科技有限公司。PCR儀(Applied Biosystems ABI7500)，化學(xué)發(fā)光儀(Promega 30IOC)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad ChemiDoc XRS)，透射電鏡(Thermo fisher Spectra S/TEM)，熒光顯微鏡(Olympus BX53)，光學(xué)顯微鏡(Olympus CX33)，相差顯微鏡(Olympus CKX53)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)及制備：乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231及正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF10A均于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加入雙抗霉素-鏈霉素，然后置于恒溫箱中恒溫培養(yǎng)，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染：選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的乳腺癌細(xì)胞，分為3組：miR-328-5p組(進(jìn)行miR-328-5p轉(zhuǎn)染)、轉(zhuǎn)染對(duì)照組(轉(zhuǎn)染miR-con)及空白對(duì)照組。按照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3miR-328-5p表達(dá)檢測(cè)：采用qPCR[6]檢測(cè)miR-328-5p RNA水平。使用miRNA提取試劑盒從細(xì)胞中提取RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT Reagent Kit和SYBR Prime Script miRNA RT-PCR Kit試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR。miR-328-5p反應(yīng)體系為，95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火32 s，循環(huán)50次。通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)自動(dòng)分析各樣本Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4細(xì)胞增殖：采用CCK-8實(shí)驗(yàn)[7]及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)[8]檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。以3000個(gè)細(xì)胞/孔(調(diào)整細(xì)胞濃度為100 pl含3000個(gè)細(xì)胞)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞鋪于96孔板中，并進(jìn)行轉(zhuǎn)染培養(yǎng)。每組重復(fù)3次，培養(yǎng)48 h，加入CCK-8試劑10 μl，室溫孵育4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(OD450)。以適當(dāng)細(xì)胞密度將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞鋪于細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染分組培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后將平皿倒扣于帶網(wǎng)格的膠片上，計(jì)數(shù)克隆數(shù)，將>50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)拍照記錄保存。最后計(jì)算克隆形成率，克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.3.5細(xì)胞遷移：采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)[9]檢測(cè)細(xì)胞遷移情況。同“1.2.4”項(xiàng)下進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染分組后，用胰酶消化細(xì)胞，離心后通過無血清基礎(chǔ)的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)后稀釋，稀釋成4×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，取100 μl鋪于Transwell上室，下室加入600 μl含血清完全培養(yǎng)基。均培養(yǎng)24 h后，采用4%多聚甲醛固定15 min，將上室未遷移的細(xì)菌擦拭干凈，結(jié)晶紫染色，記錄細(xì)胞遷移數(shù)。

1.3.6細(xì)胞侵襲：行Transwell體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)[10]，拍照計(jì)算細(xì)胞侵襲數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)6個(gè)復(fù)孔。

1.4研究方法 觀察不同乳腺癌細(xì)胞系中miR-328-5p相對(duì)表達(dá)量及上調(diào)miR-328-5p表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響。

2 結(jié)果

2.1不同細(xì)胞系中miR-328-5p相對(duì)表達(dá)量比較 正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF10A、乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中miR-328-5p相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.02、0.42±0.07、0.48±0.06，miR-328-5p相對(duì)表達(dá)量正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF10A>乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231>乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(P<0.05)。

2.2上調(diào)miR-328-5p表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖能力的影響 與轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，miR-328-5p組MCF-7細(xì)胞增殖率、克隆形成率均明顯降低(P<0.05)，轉(zhuǎn)染對(duì)照組與空白對(duì)照組MCF-7細(xì)胞增殖率、克隆形成率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 上調(diào)miR-328-5p表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖能力的影響

2.3上調(diào)miR-328-5p表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響 與轉(zhuǎn)染對(duì)照組、空白對(duì)照組比較，miR-328-5p組MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲能力均明顯降低(P<0.05)，轉(zhuǎn)染對(duì)照組與空白對(duì)照組MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲能力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 上調(diào)miR-328-5p表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響個(gè))

3 討論

乳腺癌是一種發(fā)生于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，是全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[11]。目前根據(jù)相關(guān)調(diào)查資料顯示：不良生活習(xí)慣、高強(qiáng)度工作、快節(jié)奏生活及精神壓力等多種因素均與乳腺癌發(fā)病進(jìn)展有著密切聯(lián)系，其發(fā)病率逐漸升高[12]。手術(shù)為乳腺癌治療的首選方案，隨著對(duì)乳腺癌認(rèn)知的增加、醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，乳腺癌的治療取得了階段性的進(jìn)展，但關(guān)于其具體發(fā)病機(jī)制仍舊尚未明確，故探索新的分子靶點(diǎn)對(duì)治療乳腺癌及改善其預(yù)后至為關(guān)鍵[13-14]。近年研究表明，miRNAs在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及惡性轉(zhuǎn)化過程中起重要作用[15]。為進(jìn)一步探討miR-328-5p與乳腺癌發(fā)病、惡化之間的關(guān)系，本文以乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231及正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF10A為標(biāo)本進(jìn)行研究。

既往多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤進(jìn)展中，長(zhǎng)鏈非編碼RNA或環(huán)狀RNA通過調(diào)控miR-328-5p表達(dá)起關(guān)鍵作用，故檢測(cè)miR-328-5p表達(dá)有望成為評(píng)估多種惡性腫瘤的有效手段[16-17]。MCF-7細(xì)胞與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果示，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231中miR-328-5p相對(duì)表達(dá)量均顯著低于正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF10A，提示miR-328-5p表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生有著密切聯(lián)系。既往報(bào)道，miR-328-5p作用于乳腺癌并抑制MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞增殖的主要機(jī)制為靶向糖基化終產(chǎn)物受體[18]。本文經(jīng)CCK-8、平板克隆實(shí)驗(yàn)得出，上調(diào)miR-328-5p的乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、克隆形成能力均顯著降低。另也有文獻(xiàn)證實(shí)：circRNA-5692可通過刺激miR-328-5p增強(qiáng)殘疾基因同源物2相互作用蛋白表達(dá)從而抑制肝癌的進(jìn)展，長(zhǎng)鏈非編碼RNA TPTEP1競(jìng)爭(zhēng)性抑制miR-328-5p從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖[19-20]。除此之外，本文通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)得出，上調(diào)miR-328-5p對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的遷移、侵襲能力有明顯抑制作用，從而控制延緩乳腺癌病情的進(jìn)展。推測(cè)miR-328-5p對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的抑制作用可能與PI3K/AKT通路的激活調(diào)節(jié)有關(guān)。

綜上，miR-328-5p在乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，上調(diào)miR-328-5p表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力和減弱遷移、侵襲能力，可能成為乳腺癌臨床診斷、評(píng)估及治療的新靶點(diǎn)。