郭成偉,郝 永，張小燕，金正印，崔現(xiàn)成，王紅素，張寶華，吳清華，顏林軍

肝缺血再灌注損傷(IRI)是肝臟外科手術(shù)需要預(yù)防的病理生理過程。目前研究認(rèn)為肝IRI分為早期(急性期)和晚期(亞急性期)兩個(gè)階段[1-2]。多數(shù)研究將IRI后2 h或6 h內(nèi)界定為早期、12～48 h界定為晚期階段，筆者已經(jīng)在前期研究證實(shí)彌散張量成像(DTI)對兔急性肝IRI具有較好診斷價(jià)值[3]，本研究旨在研究磁共振DTI對兔肝IRI后晚期階段成像參數(shù)的變化特點(diǎn)，并與臨床常采用評價(jià)肝損傷程度的生化指標(biāo)、炎性因子，以及病理形態(tài)學(xué)積分行多元相關(guān)性分析，以了解平均擴(kuò)散系數(shù)(DCavg)和各向異性系數(shù)(FA)對肝IRI的評估價(jià)值。

1 材料與方法

1.1肝IRI模型制備及分組 肝IRI模型制作：24只新西蘭大白兔[由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(SCXK2016-0015)]，普通飼養(yǎng)，3～4月齡，體質(zhì)量2.0～3.0 kg，分為IRI組(18只)與假手術(shù)組(6只)。IRI組給予苯巴比妥鈉1 ml/kg耳緣靜脈麻醉，中上腹部剪毛、清潔、消毒，腹部正中切口8～10 cm，采用3號手術(shù)線活結(jié)夾閉肝左葉動脈、門靜脈，為保證肝IRI成功率、保留肝右葉血供，60 min后，松開手術(shù)活結(jié)、恢復(fù)肝左葉血供，關(guān)閉腹腔。依據(jù)血供時(shí)間分為12 h、24 h與48 h組，每組6只。假手術(shù)組打開腹腔、暴露肝門，不阻斷肝血供，解剖肝十二指腸韌帶。手術(shù)過程中，注意保暖，術(shù)后置于兔專門飼養(yǎng)室，并適當(dāng)補(bǔ)液。

1.2MR掃描及參數(shù) 設(shè)備GE Signa HDxt 3.0T掃描儀，體位：仰臥位，線圈：8通道膝部線圈，靜脈麻醉后，用兔實(shí)驗(yàn)專用腹帶以減輕呼吸運(yùn)動偽影。MRI-DTI掃描參數(shù)：TR/TE 2200/50.3 ms,激勵(lì)次數(shù)(NEX)4次，掃描視野(FOV)20 cm×20 cm，Phase FOV 0.75，矩陣196×128，層厚3 mm。梯度因子b=100、300、600 s/mm2(6個(gè)方向)，掃描時(shí)間：106 s。

1.3MR圖像分析 應(yīng)用GE AW4.6 FuncTool Performance，對原始圖像首先應(yīng)用Correction進(jìn)行圖像校正，后重建出FA、DCavg圖。后設(shè)定感興趣區(qū)(ROI)：15 mm2。在不知實(shí)驗(yàn)分組的前提下，具有5～10年工作經(jīng)驗(yàn)的臨床影像學(xué)診斷醫(yī)師2名，分別對DTI圖像采用雙盲法獨(dú)立閱片、分析、測量、分析數(shù)據(jù)2次；在肝損傷區(qū)域、邊緣部分及未發(fā)生明顯損傷的區(qū)域，測量連續(xù)三個(gè)層面DCavg及FA值，計(jì)算均值。

1.4生化、炎性因子水平測定及病理組織學(xué)分析 MRI檢查結(jié)束后，各組實(shí)驗(yàn)兔經(jīng)下腔靜脈抽取靜脈血5 ml,置于37 ℃水浴箱中2 h，待血液凝固后以60 mm離心半徑、3500 r/min的速度4 ℃離心5 min，分離血清。血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平采用自動生化分析儀測定；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)采用ELISA測定，每組連續(xù)測量3次，取平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后、靜脈空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)兔摘取肝左葉，在10%甲醛溶液中固定，后逐級脫水、石蠟包埋，制成4 μm厚切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝IRI組織形態(tài)學(xué)，并參照文獻(xiàn)[4-5]進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)積分。

1.5觀察指標(biāo) ①磁共振DTI參數(shù)：DCavg和FA變化情況；②肝損傷評價(jià)指標(biāo)：ALT、AST、TNF-α水平及病理形態(tài)學(xué)積分。

2 結(jié)果

2.1兔血清AST、ALT、TNF-α水平及形態(tài)學(xué)積分 各IRI組血清ALT、AST、TNF-α水平及形態(tài)學(xué)積分均高于假手術(shù)組(P<0.05)。IRI 12 h ALT達(dá)峰值，IRI 24～48 h逐漸下降；AST在IRI后持續(xù)升高，48 h達(dá)峰值；TNF-α在IRI后24 h達(dá)峰值，后開始下降。IRI 12 h組ALT均高于IRI 24 h和48 h組,AST和形態(tài)學(xué)積分均低于IRI 24 h和48 h組(P<0.05)；IRI 12 h組TNF-α低于IRI 24 h組，高于IRI 48 h組，且IRI 24 h組高于IRI 48 h組(P<0.05)。見表1。

表1 4組兔血清ALT、AST、TNF-α水平及形態(tài)學(xué)積分比較

2.2病理組織評分與AST、ALT、TNF-α相關(guān)性分析 鏡下各組病理形態(tài)學(xué)積分與AST、ALT及TNF-α均存在高度正相關(guān)(r=0.72、0.91、0.80,P<0.01)。

2.3肝IRI各組DCavg、FA變化情況 DCavg在肝IRI 12～24 h均呈下降趨勢。b=100 s/mm2時(shí)，IRI 24 h組DCavg低于假手術(shù)組，IRI 48 h組高于IRI 12、24 h組(P<0.05)；b=300 s/mm2時(shí)，IRI 48 h組DCavg高于假手術(shù)組及IRI 12 h、24 h組(P<0.05)；b=600 s/mm2，IRI 48 h組DCavg高于假手術(shù)組和IRI 24 h組(P<0.05)。隨著肝IRI損傷加重，F(xiàn)A在肝缺血再灌注損傷后12～48 h呈逐漸下降趨勢。b=300、600 s/mm2時(shí),IRI 24 h組FA低于假手術(shù)組(P<0.05),b=100、300、600 s/mm2時(shí)，IRI 48 h組FA低于假手術(shù)組及IRI 12 h、24 h組(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 4組不同b值時(shí)DCavg及FA值比較

圖1 兔肝缺血再灌注損傷24 h組磁共振彌散張量成像(b=300 s/mm2)1a.壞死組織表現(xiàn)為高信號;1b.平均擴(kuò)散系數(shù)較正常組織明顯升高(ROI 1～2 vs ROI 3～4)；1c.各向異性系數(shù)呈相反的變化趨勢；ROI為感興趣區(qū)

2.4MRI-DTI參數(shù)與肝損傷指標(biāo)相關(guān)性多元線性回歸分析 將DCavg、FA作為因變量，AST、ALT、TNF-α及病理形態(tài)學(xué)積分作為自變量行多元線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)篩選P為0.05～0.10，將不顯著的變量DCavg(b=100、600 s/mm2)排除。DCavg(b=300 s/mm2)、FA(b=100、300、600 s/mm2)與病理形態(tài)學(xué)積分、AST、ALT、TNF-α存在較好的相關(guān)性(P<0.01)。見表3。

表3 病理形態(tài)學(xué)積分、AST、ALT、TNF-α與DCavg、FA相關(guān)性的多元線性回歸分析

3 討論

磁共振DTI是依據(jù)組織內(nèi)水分子的三維彌散特性來探測生物體微觀結(jié)構(gòu)的一種功能成像方法，較彌散加權(quán)成像(DWI)，其更主要反映出水分子對方向的依賴性，即各向異性彌散[6-7]：生物體內(nèi)水分子各方向的彌散強(qiáng)度大小不一致，與生物體微結(jié)構(gòu)走行平行方向上彌散最強(qiáng)，而與其方向垂直彌散能力最弱，基于這種生物體內(nèi)微觀組織結(jié)構(gòu)的不同影響水分子自由彌散的方向和速率，F(xiàn)A和DCavg是客觀評價(jià)參數(shù)：FA(0～1)反映水分子運(yùn)動的方向性，水分子運(yùn)動的方向越一致，F(xiàn)A值越大；DCavg是所有方向上表面擴(kuò)散系數(shù)(ADC)平均值，較DWI-ADC更加精確描述分子各個(gè)方向擴(kuò)散能力，DCavg值越高表示該處水分子的運(yùn)動能力越強(qiáng)，否則表示水分子的運(yùn)動受限[8]。因而DTI成像時(shí)間較DWI延長，對磁場不均勻性更為敏感，其有利之處是對肝內(nèi)微小病灶更易檢查，但對DTI圖像質(zhì)量控制帶來困難。DTI作為臨床一種非創(chuàng)性的早期檢測大腦缺血、腦損傷、腦腫瘤鑒別等的敏感方法[9-11]，F(xiàn)A值與神經(jīng)纖維、髓鞘的完整性、神經(jīng)纖維的致密性及平行性呈正相關(guān)。肝臟內(nèi)肝竇或纖維結(jié)構(gòu)具有方向性解剖特征，肝細(xì)胞外間隙空間大小或纖維結(jié)構(gòu)走行的方向決定肝竇間隙內(nèi)水分子彌散主軸方向和能力，肝竇或具有方向性纖維結(jié)構(gòu)的解剖特征是肝臟磁共振DTI基礎(chǔ)[12]。因此，肝細(xì)胞外間隙容積改變、肝膠原纖維排列或數(shù)量改變，對應(yīng)的FA值、DCavg隨之發(fā)生改變，因此，DTI成像在肝纖維化及肝臟局灶性病變中已廣泛應(yīng)用[13]。肝IRI后肝細(xì)胞彌漫性水腫會導(dǎo)致肝竇或細(xì)胞外間隙縮小、水分子方向性增高(FA增高)，而水分子運(yùn)動能力相應(yīng)下降(DCavg降低)，所以，DCavg、FA可作為臨床檢測肝IRI病理機(jī)制的一種影像評價(jià)方法。

有研究發(fā)現(xiàn)大鼠肝I/R后60 min，DCavg顯著下降、FA上升，而在I/R后24 h DCavg明顯上升、FA下降[14]，本研究與其結(jié)果存在差異。因此，對于DTI功能成像技術(shù)對肝IRI機(jī)制及診斷價(jià)值等方面的研究還需進(jìn)一步探索。

本研究結(jié)果顯示，在IRI后12～48 h，隨著微循環(huán)障礙的改善、動靜脈短路等血流動力學(xué)改變，DCavg、FA出現(xiàn)緩慢上升或下降，這與肝IRI早期(急性期1～6 h)因肝竇淤血、肝細(xì)胞腫脹等所致水分子在細(xì)胞膜內(nèi)外各個(gè)方向上的運(yùn)動能力下降(DCavg下降)，增加了水分子細(xì)胞外間隙運(yùn)動方向迂曲性致FA上升明顯不同[3,15]。在IRI后24 h，DCavg也出現(xiàn)與DWI-ADC類似的一過性下降現(xiàn)象[16]，但與DWI-ADC比較，其下降幅度減小，究其原因可能是 DCavg為各個(gè)方向上ADC的平均值，更趨向于穩(wěn)定，但DTI掃描時(shí)間較DWI明顯延長，對DTI圖像質(zhì)量控制需要更高的要求[17]。至于IRI 48 h組DCavg顯著上升，是由于肝細(xì)胞逐漸加重溶解壞死致水分子運(yùn)動彌散受限減低，但同時(shí)也存在著較ADC上升幅度較小的征象，其原因可能是二者成像機(jī)制的不同所致[3]。

本研究結(jié)果顯示，IRI 24、48 h組FA低于假手術(shù)組，分析原因，此階段病理基礎(chǔ)是隨著肝損傷的加重(鏡下組織形態(tài)學(xué)積分逐漸升高)，肝細(xì)胞的正常微觀結(jié)構(gòu)喪失，致維持其方向性的細(xì)胞網(wǎng)架結(jié)構(gòu)逐漸遭到破壞、溶解，從而使擴(kuò)散的各向異性減低。因此，F(xiàn)A下降是IRI后肝組織病理過程的體現(xiàn)，這對于評價(jià)IRI晚期階段肝組織損傷、壞死具有重要的意義。

在肝IRI病理過程中，隨著肝損傷、壞死的繼續(xù)加重，AST、ALT變化趨勢與鏡下組織學(xué)評價(jià)并不完全一致，本研究結(jié)果顯示，ALT在肝IRI后12～24 h維持峰值，隨后出現(xiàn)下降，與肝IRI繼續(xù)進(jìn)展的病情并不一致，肝轉(zhuǎn)氨酶的變化較大，其應(yīng)用價(jià)值也有所受限。而多元線性回歸分析可以分析變量間的相對作用大小，達(dá)到準(zhǔn)確的預(yù)后評估和定量診斷目的。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)A(b=100、300、600 s/mm2)與肝轉(zhuǎn)氨酶、炎性因子、病理學(xué)評分存在較好的線性相關(guān)，且FA較DCavg具有更高的診斷價(jià)值。從b值的選取來看，在b較小時(shí)(100 s/mm2)對肝IRI診斷價(jià)值較大，這與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致[15]。而采用更小的b值(50 s/mm2)可能增加T2投射效應(yīng)而降低其診斷價(jià)值；b值較大(600 s/mm2)時(shí)，可能由于肝TE時(shí)間較短，使DWI及DTI圖像質(zhì)量降低，影響ADC/DCavg準(zhǔn)確性。

綜上所述，肝IRI晚期階段(12～48 h)磁共振DTI能更好、客觀反映肝細(xì)胞的正常微觀結(jié)構(gòu)喪失，細(xì)胞網(wǎng)架結(jié)構(gòu)逐漸遭到破壞、溶解等微觀病理機(jī)制，且該方法具有檢查時(shí)間短、圖像分辨率高及對肝內(nèi)隱性微小病灶敏感，并能對肝組織的生理狀態(tài)(肝細(xì)胞生理活性和微循環(huán))進(jìn)行定量和定性評價(jià)，符合精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展要求，肝IRI實(shí)驗(yàn)研究可使更多患者受益。