高冬梅，宋雪晶，安 杰，王永欣，范 婧，劉靜普

2021年國家癌癥中心發(fā)布最新全國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果表明，2020年肺癌的發(fā)病率及病死率均占第一位，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占80%左右。近年來隨著分子靶向治療逐步應(yīng)用于臨床，使得具有敏感基因突變的晚期NSCLC生存期有了明顯改善。分子靶向治療已經(jīng)成為具有敏感基因突變NSCLC患者的主要治療手段。目前研究表明，針對表皮生長因子受體(EGFR)突變陽性的NSCLC，應(yīng)用分子靶向藥物表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)治療均較傳統(tǒng)化療顯著延長了無進(jìn)展生存期(PFS)和總生存期[1-6]，EGFR-TKIs已經(jīng)成為國際上公認(rèn)的EGFR敏感突變陽性NSCLC一線治療方案。EGFR-TKIs耐藥問題已成為目前分子靶向治療過程中亟待解決的問題，其耐藥機(jī)制仍未完全明確。小凹蛋白-1(Cav-1)是細(xì)胞膜上Caveolae的重要組成蛋白，其通過與EGFR結(jié)合參與細(xì)胞增殖、分化過程[7-9]。已有研究表明，腫瘤細(xì)胞對EGFR-TKIs治療的敏感性不同，其Cav-1的表達(dá)也不同[10]。因此，推測Cav-1表達(dá)與腫瘤細(xì)胞對EGFR-TKIs耐藥相關(guān)。本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測具有EGFR敏感突變的NSCLC患者吉非替尼耐藥前后肺癌組織中Cav-1表達(dá)情況，利用具有EGFR敏感突變NSCLC細(xì)胞株P(guān)C-9，采用Western blot法驗(yàn)證Cav-1過表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，采用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測吉非替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株遷移的影響，并采用Western blot法檢測不同Cav-1表達(dá)情況下EGFR、ERK及AKT激酶磷酸化水平，從而探討Cav-1表達(dá)與NSCLC對吉非替尼耐藥機(jī)制之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料及試劑 所有標(biāo)本為我院病理科2012—2019年組織穿刺標(biāo)本(肺組織或轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織)，經(jīng)基因檢測證明具有EGFR敏感突變確診為ⅢB期或Ⅳ期肺腺癌21例。均應(yīng)用吉非替尼治療獲益，其中男9例，女12例；中位發(fā)病年齡66歲；療效評價(jià)穩(wěn)定7例，部分緩解14例。中位耐藥時(shí)間10.3個(gè)月，無疾病進(jìn)展時(shí)間：最短為4個(gè)月，最長為23個(gè)月；同時(shí)收集耐藥后腫瘤組織穿刺標(biāo)本。所有組織切片均經(jīng)兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師雙盲重新閱片，確診為肺腺癌，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行Cav-1表達(dá)水平檢測。EGFR敏感突變的NSCLC細(xì)胞株P(guān)C-9(哥倫比亞大學(xué))，PC-9/Cav-1細(xì)胞和PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng))，胎牛血清(Hyclone)，吉非替尼(AstraZeneca)；兔抗EGF Receptor單克隆抗體，兔抗p-ERK 1/2多克隆抗體、兔抗p-AKT多克隆抗體(Cell Signaling)；兔抗Cav-1抗體、鼠抗Cav-1單克隆抗體、鼠抗β-actin抗體(Santa Cruz)；鼠抗磷酸化酪氨酸單克隆抗體(Millipore)；酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)(Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1資料收集：收集應(yīng)用吉非替尼耐藥病例，記錄其用藥時(shí)間與疾病進(jìn)展時(shí)間，計(jì)算PFS，統(tǒng)計(jì)PFS>9.5個(gè)月和≤9.5個(gè)月病例數(shù)。

1.2.2免疫組織化學(xué)法檢測：將NSCLC患者吉非替尼治療耐藥前后的組織切片，厚度3～5 μm；脫蠟至水；3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶(10 min)；EDTA高溫、高壓抗原修復(fù)；滴加鼠抗人Cav-1單克隆抗體(1∶200)；放入4 ℃冰箱過夜；滴加二抗，DAB顯色，蘇木素顯色，蓋玻片封片。用已知Cav-1表達(dá)陰性的正常肺組織作為陰性對照，用已知Cav-1表達(dá)陽性的肺癌組織作為陽性對照。光鏡下可見Cav-1在間質(zhì)和細(xì)胞膜著色。著色陽性表現(xiàn)為棕黃色或棕色，隨機(jī)選取觀察視野，計(jì)算陽性腫瘤細(xì)胞比例。陽性細(xì)胞數(shù)>25%定義為陽性，反之為陰性。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞凍存管從液氮中取出復(fù)蘇，放入恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4Western blot檢測Cav-1蛋白水平：處于對數(shù)生長期的PC-9、PC-9/Cav-1和PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞消化后，提取蛋白，酶標(biāo)儀檢測蛋白水平。將30 μg蛋白樣本等體積上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別置于兔抗Cav-1抗體(1∶4000)、鼠抗β-actin抗體(1∶5000)中，孵育過夜。洗滌，ECL顯色，在暗室曝光。用掃描儀掃描膠片，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5MTT法檢測細(xì)胞增殖能力：將對數(shù)生長期的PC-9/Cav-1及PC-9/pcDNA3.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，等濃度接種于96孔板，空白液為調(diào)0孔，均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h，加入含有不同濃度吉非替尼(0～2.56 μmol/L)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入MTS溶液20 μl，培養(yǎng)30 min。檢測吸光度值(波長490 nm)。計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，觀察吉非替尼半數(shù)抑制濃度(IC50)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株P(guān)C-9/Cav-1和PC-9/pcDNA3.1接種于24孔板，均設(shè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，垂直于孔底劃直線，用含或不含0.015 μmol/L吉非替尼的完全1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)18 h，每6小時(shí)拍照1次，計(jì)算遷移率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力：基質(zhì)膠鋪在小室底部，PC-9/Cav-1和PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞饑餓4 h。上室加入無胎牛血清、下室加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基。分別用2 ml無胎牛血清1640培養(yǎng)基及含0.015 μmol/L吉非替尼的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將等量的細(xì)胞加入上室，培養(yǎng)24 h。取出小室，常規(guī)HE染色，在200倍光鏡下拍照，選取5個(gè)視野，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8Western blot檢測信號通路蛋白磷酸化水平：將PC-9/Cav-1和PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞消化分為兩組接種在35 mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h后，PBS洗滌，加入濃度為0.04 μmol/L吉非替尼培養(yǎng)液，一組直接收集細(xì)胞，另一組培養(yǎng)4 h收集細(xì)胞，Western blot檢測相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1不同PFS患者癌組織Cav-1陽性率比較 本組PFS≤9.5個(gè)月9例，>9.5個(gè)月12例。PFS≤9.5個(gè)月患者癌組織Cav-1表達(dá)均為陽性；而>9.5個(gè)月患者Cav-1表達(dá)陽性7例(58.3%)；PFS≤9.5個(gè)月患者癌組織Cav-1表達(dá)陽性率高于>9.5個(gè)月患者(P<0.05)。

2.2不同PC-9細(xì)胞Cav-1蛋白表達(dá)水平比較 通過Western blot檢測，PC-9/Cav-1細(xì)胞Cav-1蛋白相對表達(dá)水平較PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞明顯增高(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同PC-9細(xì)胞Cav-1蛋白表達(dá)情況Cav-1為小凹蛋白-1；與PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞比較，①P<0.05

2.3Cav-1對不同濃度吉非替尼處理PC-9細(xì)胞增殖能力的影響 PC-9/Cav-1細(xì)胞的生長抑制率較PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞降低，PC-9/Cav-1細(xì)胞吉非替尼的IC50值為0.04±0.01明顯高于PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞的0.015±0.01(P<0.05)。見圖2。

圖2 Cav-1對不同濃度吉非替尼處理PC-9/Cav-1和PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞抑制率的影響Cav-1為小凹蛋白-1

2.4Cav-1對PC-9細(xì)胞遷移能力的影響 無吉非替尼培養(yǎng)基培養(yǎng)6、12、18 h，PC-9/Cav-1細(xì)胞遷移率分別為(20.10±0.01)%、(26.64±0.01)%、(50.00±0.00)%，PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞遷移率分別為(14.89±0.02)%、(22.44±0.01)%、(25.08±0.02)%，PC-9/Cav-1細(xì)胞遷移率分別高于PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞(P<0.05)。含0.015 μmol/L吉非替尼培養(yǎng)基培養(yǎng)6、12、18 h，PC-9/Cav-1細(xì)胞遷移率分別為(15.25±0.00)%、(20.44±0.02)%、(22.47±0.01)%，PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞遷移率分別為(5.61±0.01)%、(9.90±0.02)%、(12.10±0.00)%，PC-9/Cav-1細(xì)胞遷移率分別高于PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞(P<0.05)。見圖3。

圖3 Cav-1對PC-9/Cav-1和PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞遷移能力的影響(10×)Cav-1為小凹蛋白-1

2.5Cav-1對PC-9細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell法檢測顯示，PC-9/Cav-1細(xì)胞在無吉非替尼作用下穿膜細(xì)胞數(shù)為(93.00±11.68)個(gè)，多于PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞的(66.40±6.02)個(gè)(P<0.01)；PC-9/Cav-1細(xì)胞在0.015 μmol/L吉非替尼作用下穿膜細(xì)胞數(shù)為(56.20±4.87)個(gè)，多于PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞的(23.20±3.19)個(gè)(P<0.01)。見圖4。

圖4 Cav-1對PC-9/Cav-1和PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞侵襲能力的影響(HE×200)Cav-1為小凹蛋白-1

2.6吉非替尼對PC-9細(xì)胞信號通路蛋白磷酸化水平的影響 無或有吉非替尼培養(yǎng)基培養(yǎng)的PC-9/Cav-1細(xì)胞pY-EGFR、p-ERK、p-AKT表達(dá)水平均明顯高于PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞(P<0.01)。見圖5。

圖5 有或無吉非替尼培養(yǎng)基培養(yǎng)的PC-9/Cav-1和PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞信號通路蛋白磷酸化水平的影響EGFR為表皮生長因子受體，Cav-1為小凹蛋白-1

3 討論

針對晚期NSCLC，化療已進(jìn)入瓶頸期，雖然化療藥物不斷更新，在療效上也有所改善，但是中位PFS為6個(gè)月左右，1、2年生存率分別為30%、10%左右[10-11]。隨著對肺癌發(fā)病機(jī)制研究的逐步深入，針對基因敏感突變晚期NSCLC的靶向藥物逐步應(yīng)用于臨床，取得了良好療效。IPASS研究發(fā)現(xiàn)，EGFR突變作為目前已知肺癌驅(qū)動(dòng)基因，其突變率為19%～48%[12]。有研究證實(shí)，EGFR-TKIs客觀緩解率為60%～85%，PFS為8～13個(gè)月[13-16]，奠定了EGFR-TKIs在EGFR敏感突變陽性晚期NSCLC一線治療中的地位。FLAURA與ADAURA試驗(yàn)分別奠定了三代EGFR-TKIs在EGFR敏感突變陽性晚期NSCLC一線治療及術(shù)后輔助治療中的地位。然而，部分具有EGFR敏感突變患者仍存在EGFR-TKIs效果不佳、治療敏感性不一的情況，本研究認(rèn)為與患者同時(shí)存在其他蛋白間相互作用信號通路激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。

Cav-1為膜整合蛋白，N端氨基酸殘基為Cav-1的功能區(qū)，該區(qū)域與EGFR結(jié)合參與細(xì)胞代謝過程[7,9]。70%以上NSCLC患者的腫瘤細(xì)胞均有Cav-1表達(dá)，Cav-1高表達(dá)NSCLC患者的腫瘤細(xì)胞增殖及潛在轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[17]。MEIER等[18]通過破壞caveolae從而成功阻止PI3K的活化，并證明Cav-1通過影響EGFR信號通路蛋白磷酸化或去磷酸化等途徑調(diào)控信號傳導(dǎo)改變腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為[8]，參與PI3K/AKT信號通路激酶系統(tǒng)的信號傳導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制凋亡，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[17]。作為細(xì)胞膜的重要組成蛋白，在肺癌化療、放療耐藥后均存在Cav-1表達(dá)增加[19]，在紫杉醇耐藥的肺腺癌A549細(xì)胞中，敲低Cav-1能夠抑制AKT的磷酸化，而降低細(xì)胞增殖能力[8]。將肺癌H292細(xì)胞暴露于NO中會(huì)引起Cav-1、p-AKT過表達(dá)，導(dǎo)致肺癌H292細(xì)胞對阿霉素和依托泊苷耐藥，促進(jìn)細(xì)胞存活[20]。另有研究表明，Cav-1過表達(dá)導(dǎo)致A549和PC-9細(xì)胞對鉑類耐藥，抑制Cav-1/AKT/Bad信號通路，恢復(fù)耐藥A549和PC-9細(xì)胞株對順鉑的敏感性[21]。PHILIPS等[22]通過雷公藤甲素處理A549和H460 NSCLC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其能夠降低Cav-1表達(dá)，并通過AKT/Bax通路影響肺癌細(xì)胞。上述研究均說明Cav-1參與腫瘤信號傳導(dǎo)通路的激活，并與腫瘤的放化療耐藥相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在EGFR敏感突變NSCLC患者癌組織中Cav-1表達(dá)水平與療效相關(guān)，在吉非替尼治療過程中，疾病進(jìn)展較快的EGFR敏感突變NSCLC患者，Cav-1表達(dá)水平高于PFS較長患者。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，Cav-1過表達(dá)的EGFR敏感突變PC-9細(xì)胞在吉非替尼作用下較Cav-1正常表達(dá)PC-9細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)。Cav-1過表達(dá)導(dǎo)致EGFR敏感突變PC-9細(xì)胞EGFR和AKT磷酸化程度增強(qiáng)，EGFR下游PI3K/AKT信號傳導(dǎo)增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞生長遷移，減弱了吉非替尼對下游PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路的抑制作用，導(dǎo)致EGFR敏感突變PC-9細(xì)胞對吉非替尼的敏感性降低，由此表明Cav-1高表達(dá)與具有EGFR敏感突變NSCLC患者EGFR-TKIs治療耐藥相關(guān)。

綜上所述，對于EGFR敏感突變NSCLC患者，若同時(shí)存在Cav-1高表達(dá)，則應(yīng)用吉非替尼治療的PFS較Cav-1低表達(dá)患者短。Cav-1過表達(dá)使EGFR敏感突變PC-9細(xì)胞對吉非替尼耐受性增加，細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)。Cav-1參與了EGFR磷酸化過程，同時(shí)也促進(jìn)了下游PI3K/AKT、MAPK/ERK信號傳導(dǎo)通路蛋白磷酸化過程，促進(jìn)信號傳導(dǎo)。在Cav-1過表達(dá)的PC-9細(xì)胞中，吉非替尼對上述信號傳導(dǎo)過程的抑制作用減弱，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對吉非替尼治療敏感性下降。但由于本研究樣本量較小，該結(jié)論有待大樣本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)。