尉祎雯，馮凱茵，趙天賜，鄭 蕾，成 昭

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

20世紀(jì)80年代初，錢(qián)永健教授課題組對(duì)二(β-氨基乙基)乙二醇醚-N,N,N′,N′-四乙酸(Ethylene Glycol Tetraacetic Acid，EGTA)配體進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，以苯環(huán)取代EGTA結(jié)構(gòu)中N、O之間橋連的2個(gè)亞甲基，合成得到了一系列新型配體1,2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸[1,2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid，BAPTA][1-3](見(jiàn)圖1)及其衍生物，并在BAPTA配體結(jié)構(gòu)上進(jìn)一步連接熒光基團(tuán)，相繼得到了一系列對(duì)金屬離子表現(xiàn)特征識(shí)別性能的小分子BAPTA受體熒光探針。

作為金屬離子配體，EGTA與BAPTA的4條羧酸鏈能夠形成空間環(huán)狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)環(huán)的空腔尺寸與目標(biāo)離子匹配時(shí)[4-5]，即可發(fā)生EGTA、BAPTA與目標(biāo)離子的配位與識(shí)別作用。此外，作為一種苯環(huán)上連接四羧酸結(jié)構(gòu)的給電子受體，BAPTA型受體對(duì)離子的識(shí)別作用，受到其苯環(huán)電子云密度的影響[6-7]。錢(qián)永健教授在進(jìn)行BAPTA受體的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)時(shí)，還通過(guò)改變BAPTA苯環(huán)上的取代基，引入吸電子、給電子取代基，改變苯環(huán)電子云密度，進(jìn)而調(diào)節(jié)BAPTA受體與離子結(jié)合能力的強(qiáng)弱。在Biochemistry發(fā)表的代表性工作中[1]，錢(qián)永健教授課題組首次在BAPTA苯環(huán)中分別引入給電子取代基—CH3和吸電子取代基—Br，并測(cè)定發(fā)現(xiàn)，以—CH3取代BAPTA苯環(huán)上的—H，可使BAPTA對(duì)金屬離子的結(jié)合強(qiáng)度增加4個(gè)log單位，而—Br對(duì)上述—H的取代，則使BAPTA對(duì)金屬離子的結(jié)合強(qiáng)度降低1.2個(gè)log單位。

作者設(shè)計(jì)合成BAPTA衍生物2-[2-(5-甲基-2-氨基苯氧基)乙氧基]-4-苯并咪唑基苯胺-N,N,N′,N′-四乙酸甲酯(S12)時(shí)，亦在BAPTA苯環(huán)引入4′—CH3，期望增加BAPTA受體部分電子云的密度、調(diào)節(jié)其配位性能。作為最小的烷基與給電子取代基，甲基的引入不會(huì)造成較大空間位阻，且?guī)缀醪挥绊懰聂人岘h(huán)狀結(jié)構(gòu)、不影響受體結(jié)合底物的選擇性與作用方式[8]。在BAPTA經(jīng)典合成方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)行其中幾步反應(yīng)的合成條件優(yōu)化，提高了產(chǎn)物收率與反應(yīng)的選擇性，并進(jìn)一步研究了目標(biāo)產(chǎn)物S12的紫外、熒光性質(zhì)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

鄰硝基酚、5-甲基-2-硝基苯酚、1-溴-2-氯乙烷、溴乙酸甲酯、二異丙基乙胺、鄰苯二胺、無(wú)水碳酸鉀、還原鐵粉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、甲醇、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、石油醚：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為化學(xué)純。

顯微熔點(diǎn)儀：XT-4，北京泰克科技有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀：TENSOR T-27，超導(dǎo)核磁共振波譜儀：AVANCE Ⅲ 400MHz，飛行時(shí)間-質(zhì)聯(lián)儀：microTOF-QⅡ ESI-Q-TOF LC/MS/MS，美國(guó)Bruker公司；紫外分光光度計(jì)：UV-1700，日本SHIMADZU制作所；熒光分光光度計(jì)：LS-55，美國(guó)PerkinElmer公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

以鄰硝基酚、5-甲基-2-硝基苯酚、1-溴-2-氯乙烷、溴乙酸甲酯、鄰苯二胺等為原料，經(jīng)6步合成得到一種BAPTA型熒光探針S12，合成路線見(jiàn)圖2。

圖2 化合物S12的合成路線

1.2.1 2-(2-氯乙氧基)-硝基苯(化合物1)的合成

1.2.2 4-甲基-2-[2-(2-硝基苯氧基)乙氧基]硝基苯(化合物2)的合成

1.2.3 4-甲基-2-[2-(2-氨基苯氧基)乙氧基]苯胺(化合物3)的合成

1.2.4 4-甲基-2-[2-(2-氨基苯氧基)乙氧基]苯胺-N,N,N′,N′-四乙酸甲酯(化合物4)的合成

1.2.5 2-[2-(5-甲基-2-氨基苯氧基)乙氧基]-4-甲?；桨?N,N,N′,N′-四乙酸甲酯(化合物5)的合成

1.2.6 S12的合成

1.3 結(jié)構(gòu)表征

IR：采用溴化鉀壓片法對(duì)各步合成產(chǎn)物進(jìn)行IR測(cè)試，波數(shù)為4 000～400 cm-1。

1H NMR：以四甲基硅為內(nèi)標(biāo)、CDCl3為溶劑，對(duì)各步合成產(chǎn)物分別進(jìn)行400 MHz的1H NMR測(cè)試。

熒光分析：出射與入射狹縫寬度均為1 nm，波長(zhǎng)為200～500 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 表征結(jié)果

合成中間產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)經(jīng)IR與1H NMR測(cè)定，表征數(shù)據(jù)均與預(yù)期結(jié)構(gòu)相符。另由探針S12的1H NMR、IR與MS等表征數(shù)據(jù)可知，探針S12結(jié)構(gòu)正確，經(jīng)合成引入的官能團(tuán)羰基、醚鍵等均呈現(xiàn)其特征吸收，特征氫位移均能由1H NMR進(jìn)行歸屬，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，可以進(jìn)行進(jìn)一步的光學(xué)性質(zhì)研究。

2.2 2-(2-氯乙氧基)-硝基苯(化合物1)的合成路線優(yōu)化

文獻(xiàn)報(bào)道2-(2-氯乙氧基)-硝基苯的合成方法[6]，多使用1,2-二溴乙烷、原料鄰硝基酚的鉀鹽或鈉鹽作為反應(yīng)物(見(jiàn)圖3)[9]，但1,2-二溴乙烷中2個(gè)溴原子的選擇性不強(qiáng)，除生成目標(biāo)產(chǎn)物2-(2-氯乙氧基)-硝基苯(見(jiàn)圖3化合物a)，反應(yīng)常伴隨著生成2分子鄰硝基酚偶聯(lián)的副產(chǎn)物b，致使產(chǎn)率降低、副產(chǎn)物難于分離。

圖3 2-(2-氯乙氧基)-硝基苯的經(jīng)典合成路線

為避免副產(chǎn)物b的生成，選擇了具有反應(yīng)活性差異的不對(duì)稱(chēng)試劑1-溴-2-氯乙烷，替代對(duì)稱(chēng)試劑1,2-二溴乙烷，—Br與—Cl的反應(yīng)活性差異提供了更高的反應(yīng)位點(diǎn)選擇性，目標(biāo)產(chǎn)物2-(2-氯乙氧基)-硝基苯(化合物1)的合成與后續(xù)—Cl發(fā)生取代反應(yīng)、得到4-甲基-2-[2-(2-硝基苯氧基)乙氧基]硝基苯(化合物2)的反應(yīng)收率均高于95%，且產(chǎn)物后處理簡(jiǎn)單，實(shí)現(xiàn)了對(duì)2-(2-氯乙氧基)-硝基苯(化合物1)(見(jiàn)圖4)與后續(xù)產(chǎn)物4-甲基-2-[2-(2-硝基苯氧基)乙氧基]硝基苯(化合物2)合成路線的極大優(yōu)化。

圖4 2-(2-氯乙氧基)-硝基苯的優(yōu)化合成路線

2.3 4-甲基-2-[2-(2-氨基苯氧基)乙氧基]苯胺(化合物3)的合成方法優(yōu)化

4-甲基-2-[2-(2-氨基苯氧基)乙氧基]苯胺(化合物3)的合成中，以平行實(shí)驗(yàn)篩選合成方法、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，反應(yīng)物4-甲基-2-[2-(2-硝基苯氧基)乙氧基]硝基苯(化合物2)的加入量均控制為3.18 g、0.01 mol，溶劑均為無(wú)水乙醇，各方法及其產(chǎn)物收率見(jiàn)表1。

A法[10-11]先進(jìn)行反應(yīng)物與鐵粉的混合、再加入鹽酸，因鐵粉未完全活化，致使產(chǎn)率較低。C法[12]中加入鹽酸進(jìn)行鐵粉活化、但過(guò)量鹽酸產(chǎn)生了過(guò)多鐵粉的消耗，產(chǎn)率仍不理想。以醋酸作為反應(yīng)引發(fā)介質(zhì)的B法[13]，因醋酸的酸性較弱、速率較慢，反應(yīng)效果受限。D法合成路徑中，進(jìn)行鐵粉充分活化與反應(yīng)物分批投料，優(yōu)化合成條件、提高產(chǎn)率，先進(jìn)行少量鹽酸與鐵粉的混合、微熱(將少量鹽酸加入鐵粉中，加熱下攪拌反應(yīng)15～30 min)，使鐵粉表面充分活化，再于30 min內(nèi)分批加入反應(yīng)物，使鐵粉與分批次加入的反應(yīng)物充分接觸、充分反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)物收率的大幅提高。

表1 鐵粉還原反應(yīng)的條件篩選

2.4 探針S12的熒光激發(fā)與發(fā)射光譜

在200～500 nm進(jìn)行濃度為1×10-5mol/L探針S12溶液的紫外-可見(jiàn)與熒光光譜掃描[14-15]，見(jiàn)圖5。

λ/nma 紫外-可見(jiàn)光譜

λ/nmb 熒光激發(fā)與發(fā)射光譜圖5 S12的紫外-可見(jiàn)光譜和熒光激發(fā)與發(fā)射光譜

由圖5a可知，S12的最大吸收波長(zhǎng)位于314 nm。由圖5b可知，S12熒光激發(fā)與發(fā)射光譜呈現(xiàn)良好的熒光強(qiáng)度與鏡像對(duì)稱(chēng)關(guān)系[16-17](λex=313 nm，λem=397 nm)，呈現(xiàn)較大的斯托克位移，為84 nm。圖5aS12紫外-可見(jiàn)光譜吸收峰314 nm與圖5b熒光激發(fā)光譜的峰值波長(zhǎng)λex=313 nm基本保持一致，光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

基于BAPTA配體的經(jīng)典合成路線，在BAPTA苯環(huán)引入4′—CH3，合成得到一種BAPTA衍生物S12。給電子基—CH3的引入，增加了BAPTA受體部分電子云的密度，光譜研究顯示，BAPTA衍生物S12，其紫外-可見(jiàn)與熒光光譜出現(xiàn)最大吸收與發(fā)射波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向的紅移。此外，進(jìn)行BAPTA經(jīng)典合成路徑中關(guān)鍵反應(yīng)步驟的條件優(yōu)化，有效提高了產(chǎn)物收率與反應(yīng)的選擇性，且產(chǎn)物后處理簡(jiǎn)單，提高了多步合成路線整體的原子利用率，為實(shí)現(xiàn)合成路徑的綠色化邁進(jìn)了一步。