姚玲，顧曉風(fēng)

蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測研究中心，蘇州 215104

鹽酸吉西他濱（gemcitabine hydrochloride）于1983 年由美國禮來公司研發(fā)，我國于1999 年批準(zhǔn)其制劑進(jìn)口。截至目前我國現(xiàn)有原料藥和仿制藥批準(zhǔn)文號總計44 個。鹽酸吉西他濱為嘧啶核苷類似物，通過抑制脫氧核糖核酸（DNA）鏈的延長抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，發(fā)揮細(xì)胞毒作用，屬于核苷類抗代謝、抗腫瘤藥物。臨床上，鹽酸吉西他濱給藥方式主要為200mg 靜脈滴注，現(xiàn)已成為治療非小細(xì)胞肺癌以及晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌的首選藥物，具有抗癌譜廣、毒性反應(yīng)小、療效較好等特點(diǎn)［1-2］。鹽酸吉西他濱在體內(nèi)的半衰期短，常見不良反應(yīng)有骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、流感樣反應(yīng)、過敏反應(yīng)、腎毒性等。將鹽酸吉西他濱制成脂質(zhì)體給藥，相比于普通的靜脈滴注給藥方式有更高的血漿曲線下面積（AUC），且由于其半衰期短及具有靶向作用，可以通過減少給藥劑量來減少不良反應(yīng)［3-4］。脂質(zhì)體是由一層或多層磷脂雙分子層薄膜包裹的水相組成的微型球狀體。磷脂分子都含有不飽和酰基鏈，金屬離子、光照、pH 等均可影響脂類的自動氧化速度，影響脂質(zhì)體的質(zhì)量、穩(wěn)定性和安全性［5-7］。因此，對脂質(zhì)體進(jìn)行修飾或加入合適的金屬螯合劑、抗氧化劑（維生素E、丁基化羥基甲苯等），可有效抑制其自動氧化，提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性［8］。常用的螯合劑有依地酸二鈉和依地酸鈣鈉。依地酸二鈉易與鈣螯合，長期大劑量使用可引起低鈣血癥［9］。依地酸鈣鈉不與鈣鰲合，可防止該不良反應(yīng)的發(fā)生，但過量攝入會增加腎臟損傷、肝功能異常的風(fēng)險［10］。本文參考相關(guān)文獻(xiàn)［9，11-14］，利用高效液相色譜法，建立了一種測定鹽酸吉西他濱脂質(zhì)體中金屬螯合劑依地酸鈣鈉含量的方法，并進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，以期為提高鹽酸吉西他濱脂質(zhì)體的制備工藝和質(zhì)量控制提供更多參考依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

對照品依地酸鈣鈉（企業(yè)A 提供，批號SC0005，含量100%）；樣品（企業(yè)A 提供，編號A1、A2、A3）；陰性樣品（企業(yè)A 提供）；硫酸銅、硫酸銨、聚乙二醇辛基苯基醚等實(shí)驗(yàn)用試藥均為分析純；乙腈為色譜純。

1.2 主要儀器

LC 20AT液相色譜儀、SPD M20A紫外檢測器、LC solution 色譜工作站［島津（中國）有限公司］；XS205DU 電子天平、Seven Multi S40 pH 計（瑞士梅特勒托利多公司）；KB-250DB 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；KW-1000PC 恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Capcell PAK C18（250mm×4.6mm，5μm）；梯度洗脫，流動相A 為0.33%硫酸銨溶液（用稀硫酸調(diào)至pH3.0），流動相B 為乙腈，洗脫程序見表1；柱溫35℃；檢測波長254nm；流速1.0ml/min；進(jìn)樣量20μl。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 稀釋劑 ［15］

取聚乙二醇辛基苯基醚200ml，加水稀釋至1000ml，于80℃水浴中加熱搖勻，即得。

2.2.2 絡(luò)合劑

取0.5g 硫酸銅，置于100ml 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

2.2.3 對照品溶液的制備

取依地酸鈣鈉對照品約16mg，精密稱定，置于20ml 量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。精密量取1ml，置于50ml 量瓶中，加絡(luò)合劑1ml，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為16.33μg/ml 的對照品溶液。

2.2.4 樣品溶液的制備

精密量取樣品1ml，置于10ml 量瓶中，加絡(luò)合劑0.2ml，用稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，置于60℃水浴加熱至澄清，作為樣品溶液。

2.2.5 陰性樣品溶液的制備

精密量取不含依地酸鈣鈉的陰性樣品1ml，按照“2.2.4”同法制備，即得。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專屬性考察

分別取稀釋劑、絡(luò)合劑、陰性樣品溶液和對照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。稀釋劑、絡(luò)合劑和陰性樣品溶液在依地酸鈣鈉對照品溶液主峰保留時間處無色譜峰檢出，表明稀釋劑、絡(luò)合劑和樣品中除依地酸鈣鈉外的其他成份對依地酸鈣鈉的測定均無干擾。

圖1 HPLC 色譜圖

取樣品1ml 置于10ml 量瓶中，分別加入0.2mol/L 氫氧化鈉溶液、0.2mol/L 鹽酸溶液、30%過氧化氫溶液1ml，室溫放置4h，酸破壞溶液用0.2mol/L 氫氧化鈉溶液終止破壞，堿破壞溶液用02mol/L 鹽酸溶液終止破壞。另取樣品1ml 置于2個10ml 量瓶中，分別于4500lx 光照4h、100℃水浴中加熱2h。分別向上述樣品中加入絡(luò)合劑0.2ml，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，置于60℃水浴加熱至澄清，作為酸、堿、氧化、光照、高溫降解樣品溶液。進(jìn)樣后記錄色譜圖，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明該色譜條件能完全分離依地酸鈣鈉與其他降解雜質(zhì)，方法專屬性良好。

圖2 破壞試驗(yàn)結(jié)果色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.3”項(xiàng)下對照品儲備液5ml，置于100ml 量瓶中，加絡(luò)合劑5ml，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻；用稀釋劑逐步稀釋，得到質(zhì)量濃度為0.8、2.0、4.1、8.2、16.3μg/ml 和40.8μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液。分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以依地酸鈣鈉的質(zhì)量濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=8965.8219x+413.0544，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，表明依地酸鈣鈉在0.8～40.8μg/ml 濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.3 定量限與檢測限

取質(zhì)量濃度為0.8μg/ml 的對照品溶液，加稀釋劑逐漸稀釋，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。依地酸鈣鈉峰信噪比約為10∶1 時作為定量限，結(jié)果為0.16μg/ml；信噪比約為3∶1 時作為檢測限，結(jié)果為0.05μg/ml。

2.3.4 精密度考察

取對照品溶液，精密量取20μl 注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，以依地酸鈣鈉峰面積計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.11%，結(jié)果表明本方法進(jìn)樣精密度良好，儀器誤差小。見表2。

表2 精密度測定結(jié)果 n=6

2.3.5 重復(fù)性考察

取同一樣品（A1），按照“2.2.4”項(xiàng)下方法平行制備6 份樣品溶液，進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法計算依地酸鈣鈉在樣品中的質(zhì)量濃度，6 份樣品RSD 為0.28%。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。見表3。

表3 重復(fù)性測定結(jié)果 n=6

2.3.6 穩(wěn)定性考察

取“2.3.5”項(xiàng)下1 份樣品溶液，分別于0、5、10、16h 和24h 進(jìn)樣進(jìn)行分析測定，采用外標(biāo)法計算依地酸鈣鈉的質(zhì)量濃度，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.66%，結(jié)果表明樣品溶液在室溫條件下24h 穩(wěn)定性良好。結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性結(jié)果 n=5

2.3.7 回收率試驗(yàn)

精密量取陰性樣品1ml 置于10ml 量瓶中，平行制備9 份，分成高、中、低3 組，分別精密加入“2.2.3”項(xiàng)對照品儲備液0.16、0.20ml 和0.24ml，加絡(luò)合劑0.2ml，用稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，置于60℃水浴加熱至澄清，制成液含依地酸鈣鈉的質(zhì)量濃度相當(dāng)于處方量的80%（128μg/ml）、100%（160μg/ml）和120%（192μg/ml），按照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，計算回收率，結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確性良好。見表5。

2.3.8 耐用性考察

分別考察柱溫變化±5℃，波長變化±5nm，流速變化±20%，流動相變化pH±0.5，同類型不同批次色譜柱對樣品中依地酸鈣鈉質(zhì)量濃度測定結(jié)果的影響。各變化條件下依地酸鈣鈉峰均能與其他峰基線分離，且各變化條件與“2.1”項(xiàng)下條件所測結(jié)果基本一致，其RSD 為1.74%，表明該方法耐用性良好。依地酸鈣鈉質(zhì)量濃度的10 次測定結(jié)果見表6。

表6 耐用性考察試驗(yàn)結(jié)果 n=10

2.4 樣品測定

取3 批樣品，每批按“2.2.4”項(xiàng)下方法平行制備2 份樣品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下條件測定峰面積，以外標(biāo)法計算樣品中依地酸鈣鈉的質(zhì)量濃度，結(jié)果分別為160.10、160.35μg/ml 和159.21μg/ml。

3 討論

《中國藥典》［16］2020 版四部收錄了藥用輔料依地酸鈣鈉，其測定方法為容量分析法，該方法用于制劑中依地酸鈣鈉含量測定時，易受其他成份干擾，專屬性較差。有文獻(xiàn)報道［9，14］，依地酸鈣鈉的測定方法主要參考液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、離子色譜法等測定方法，其中液質(zhì)聯(lián)用法、離子色譜法對儀器要求較高，與液相色譜法相比，不利于廣泛應(yīng)用。依地酸鈣鈉不含共軛結(jié)構(gòu)，直接測定需用蒸發(fā)光散射檢測器或電導(dǎo)檢測器，且直接測定時，依地酸鈣鈉易與色譜柱不銹鋼表面金屬離子絡(luò)合，導(dǎo)致依地酸鈣鈉響應(yīng)值下降，造成峰形拖尾。選擇適當(dāng)?shù)慕饘匐x子，在柱前對依地酸鈣鈉衍生化處理，形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，有較強(qiáng)的紫外吸收［9］，選擇紫外檢測器即可對其進(jìn)行檢測，方法靈敏且簡便。

由于鹽酸吉西他濱與依地酸鈣鈉共同包裹于脂質(zhì)體中，故檢測時需破壞其外層脂質(zhì)體，使依地酸鈣鈉釋放出來。聚乙二醇辛基苯基醚為非離子表面活性劑，以20%聚乙二醇辛基苯基醚溶液（稀釋劑）作為破乳劑，在60℃加熱，即可使脂質(zhì)體完全破壞，使依地酸鈣鈉游離于溶液中［16］。

文獻(xiàn)報道［10，11-14，17］，高效液相色譜法測定依地酸鈣鈉含量，其流動相pH 常采用pH3.0 和pH7.0 2 個系統(tǒng)。本研究前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明［14，18］，調(diào)整梯度洗脫程序，2 個系統(tǒng)均能分離依地酸鈣鈉與其他物質(zhì)，但pH 較大時，對色譜柱損傷較大，會影響色譜柱使用壽命，故本研究中水相的pH 定為3.0。

本研究建立了，測定鹽酸吉西他濱脂質(zhì)體中依地酸鈣鈉含量的高效液相色譜法，方法操作簡單準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于鹽酸吉西他濱脂質(zhì)體中依地酸鈣鈉含量的監(jiān)測。