吳建霞，王越，薛豐田，陶玲玲

河南大學(xué)附屬鄭州頤和醫(yī)院，鄭州 450047

糖尿病腎病是糖尿病常見的并發(fā)癥之一。高糖可誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷，從而加快糖尿病腎病病情進(jìn)展。高糖引起的炎癥反應(yīng)等可誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，進(jìn)而加重足細(xì)胞損傷。既往研究顯示［1-3］，木犀草素等成份具有抗炎等作用，可減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，從而減輕腎臟損傷。雷公藤多苷含有生物堿等活性成份，具有抗炎、抗癌等作用，可減輕脂多糖誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥損傷［4］。但雷公藤多苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞損傷的影響及其可能作用機(jī)制尚未闡明。微小核糖核酸（miRNA）是長(zhǎng)度為20～25 個(gè)核苷酸的非編碼核糖核酸（RNA）分子，以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶基因結(jié)合，可調(diào)控靶基因表達(dá)，在糖尿病腎病中異常表達(dá)并可參與足細(xì)胞損傷過(guò)程［5］。miR-150-3p 屬于短鏈非編碼RNA分子，其在糖尿病腎病中表達(dá)上調(diào)，可能與糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［6］，但miR-150-3p 能否作為雷公藤多苷治療糖尿病腎病的潛在靶標(biāo)尚未可知。本研究采用高糖誘導(dǎo)人腎足細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，探討雷公藤多苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥的影響及其對(duì)miR-150-3p 的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

雷公藤多苷（純度>98%）購(gòu)自湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司；人腎足細(xì)胞購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；miR-inhibitor-NC、miR-150-3p inhibitor、miR-mimics-NC、miR-150-3p mimics 購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；兔抗人CyclinD1、Bcl-2、P21、Bax 抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司。

Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑、Trizol 試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；RevertAid RT 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；MTT 試劑、凋亡檢測(cè)試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；超敏C 反應(yīng)蛋白（hypersensitive C reactive protein，hs-CRP）、白 細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 分組

人腎足細(xì)胞于含5mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h，作為Control 組。人腎足細(xì)胞于含30mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h［7］，作為HG 組。人腎足細(xì)胞分別于含30mmol/L 葡萄糖和不同濃度（30、60、90mg/ml）雷公藤多苷的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h［8］，分別作為HG+Tri-30 組、HG+Tri-60 組、HG+Tri-90 組。將不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液與miR-inhibitor-NC、miR-150-3p inhibitor 混合后室溫孵育5min（A 液），Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑與不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液充分混合（B 液），A 液與B 液充分混勻后室溫孵育20min，并將其加入人腎足細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6h 棄上清液后更換含30mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h，分別記為HG+miR-inhibitor-NC 組、HG+miR-150-3p inhibitor 組。按照上述方法將miR-mimics-NC、miR-150-3p mimics轉(zhuǎn)染至人腎足細(xì)胞后加入含30mmol/L 葡萄糖與90mg/ml 雷公藤多苷的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h，分別記為HG+Tri-90+miR-mimics-NC 組、HG+Tri-90+miR-150-3p mimics 組。

1.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取人腎足細(xì)胞（1×105個(gè)/ml）接種于96 孔板（100μl/孔），按照“1.2”方法分組處理后加入MTT 溶液（20μl/孔）與二甲基亞砜（150μl/孔），充分混勻后室溫孵育5min，并檢測(cè)細(xì)胞吸光度（OD）值。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取各組人腎足細(xì)胞加入預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液，采用BY-80C 型臺(tái)式低速離心機(jī)（濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司）3000r/min 轉(zhuǎn)速離心6min 后棄上清液，加入500μl 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，隨后加入5μl Annexin V-FITC 與5μl 碘化丙啶（PI），充分混勻后室溫孵育10min，應(yīng)用FACS Calibur 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 ELISA 法檢測(cè)hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平

取各組人腎足細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA法檢測(cè)hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.6 qRT-PCR 法檢測(cè)miR-150-3p 表達(dá)水平

采用Trizol 法提取各組人腎足細(xì)胞總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度后置于-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存。反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 2μl，10×RT Buffer 2μl，dNTP 0.4μl，Multiscripe RT 1μl，10×Random Primer 2μl，RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足體系至20μl。反應(yīng)條件：25℃，10min；37℃，60min；95℃，5min；4℃保存。qRT-PCR擴(kuò) 增 體 系：10×PCR Buffer 2.5μl，MgSO42.5μl，dNTPs 2.5μl，正、反向引物各0.5μl，cDNA 2μl，RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足體系至25μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min，95℃變性60s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共36 次循環(huán)。采用qRT-PCR 熒光定量數(shù)據(jù)分析法計(jì)算miR-150-3p 的表達(dá)量。

1.7 Western blot 法檢測(cè)CyclinD1、Bcl-2、 P21、Bax 蛋白水平

提取各組人腎足細(xì)胞總蛋白后檢測(cè)蛋白濃度，加入5×SDS 上樣緩沖液，沸水煮10min 后蛋白變性，將50μg 蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離，并將其轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，室溫封閉2h，加入一抗稀釋液（CyclinD1、Bcl-2、P21、Bax 與內(nèi)參β-actin 1︰1000）后孵育過(guò)夜（4℃），使用TBST 洗滌后加入二抗稀釋液（1︰2000），室溫孵育1h 后滴加ECL 顯影，應(yīng)用ImageJ 軟件分析各條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 雷公藤多苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞增殖的影響

與Control 組比較，HG 組OD 值、CyclinD1 蛋白水平降低，P21 蛋白水平升高（P<0.05）。與HG 組比較，HG+Tri-30 組、HG+Tri-60 組、HG+Tri-90組OD 值、CyclinD1 蛋白水平升高，P21 蛋白水平降低（P<0.05）。見表1 和圖1。

圖1 增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表1 雷公藤多苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞增殖的影響 n=9，

表1 雷公藤多苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞增殖的影響 n=9，

與Control 組比較，a：P<0.05；與HG 組比較，b：P<0.05

2.2 雷公藤多苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響

與Control 組比較，HG 組凋亡率、Bax 蛋白水平以及hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平升高，Bcl-2 蛋白水平降低（P<0.05）。與HG 組比較，HG+Tri-30 組、HG+Tri-60 組、HG+Tri-90組凋亡率、Bax 蛋白水平以及hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平降低，Bcl-2 蛋白水平升高（P<0.05）。見表2 和圖2。

圖2 雷公藤多苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響

表2 雷公藤多苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響 n=9，

表2 雷公藤多苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響 n=9，

與Control 組比較，a：P<0.05；與HG 組比較，b：P<0.05

2.3 雷公藤多苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞中miR-150-3p 表達(dá)水平的影響

與Control 組比較，HG 組miR-150-3p 表達(dá)水平升高（P<0.05）。與HG 組比較，HG+Tri-30 組、HG+Tri-60 組、HG+Tri-90 組miR-150-3p 表達(dá)水平降低（P<0.05）。見表3。

表3 雷公藤多苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞中miR-150-3p 表達(dá)水平的影響

2.4 沉默miR-150-3p 對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞增殖的影響

與Control 組比較，HG+miR-inhibitor-NC組OD 值、CyclinD1 蛋白水平降低，miR-150-3p 表達(dá)水平、P21 蛋白水平升高（P<0.05）。與HG+miR-inhibitor-NC 組比較，HG+miR-150-3p inhibitor 組OD 值、CyclinD1 蛋白水平升高，miR-150-3p 表達(dá)水平、P21 蛋白水平降低（P<0.05）。見表4 和圖3。

表4 沉默miR-150-3p 對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞增殖的影響 n=9，

表4 沉默miR-150-3p 對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞增殖的影響 n=9，

與Control 組比較，a：P<0.05；與HG+miR-inhibitor-NC 組比較，b：P<0.05

圖3 增殖相關(guān)蛋白

2.5 沉默miR-150-3p 對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響

與Control 組比較，HG+miR-inhibitor-NC組凋亡率、Bax 蛋白水平以及hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平升高，Bcl-2 蛋白水平降低（P<0.05）。與HG+miR-inhibitor-NC 組比較，HG+miR-150-3p inhibitor 組凋亡率、Bax 蛋白水平以及hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平降低，Bcl-2 蛋白水平升高（P<0.05）。見表5 和圖4。

圖4 沉默miR-150-3p 對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響

表5 沉默miR-150-3p 對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響 n=9，

表5 沉默miR-150-3p 對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響 n=9，

2.6 過(guò)表達(dá)miR-150-3p 減弱雷公藤多苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥因子的影響

與HG+Tri-90+miR-mimics-NC 組比較，HG+Tri-90+miR-150-3p mimics 組OD 值和CyclinD1、Bcl-2 蛋白水平降低，miR-150-3p表達(dá)水平、凋亡率、P21、Bax 蛋白水平以及hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平升高（P<0.05）。見表6和圖5。

圖5 過(guò)表達(dá)miR-150-3p 減弱雷公藤多苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥因子的影響

表6 過(guò)表達(dá)miR-150-3p 減弱雷公藤多苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥因子的影響 n=9，

表6 過(guò)表達(dá)miR-150-3p 減弱雷公藤多苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥因子的影響 n=9，

3 討論

炎癥、氧化應(yīng)激可引起足細(xì)胞損傷，因而如何抑制炎癥及其引起的細(xì)胞凋亡成為研究重點(diǎn)，表沒(méi)食子兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡［9］。葛根素通過(guò)抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）的表達(dá)而減輕足細(xì)胞損傷［10］。目前，雷公藤多苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞損傷的作用機(jī)制尚未闡明。

雷公藤多苷屬于中藥雷公藤的提取物，具有抗炎、抗免疫等作用，可保護(hù)腎臟，但其作用機(jī)制尚未闡明［11-12］。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞活力降低，而雷公藤多苷可提高高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞活力。CyclinD1 與P21 可調(diào)控細(xì)胞周期而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖過(guò)程［13］。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞中CyclinD1 的表達(dá)下調(diào)，P21 的表達(dá)上調(diào)，而雷公藤多苷可提高CyclinD1的表達(dá)水平及降低P21 的表達(dá)水平。提示雷公藤多苷可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞增殖。Bcl-2 屬于抗凋亡蛋白；Bax 屬于促凋亡蛋白，可激活線粒體途徑而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［14］。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞凋亡，抑制Bcl-2 的表達(dá)及促進(jìn)Bax 的表達(dá)，而雷公藤多苷可降低高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞凋亡，并可促進(jìn)Bcl-2 的表達(dá)及抑制Bax的表達(dá)。提示雷公藤多苷可抑制高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞凋亡。糖尿病腎病患者存在全身性炎癥反應(yīng)，hs-CRP、IL-1β、TNF-α的水平升高可促進(jìn)糖尿病腎病發(fā)展［15］。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平升高，而雷公藤多苷可降低高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平。提示雷公藤多苷可抑制高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

為進(jìn)一步探究雷公藤多苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞損傷的作用機(jī)制，本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞中miR-150-3p 的表達(dá)水平升高，而雷公藤多苷可降低高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞中miR-150-3p 的表達(dá)水平。提示雷公藤多苷可能通過(guò)抑制miR-150-3p 的表達(dá)，從而參與人腎足細(xì)胞損傷過(guò)程。miR-150-3p 在大鼠肺損傷中呈高表達(dá)，可能參與肺損傷發(fā)生過(guò)程［16］。miR-150 表達(dá)下調(diào)可保護(hù)腎臟免受心肌梗死引起的急性腎損傷［17］。本研究結(jié)果顯示，沉默miR-150-3p 可提高高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞活力，并可降低細(xì)胞凋亡率，還能降低hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平。提示沉默miR-150-3p 可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，miR-150-3p 過(guò)表達(dá)可減弱雷公藤多苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)的作用。

綜上所述，雷公藤多苷可能是通過(guò)降低miR-150-3p 的表達(dá)水平而促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)，從而減輕高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞損傷。miR-150-3p 可能是雷公藤多苷減輕高糖誘導(dǎo)的人腎足細(xì)胞損傷的作用靶點(diǎn)，本研究為進(jìn)一步揭示雷公藤多苷治療糖尿病腎病的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。