王友娟，張辰倉，徐 祥，夏 偉，張 浩，冷敦鵬

(1.青島中仁動物藥品有限公司，山東 青島 266329；2.泗陽縣水產(chǎn)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇 宿遷 223700)

目前市場上抑制弧菌的產(chǎn)品主要有抗生素類、消毒劑類、中草藥類等?？股匾讓?dǎo)致耐藥性和殘留隱患，容易破壞水產(chǎn)動物免疫力和正常菌群微生態(tài)平衡；消毒劑往往無針對性，存在“通殺”風(fēng)險；中草藥制劑通常見效慢，效果差異較大。因此，開發(fā)安全、無抗、高效的新型抗弧菌產(chǎn)品具有重要的現(xiàn)實意義。

研究表明，葡萄糖氧化酶(Glucoseoxidase)能夠在氧氣存在時催化葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫。葡萄糖酸可以降低胃腸道內(nèi)酸性，有利于抑制病原菌；過氧化氫具有廣譜殺菌的功效，能夠抑制多種致病微生物的生長(侯瑾，2016；范一文，2007)。目前葡萄糖氧化酶主要應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖，在水產(chǎn)上的應(yīng)用相對較少(尹倫甫，2018；藍蔚青，2009)。

抗菌肽是一種具有生物活性的小分子多肽，因其顯著的殺菌活性和低抗藥性成為人們研究的焦點。抗菌肽具有高效廣譜的抗菌活性，目前已知對100種細菌有殺滅作用，對某些真菌、原生動物、病毒，尤其對耐藥性細菌也有殺滅或抑制作用(簡玉瑜，1997；陳善春，1997；陳善春，1996)。國外在抗菌肽對鰻弧菌、殺鮭弧菌及殺鮭氣單胞菌等的抑菌作用方面(AtexanderC，1997)做過報道。姜蘭等(2002)的研究結(jié)果也表明，抗菌肽對水產(chǎn)養(yǎng)殖常見病原菌嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、梅氏弧菌(Vibrio metschnikovi)、遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)及溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)有較好的抑菌效果。

本文利用葡萄糖氧化酶和抗菌肽，研究這兩種物質(zhì)單獨和不同比例復(fù)配后的混合物對兩種水產(chǎn)致病性弧菌的抑制效果，旨在為無抗內(nèi)服抑制弧菌產(chǎn)品的研發(fā)提供一定參考?，F(xiàn)將實驗過程及結(jié)果報告如下。

一、材料與方法

1.實驗材料

(1)實驗菌株：溶藻弧菌ZR-NMB-05、副溶血弧菌ZR-NMB-13從南美白對蝦體內(nèi)分離。

(2)試劑：GOD為廠家A生產(chǎn)的葡萄糖氧化酶，酶活含量大于1000單位/克(在規(guī)定條件下，每分鐘能把1微摩β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和過氧化氫的酶量為1個酶活力單位，即1單位)；GOD+為廠家A生產(chǎn)的葡萄糖氧化酶＋8%葡萄糖；GOD-為廠家B生產(chǎn)的葡萄糖氧化酶，酶活含量大于1000單位/克；抗菌肽生物效價≥8萬單位/克；5%恩諾沙星粉(水產(chǎn)用)由青島中仁動物藥品有限公司生產(chǎn)。胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)購自青島海博生物技術(shù)有限公司，110毫米直徑定性濾紙購自杭州新華紙業(yè)有限公司。

(3)主要設(shè)備：震蕩培養(yǎng)箱(HZQ-F160)、恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9052)。

2.實驗方法

葡萄糖氧化酶、抗菌肽和恩諾沙星粉抑制弧菌效果驗證。

(1)菌種活化：將溶藻弧菌ZR-NMB-05和副溶血弧菌ZR-NMB-13從-80℃冰箱中取出，37℃水浴快速融化后，分別接種到TSB液體培養(yǎng)基(含2.5%氯化鈉)中，28℃、120轉(zhuǎn)/分過夜培養(yǎng)，然后用接種環(huán)蘸取菌液在TSA平板(含2.5%氯化鈉)上劃線，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

(2)藥敏紙片制作：使用打孔器和濾紙片制作圓形藥敏紙片。分別稱取GOD、GOD+、GOD-、抗菌肽以及5%恩諾沙星粉各2克放于20毫升無菌蒸餾水中充分溶解，將藥敏紙片放于藥液中浸泡30分鐘，然后將藥敏紙片撈出控一下殘液，攤開于潔凈無菌的玻璃培養(yǎng)皿上自然晾干，之后收集、標記。

(3)菌懸液制作：參照麥氏比濁管，分別挑取兩株弧菌的單菌落，使用滅菌生理鹽水稀釋，將溶藻弧菌和副溶血弧菌的渾濁度調(diào)至1號管(細菌的濃度約為3×108個/毫升)，然后稀釋10倍。

(4)菌懸液涂布：分別吸取兩株弧菌的菌懸液100微升于TSA固體培養(yǎng)基上，使用無菌涂布棒將菌懸液涂布均勻。

(5)貼藥敏紙片：將藥敏紙片貼到涂有菌懸液的固體培養(yǎng)基上。

(6)培養(yǎng)：將培養(yǎng)基倒置放于恒溫培養(yǎng)箱中，28℃過夜培養(yǎng)。

通過恩諾沙星的對照作用，選出對溶藻弧菌和副溶血弧菌均有顯著抑制作用的GOD和有抑制作用抗菌肽，用GOD和抗菌肽不同質(zhì)量比(1∶1、1∶3、1∶5、1∶7)的混合物制作藥敏紙片。其余操作步驟同上，進行復(fù)合物抑菌效果驗證。

二、結(jié)果

1.葡萄糖氧化酶、抗菌肽和5%恩諾沙星粉抑制弧菌效果驗證

GOD、GOD+、GOD-、抗菌肽和5%恩諾沙星粉對溶藻弧菌ZR-NMB-05的抑制效果見圖1。由圖1可知，溶藻弧菌ZR-NMB-05對GOD、GOD+、5%恩諾沙星高度敏感，對GOD-不敏感，GOD對溶藻弧菌的抑制效果略優(yōu)于5%恩諾沙星粉?？咕膶θ茉寤【种谱饔萌跤谇叭?。

圖1 幾種試劑對溶藻弧菌的抑制效果

GOD、GOD+、GOD-、抗菌肽和5%恩諾沙星粉對副溶血弧菌ZR-NMB-13的抑制效果見圖2。由圖2可知，副溶血弧菌ZR-NMB-13對GOD、GOD+、5%恩諾沙星粉高度敏感，對GOD-中度敏感，抗菌肽對副溶血弧菌抑制作用相對較弱。

圖2 幾種試劑對副溶血弧菌的抑制效果

2.GOD、抗菌肽不同配比混合物抑制弧菌效果驗證

GOD、抗菌肽以及GOD和抗菌肽不同質(zhì)量比(1∶1、1∶3、1∶5、1∶7)的混合物對溶藻弧菌ZR-NMB-05和副溶血弧菌ZR-NMB-13的抑制效果見圖3、圖4。從圖3、圖4可以看出，不同配比的GOD和抗菌肽混合物對于溶藻弧菌和副溶血弧菌的抑制效果差別不大，兩者復(fù)配顯示出協(xié)同增效作用。

圖3 不同配比混合物對溶藻弧菌的抑制效果

圖4 不同配比混合物對副溶血弧菌的抑制效果

三、討論

本文實驗證實，葡萄糖氧化酶和抗菌肽對分離的兩株弧菌均具有一定的抑制作用，可以作為內(nèi)服抑弧菌產(chǎn)品開發(fā)原料的儲備。因菌懸液的制作采用麥氏比濁法，雖然渾濁度均調(diào)至1號管，但因目測具有一定主觀性和隨機性，易造成結(jié)果誤差，從本實驗平板涂布的菌苔厚度和密度也能看出差異，因此最好采用麥氏比濁儀來統(tǒng)一菌懸液濃度，使抑菌結(jié)果更具有參考性。實驗中也發(fā)現(xiàn)，雖然GOD和抗菌肽不同配比的混合物對于兩種弧菌的抑制效果沒有明顯差異，但兩者復(fù)配對副溶血弧菌的抑制效果具有協(xié)同增效作用，具體作用機理還有待進一步研究。

作為一種特殊的功能性添加劑，葡萄糖氧化酶作用的發(fā)揮依賴于葡萄糖的存在，葡萄糖添加量的多少直接影響葡萄糖氧化酶抑菌功能的發(fā)揮。尤其在體外實驗中，葡萄糖的多少對于實驗的成敗至關(guān)重要(荊新堂，2020)。由于發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶時對其進行分離和純化的工藝比較復(fù)雜，導(dǎo)致葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)成本居高不下，從而制約了葡萄糖氧化酶在我國飼料工業(yè)中規(guī)?；瘧?yīng)用(肖志明，2014)。如何更經(jīng)濟有效地制備和提純葡萄糖氧化酶是今后研究的方向。