史　銳　黃曉彤　叢龍嬌　劉斯文　王琪瑤

桑葉非腺毛顯微特征常數的測定

史銳黃曉彤叢龍嬌劉斯文王琪瑤

（遼寧中醫(yī)藥大學藥學院遼寧沈陽110000）

為優(yōu)化桑葉的顯微定量方法，文章測定了12個品種桑葉非腺毛的顯微特征常數，以便于鑒別不同品種桑葉藥材，為桑葉的質量評價提供基礎，試驗以桑葉的非腺毛作為顯微特征結構，運用容量分析法優(yōu)化均勻設計實驗條件，測定不同品種桑葉非腺毛結構的顯微特征常數。研究結果表明，不同品種桑葉非腺毛的顯微特征常數具有一定的差異性，范圍在61.6個/mg～415.7個/mg。實驗證實利用顯微定量法測定桑葉非腺毛的顯微特征常數來作為評價桑葉質量的標準是可行的、科學的，為后續(xù)研究提供了參考。

桑葉；顯微定量；均勻設計；質量評價

桑葉為?？粕僦参锷＃↙.）的干燥葉，又稱“神仙葉”“鐵扇子”等[1]。桑葉味甘、苦，性寒，歸肝、肺經[2]，具有清熱解毒、通血下氣、利五臟關節(jié)、祛風涼血、清肝明目、清肺潤燥等功效[3]，主要用于治療目赤昏花、肺熱燥咳等病癥[4]。現代研究表明，桑葉中化學成分種類十分豐富，主要包括黃酮類[5]、生物堿類[6-8]和多糖[9]等，具有降血糖[10-11]、消炎等多種藥理作用，被廣泛應用于臨床。桑葉的顯微結構中柵欄組織多與表皮細胞相連，且不同種桑葉中柵欄組織數量相差無幾；螺紋導管少見；草酸鈣簇晶和方晶的數量眾多，且結構多重合，難以區(qū)分；細胞組織與含鐘乳體的大型晶細胞數量極少；其中非腺毛的結構較為完整且粗壯，特征較為明顯，容易觀察，故選擇桑葉藥材中的非腺毛顯微結構作為顯微特征物測定桑葉的顯微特征常數。

顯微定量法[12]是根據藥材中一種特定的顯微結構具有固定常數的特點，主要采用容量分析法或重量分析法評價藥材質量的中藥鑒定方法[13]，在中藥研究領域使用較廣泛，最常用于中藥材的含量測定。此外，顯微定量法[14]在易混淆的中藥鑒定和中藥材的質量評價中的應用也較為廣泛，中藥材顯微結構的顯微特征常數與藥材中活性成分的相關性研究也有一定的進展。桑屬在我國約有11個品種，在我國各個區(qū)域均有分布，因為桑葉品種繁多，導致其入藥品種不明確，這嚴重制約了桑葉的開發(fā)利用。利用顯微定量法測定桑葉非腺毛的顯微特征常數，豐富了桑屬中桑葉的鑒別方法，創(chuàng)新了評價桑葉藥材質量的方式，為中藥的質量鑒定開辟新的途徑。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

藥材：實驗選取桑葉藥材中，雞桑、垂枝桑、廣東桑、長果桑、山桑、魯桑、白桑、華桑、蒙桑、瑞穗桑采集于江蘇鎮(zhèn)江，新疆白桑、藥桑采集于新疆和田，以上品種桑葉樣品經遼寧中醫(yī)藥大學康廷國教授鑒定為桑科桑屬桑樹（L.）的葉子。

試劑：水合氯醛與甘油（天津大茂化學試劑廠，批號：20200907），蒸餾水（娃哈哈集團）。

1.2 儀器與設備

實驗儀器及設備包括Olympus光學顯微鏡（上海普赫光電科技有限公司）、電子分析天平（上海精宏實驗設備有限公司）、FW100高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器設備有限公司）、KQ5200DB型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）、微量移液器（紹興市上虞英華貿易有限公司）、中藥篩子（紹興市上虞英華貿易有限公司）。

2 實驗方法

2.1 桑葉藥材水分的測定

實驗采用《中華人民共和國藥典》[15]（2020版）中的水分測定方法測定桑葉樣品的含水量，其中規(guī)定桑葉中水分含量不得超過15.0%。12種桑葉的水分測定結果見表1。實驗結果表明，桑葉樣品的水分在5.35%～7.98%之間，平均含水量在6.30%，樣品間水分差異不大，各樣品含水量均在15%以下。

表1桑葉水分測定結果

桑葉樣品編號名稱采集時間水分含量/% 1雞桑2021年10月5.78 2新疆白桑2021年10月5.82 3藥桑2021年10月6.85 4華桑2021年10月5.35 5白桑2021年10月6.12

續(xù)表1桑葉水分測定結果

桑葉樣品編號名稱采集時間水分含量/% 6長果桑2021年10月5.89 7山桑2021年10月6.23 8瑞穗桑2021年10月6.86 9垂枝桑2021年10月5.53 10魯桑2021年10月7.98 11蒙桑2021年10月6.32 12廣東桑2021年10月7.21

2.2 桑葉非腺毛的顯微特征常數測定定量方法條件優(yōu)化設計

2.2.1 桑葉顯微定量條件優(yōu)化設計實驗

顯微定量實驗中的影響因素主要有混懸劑用量、樣品粉碎粒度以及樣品的質量。由于考慮到顯微定量方法中的影響因素，本實驗采用3因素6水平均勻設計實驗對桑葉進行顯微特征常數測定，以對實驗條件進行優(yōu)選，從而優(yōu)化顯微定量方法。桑葉藥材非腺毛顯微定量法的均勻設計方案如表2所示。

表2均勻設計方案U（6）

樣品號樣品質量/mg粉碎粒度/目加入甘油量/mL 1201004 2401207 3601203 4801006 51001002 61201205

取1號雞桑樣品，粉碎后分別過100目和120目篩。精密稱定20 mg、40 mg、60 mg、80 mg、100 mg、120 mg共6份雞桑樣品，分別用水合氯醛多次水飛，之后移入10 mL量瓶中，按照表2各自加入相應的甘油量，用水合氯醛定容。將溶液充分搖勻，精密吸取20μL混懸液制作顯微裝片，6份樣品分別平行制作裝片10張，于顯微鏡下觀察非腺毛并計數。將所得結果隨機分成5組，分別計算平均值的RSD值，以每份樣品平均值的RSD值為考察指標，運用SPSS 26.0軟件進行分析，得到均勻設計方案的優(yōu)化實驗結果如表3所示。

表3均勻設計方案U（6）的優(yōu)化實驗結果

樣品號樣品質量/mg非腺毛的RSD值/% 1208.11 2405.05 3604.15 4809.22 51009.45 61204.91

2.2.2 統計學方法

運用SPSS 26.0統計軟件對上述實驗結果進行統計學分析，以每組桑葉藥材非腺毛數量平均值的RSD值（）為指標，1為樣品質量，2為粉碎粒度，3為加入甘油量，得出回歸方程為=30.043-0.2112，2=0.934，=71.540，=0.001＜0.05，說明整體上理論回歸模型有統計學意義。

根據上述實驗結果方程，1與3并沒有進入方程，說明1與3對顯微特征常數測定的實驗結果無影響，即桑葉中非腺毛顯微定量的優(yōu)化條件為樣品重量60.00 mg，粉碎粒度為120目，加入甘油量為3 mL。

2.2.3 桑葉非腺毛顯微特征常數測定均勻設計驗證實驗

取1號雞桑樣品，粉碎后過120目篩，精密稱定60 mg樣品3份，用水合氯醛多次水飛后轉入10 mL量瓶中，加入3 mL甘油，用水合氯醛定容至刻度，搖勻后精密吸取20 μL混懸液，平行制片10張，在顯微鏡下觀察非腺毛并計數，將觀察統計的實驗數據隨機化分組，計算平均值的RSD值，實驗結果如表4所示。

表4均勻設計驗證實驗結果

樣品號樣品質量/mgRSD值/% 160.14.12 260.34.05 360.04.11

根據上述均勻設計驗證實驗結果，每份樣品的RSD值均接近于最小變異系數4.15%，說明由SPSS 26.0統計軟件所給出的統計學結果是準確的、科學的。

2.2.4 桑葉非腺毛顯微特征常數測定

精密稱取12種桑葉粉末，每種桑葉藥材稱取60.0 mg，各3份，按照2.2.1項下的條件，稱取粉末后用水合氯醛多次水飛，并定容至10 mL量瓶中，吸取20μL混懸液，平行制裝片10張，于顯微鏡下觀察非腺毛并計數，取非腺毛的平均值后按照如下公式（1）計算桑葉藥材中非腺毛顯微特征常數（），結果如表5所示。

=（×）/（’×） （1）

上述公式中，為非腺毛顯微特征常數值，為每張裝片中非腺毛的數量，為桑葉樣品混懸液的總體積（mL），’為每張裝片的混懸液體積（mL），為桑葉樣品質量（mg）。

表5桑葉顯微特征常數測定結果

樣品編號名稱顯微特征常數值/個/mg 1雞桑350 2新疆白桑134.2 3藥桑312.6 4華桑96.6 5白桑142.5 6長果桑413.4 7山桑81.0 8瑞穗桑132.3 9垂枝桑415.7 10魯桑132.3 11蒙桑61.6 12廣東桑130.6

由表5可知，12個品種桑葉非腺毛的顯微特征常數值具有一定的差異，其中顯微特征常數值最大的為垂枝桑415.7個/mg，最小的為蒙桑61.6個/mg。顯微特征常數的測定可為后續(xù)開展顯微特征常數與化學成分含量的相關性研究以及建立完整的質量標準奠定基礎。根據相關性分析結果，可在未提取桑葉藥材前，對桑葉進行顯微特征常數測定，有利于判斷桑葉藥材質量的優(yōu)劣，為明確桑葉最佳入藥品種奠定基礎。

3 討論

本研究利用顯微定量方法測定桑葉藥材非腺毛的顯微特征常數，以非腺毛作為顯微特征結構，具有一定的專屬性。本實驗建立的顯微定量方法有助于更方便、快捷地評價桑葉的質量，對桑葉產品的開發(fā)利用具有一定的意義。

進行顯微定量實驗時，需要對不同品種桑葉樣品進行粉碎及過篩，由于過篩的粒度不同，會存在非腺毛結構破碎的情況。因此，在對非腺毛進行觀察計數時，取較為完整的非腺毛計為一個單位，結構大于50%的非腺毛也計為一個單位。在進行顯微裝片時，蓋玻片需要將混懸液全部覆蓋且不能外溢，以減少誤差的產生。

4 結論

本研究通過對桑葉進行顯微定量分析，發(fā)現同屬不同品種桑葉的顯微特征常數具有一定的差異。其中最大的是垂枝桑，顯微特征常數是415.7個/mg；最小的是蒙桑，顯微特征常數是61.6個/mg。本實驗方法具有一定科學性、可靠性，因此利用桑葉顯微特征常數之間存在的差異，可作為評價不同品種桑葉藥材的依據。

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10.3969/j.issn.2095-1205.2022.06.03

S888

A

2095-1205(2022)06-08-03

遼寧省教育廳項目（L201938）

史銳（1979- ），男，漢族，遼寧本溪人，博士研究生，副教授，研究方向為中藥質量標準。