李雪梅， 黃禹翕， 蔡曉婧， 王銀茹， 代成龍

(沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110034)

鉛是典型的重金屬污染物，土壤中高濃度的鉛會(huì)直接或通過(guò)改變土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的微生物循環(huán)而破壞植物的生理結(jié)構(gòu)。鉛通過(guò)富集在食物內(nèi)傳遞給人，長(zhǎng)期攝入會(huì)對(duì)神經(jīng)、生殖等系統(tǒng)造成嚴(yán)重影響。有研究表明，鉛離子能夠與某些酶活性中心的金屬元素競(jìng)爭(zhēng)，從而影響酶的正?；钚?，且能夠通過(guò)干擾植物的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)降低葉綠素含量，破壞光合作用系統(tǒng)，造成生理生化過(guò)程的紊亂，影響植物生長(zhǎng)。

利用外源物質(zhì)提高植物幼苗的光合效率，增強(qiáng)植株的抗逆性已經(jīng)在許多植物上得到應(yīng)用。對(duì)植物來(lái)說(shuō)，鈣離子是一種重要的礦質(zhì)元素和信號(hào)物質(zhì)，也是一種良好的膜保護(hù)劑，可以防止膜損傷，穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，保持膜的完整性。應(yīng)用外源鈣可以減少環(huán)境脅迫，如干旱、鹽度和低溫對(duì)植物細(xì)胞膜的傷害，增強(qiáng)植物細(xì)胞膜穩(wěn)定性和提高植物的抵抗力。

1931年Kautsky和Hirsch發(fā)現(xiàn)葉綠素?zé)晒夂?，由于葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)有著快速、無(wú)損的特點(diǎn)，得到了蓬勃發(fā)展，被廣泛應(yīng)用于脅迫損傷等方面。目前，用于檢測(cè)植物葉綠素?zé)晒獾膬x器主要有2種，一種是脈沖調(diào)制式熒光儀，通過(guò)測(cè)量光合作用中的光反應(yīng)階段來(lái)反映光合作用中卡爾文循環(huán)等反應(yīng)啟動(dòng)后的光能捕獲、轉(zhuǎn)化和利用情況；另一種是連續(xù)激發(fā)熒光儀，主要是通過(guò)短時(shí)光照后熒光信號(hào)的瞬時(shí)變化表現(xiàn)暗反應(yīng)前PSⅡ的光化學(xué)變化，得到快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力曲線。2種儀器都在一定程度上可以反映葉綠素?zé)晒獾淖兓?，但都具有一定的局限性，若能使?種儀器進(jìn)行測(cè)量并進(jìn)行分析，反映出的結(jié)論將更加全面。

目前有很多關(guān)于重金屬脅迫對(duì)植物葉綠素?zé)晒庥绊懙难芯浚锝?jīng)舸等研究表明，鉛脅迫可以使洋常春藤的和qN升高，和ETR降低。祁金洋等研究表明，鉛脅迫降低了絹毛委陵菜/和/。但從葉綠素?zé)晒饨嵌忍骄客庠绰然}對(duì)鉛脅迫的緩解作用相對(duì)較少。本研究采用水培法，通過(guò)噴施外源氯化鈣處理鉛脅迫下的水稻幼苗，利用2種葉綠素?zé)晒鈨x研究外源氯化鈣對(duì)鉛脅迫后水稻幼苗葉綠素?zé)晒庀嚓P(guān)指標(biāo)的影響，旨在探究外源氯化鈣對(duì)鉛脅迫的緩解作用，從而為解決鉛脅迫對(duì)植物的影響提供新思路。

1 材料與方法

本試驗(yàn)于2021年3月在沈陽(yáng)師范大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)中心進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料與處理

1.1.1 水稻幼苗的培養(yǎng) 本試驗(yàn)選用遼星1號(hào)水稻(L.)種子為試材。選取飽滿的水稻種子，經(jīng)過(guò)漂洗、消毒后，放入恒溫培養(yǎng)箱30 ℃浸種24 h、催芽24 h，待種子露白后，將種子均勻地鋪在蓋有紗網(wǎng)的裝有霍格蘭(Hoagland)完全培養(yǎng)液的塑料燒杯中，每盆約100粒。后將種子放入人工培養(yǎng)箱(晝夜溫度28 ℃/25 ℃，光照黑暗16 h/8 h，相對(duì)濕度80%，光照度10 000 lx)中培養(yǎng)，每日補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液2次，待幼苗長(zhǎng)至2葉1心期時(shí)，進(jìn)行外施氯化鈣和鉛脅迫處理。

1.1.2 外施氯化鈣及鉛脅迫處理 將0、10、20、30 mmol/L CaCl噴施在水稻幼苗葉片，CaCl預(yù)處理24 h后，對(duì)水稻幼苗進(jìn)行鉛脅迫模擬。將預(yù)處理后水稻幼苗換用含100 μmol/L Pb(NO)的Hoagland完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)3次。

表1 外施氯化鈣及鉛處理

1.2 生長(zhǎng)參數(shù)的測(cè)定

在鉛脅迫后的第5天從每個(gè)處理中隨機(jī)選擇10株幼苗測(cè)定其株高、根長(zhǎng)和鮮質(zhì)量。將稱完鮮質(zhì)量的水稻幼苗樣品烘干至恒質(zhì)量，測(cè)其干質(zhì)量。

1.3 SPAD值的測(cè)定

在鉛脅迫后的第4天，從每個(gè)處理中隨機(jī)選8株幼苗葉片，用葉綠素含量測(cè)定儀(SPAD-502Plus，日本)在葉片的相同部位測(cè)定SPAD值。

1.4 快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力曲線、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和圖像的測(cè)定

1.4.1 快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力曲線、基礎(chǔ)熒光參數(shù)、比活性參數(shù)和能量分配比率的測(cè)定 在鉛脅迫后的第4天，采用連續(xù)激發(fā)式熒光儀(Pocket PEA，英國(guó))進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)處理隨機(jī)選取3株水稻，用暗處理夾夾住葉片的同一部位，關(guān)閉遮光片進(jìn)行暗處理30 min后，得到快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力曲線，測(cè)定基礎(chǔ)熒光參數(shù)，同時(shí)計(jì)算比活性參數(shù)和能量分配比率，參數(shù)及生物學(xué)意義見表2。

表2 基礎(chǔ)熒光參數(shù)、比活性參數(shù)及能量分配比率

1.4.2 熒光淬滅動(dòng)力系數(shù)、熒光衰減率和圖像的測(cè)定 在鉛脅迫后的第4天，用脈沖調(diào)制式熒光儀(Fluorcam，捷克) 測(cè)定相關(guān)參數(shù)及圖像。從每個(gè)處理中隨機(jī)選取1株水稻的第2張葉，對(duì)其進(jìn)行 15 min 暗處理后，測(cè)量光化學(xué)淬滅系數(shù)()和熒光衰減率()，在測(cè)量的同時(shí)，捕獲到CCD鏡頭下的實(shí)時(shí)熒光圖像，打開Flashes測(cè)量光，調(diào)整至清晰的圖像，得到最大PSⅡ光量子效率(/)和光化學(xué)淬滅系數(shù)()的圖像。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010處理數(shù)據(jù)并作圖，采用SPSS 22. 0對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源氯化鈣處理對(duì)鉛脅迫下水稻幼苗生長(zhǎng)參數(shù)的影響

由表3可知，與CK相比，單鉛脅迫處理株高顯著下降(<0.05)，根長(zhǎng)出現(xiàn)下降但不顯著；在噴施了氯化鈣后，株高較單鉛脅迫處理均有顯著上升(<0.05)，T2處理的根長(zhǎng)比單鉛脅迫處理顯著增加，說(shuō)明外源氯化鈣處理能夠減輕鉛在株高、根長(zhǎng)上的影響。地上部和地下部鮮質(zhì)量在單鉛脅迫后均出現(xiàn)了顯著降低(<0.05)，而在施加了氯化鈣后，各濃度處理均發(fā)生了顯著上升(<0.05)；對(duì)于干質(zhì)量，各處理均未出現(xiàn)明顯變化。

表3 外源氯化鈣處理對(duì)鉛脅迫下水稻幼苗生長(zhǎng)參數(shù)的影響

2.2 外源氯化鈣處理對(duì)鉛脅迫下水稻幼苗葉片SPAD值的影響

從圖1可以看出，水稻幼苗在單鉛脅迫下SPAD值出現(xiàn)了顯著下降(<0.05)，外施不同濃度的氯化鈣后，各氯化鈣處理較單鉛脅迫處理均顯著上升，但各濃度之間存在差異。其中，用10、20 mmol/L 氯化鈣處理上升十分明顯，接近CK；30 mmol/L 氯化鈣處理相較單鉛脅迫處理也發(fā)生顯著升高(<0.05)，但顯著低于10、20 mmol/L氯化鈣處理。

2.3 外源氯化鈣處理對(duì)鉛脅迫下水稻幼苗快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力曲線的影響

如圖2-a所示，各處理均表現(xiàn)出標(biāo)準(zhǔn)的OJIP曲線形狀，單鉛脅迫處理的曲線I點(diǎn)、P點(diǎn)相比于CK組，均出現(xiàn)下降，說(shuō)明鉛對(duì)水稻幼苗葉片造成了一定損傷；10、20、30 mmol/L氯化鈣處理的曲線I點(diǎn)和P點(diǎn)均出現(xiàn)上升，其中上升最明顯的是 20 mmol/L 氯化鈣處理，說(shuō)明外源氯化鈣能夠緩解鉛對(duì)葉片反應(yīng)中心活性的傷害。

對(duì)OJIP熒光曲線進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后得到相對(duì)熒光變化曲線(圖2-b)，單鉛脅迫處理的J點(diǎn)明顯上升，說(shuō)明電子從Q向Q的傳遞受到限制；施加氯化鈣后的各處理相比于單鉛脅迫處理J點(diǎn)熒光均出現(xiàn)下降，其中20 mmol/L氯化鈣處理下降程度最大，這表明氯化鈣處理減輕了鉛對(duì)電子傳遞的影響。

Δ代表K點(diǎn)的情況，K點(diǎn)表明放氧復(fù)合體(OEC)受到傷害的程度，由圖2-c可知，單鉛脅迫處理的Δ明顯上升，10、20、30 mmol/L氯化鈣處理的Δ均出現(xiàn)一定程度的下降，其中 20 mmol/L 氯化鈣處理下降程度最大，所以氯化鈣能夠減輕對(duì)OEC的損傷。

2.4 外源氯化鈣處理對(duì)鉛脅迫下水稻幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.4.1 對(duì)葉綠素基本參數(shù)的影響反映暗適應(yīng)后的最小熒光，是指植物充分適應(yīng)黑暗后，光反應(yīng)中心完全開放時(shí)獲得的熒光。由圖3可知，單鉛脅迫處理顯著高于CK，這說(shuō)明鉛破壞了幼苗葉片的反應(yīng)中心；而施加氯化鈣的各處理相比于單鉛脅迫處理出現(xiàn)了顯著降低(<0.05)。

表示暗適應(yīng)后的最大熒光。由圖4可知，單鉛脅迫處理的顯著高于CK (<0.05)，施加氯化鈣后，均有所下降，但各濃度降低程度不同，10 mmol/L氯化鈣處理顯著降低，20、 30 mmol/L 氯化鈣處理組降低未達(dá)到顯著水平。

/代表植物體最大PSⅡ光量子效率，是反映植物抵抗逆境最具代表性的指標(biāo)之一。由圖5可知，與CK相比，單鉛脅迫處理的/顯著下降(<0.05)，外施氯化鈣的各處理相比于單鉛脅迫處理顯著升高，但不同濃度間沒(méi)有特別明顯的差異。說(shuō)明鉛對(duì)PSⅡ反應(yīng)中心的損傷較為顯著，同時(shí)，氯化鈣能夠在一定程度上提高光能的轉(zhuǎn)換效率，減輕鉛脅迫帶來(lái)的損傷。

2.4.2 對(duì)熒光淬滅動(dòng)力系數(shù)及熒光衰減率的影響 光化學(xué)淬滅系數(shù)()能體現(xiàn)PSⅡ激發(fā)能獲得的效率。如圖6所示，單鉛脅迫處理較CK顯著下降(<0.05)，而外施氯化鈣的各處理相比單鉛脅迫均發(fā)生了顯著上升，說(shuō)明氯化鈣改變了鉛脅迫下水稻幼苗的能量轉(zhuǎn)換途徑。

是穩(wěn)態(tài)熒光衰減率，經(jīng)常被用來(lái)反映植物的活力狀態(tài)。如圖7所示，水稻受到鉛脅迫后，值相比于CK出現(xiàn)了顯著下降(<0.05)，在施加了氯化鈣后，各處理均有了明顯的上升(<0.05)，其中20 mmol/L氯化鈣處理的上升趨勢(shì)最明顯。這說(shuō)明水稻受到鉛脅迫后，活力有所下降，同時(shí)氯化鈣能夠在一定程度上恢復(fù)水稻的活力。

2.4.3 對(duì)非活性參數(shù)的影響 由圖8可知，與CK相比，單鉛脅迫下ABS/RC、TRo/RC和DIo/RC均出現(xiàn)了顯著升高(<0.05)。 這表明鉛脅迫使能量的分配方式和份額發(fā)生變化。在施加不同濃度的氯化鈣后，對(duì)于ABS/RC，10、20 mmol/L氯化鈣處理均發(fā)生了顯著降低(<0.05)；30 mmol/L氯化鈣處理沒(méi)有出現(xiàn)明顯降低。對(duì)于TRo/RC，10、20 mmol/L 氯化鈣處理的下降程度均達(dá)到顯著 (<0.05)；30 mmol/L氯化鈣處理沒(méi)有明顯降低。對(duì)于DIo/RC，10、20 mmol/L氯化鈣處理均發(fā)生了顯著下降(<0.05)；30 mmol/L氯化鈣處理變化不顯著。

2.4.4 對(duì)能量分配比率的影響 由圖9可知，與CK相比，單鉛脅迫下和均出現(xiàn)了顯著下降；出現(xiàn)了顯著上升 (<0.05)。這表明鉛脅迫使PSⅡ受體側(cè)的電子和量子傳遞、轉(zhuǎn)化均受到了一定影響。與單鉛脅迫相比，對(duì)于，10、20 mmol/L氯化鈣處理未發(fā)生明顯的升高，30 mmol/L氯化鈣處理出現(xiàn)了顯著降低(<0.05)；對(duì)于，10、20 mmol/L 氯化鈣處理的下降程度均達(dá)到顯著 (<0.05)，30 mmol/L氯化鈣處理沒(méi)有出現(xiàn)明顯的降低；對(duì)于，20 mmol/L氯化鈣處理上升顯著，30 mmol/L氯化鈣處理出現(xiàn)顯著下降(<0.05)，10 mmol/L氯化鈣處理未出現(xiàn)顯著變化。

2.5 外源氯化鈣處理對(duì)鉛脅迫下水稻幼苗葉綠素?zé)晒鈭D像的影響

由圖10可以直觀地看出，對(duì)于/，單鉛脅迫處理的葉片整體上活性較低，特別是兩端部分所受傷害最為嚴(yán)重，而施加了氯化鈣的各處理，葉片活性升高，說(shuō)明氯化鈣提高了水稻抵抗鉛脅迫的能力，這與Pocket PEA測(cè)量出的數(shù)據(jù)所反映的趨勢(shì)是一致的。對(duì)于，單鉛脅迫處理的葉片整體上活性較低，上部邊緣損傷極為明顯，而加入不同濃度的氯化鈣后，各組活性均出現(xiàn)一定的升高，這也說(shuō)明施加氯化鈣后水稻幼苗的能量能夠被更有效的利用。

3 討論與結(jié)論

植物生長(zhǎng)過(guò)程對(duì)鉛脅迫非常敏感，鉛脅迫會(huì)嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致植物生物量減少，這與王馬勃等對(duì)茅蒼術(shù)的研究結(jié)果、李西等對(duì)草坪草的研究結(jié)果一致。本研究中，對(duì)水稻幼苗外施不同濃度的氯化鈣后，都在不同程度上增加了水稻幼苗的株高、根長(zhǎng)、地上部和地下部鮮質(zhì)量，這說(shuō)明氯化鈣能夠減輕鉛脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用。

葉綠體是光合作用的重要場(chǎng)所，其葉綠素含量高低是植物光合能力高低的主要指標(biāo)之一。SPAD值代表的是植物葉綠素的相對(duì)含量，本試驗(yàn)表明單鉛脅迫降低葉綠素含量，而氯化鈣能夠增加SPAD值，從而促進(jìn)水稻幼苗光合作用的進(jìn)行。

葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)的快速動(dòng)力學(xué)曲線含有豐富的關(guān)于PSⅡ反應(yīng)中心的主要光化學(xué)反應(yīng)的信息，對(duì)其分析提供了環(huán)境條件對(duì)光合作用機(jī)制影響的信息，主要是PSⅡ的供體側(cè)、受體側(cè)和反應(yīng)中心。Pb脅迫處理OJIP曲線較CK組I點(diǎn)、P點(diǎn)下降、K點(diǎn)、J點(diǎn)上升，其中K點(diǎn)的出現(xiàn)表明囊泡所具有的膜流動(dòng)性發(fā)生改變，導(dǎo)致PSⅡ復(fù)合物的穩(wěn)定性下降，從而導(dǎo)致PSⅡ復(fù)合物的功能和結(jié)構(gòu)完整性下降。在施加氯化鈣后，各處理組K點(diǎn)和J點(diǎn)下降且I點(diǎn)和P點(diǎn)出現(xiàn)不同程度的升高。這表現(xiàn)外源氯化鈣對(duì)PSⅡ供、受體側(cè)均起到了保護(hù)作用。

植物能夠通過(guò)刺激各種防御機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫，還能夠在面臨脅迫時(shí)迅速檢測(cè)外部刺激并產(chǎn)生和傳遞信號(hào)。鉛脅迫使和升高，這是由反應(yīng)中心失活造成的，同時(shí)使/下降，表明造成了植物PSⅡ部分失活或傷害。在外施氯化鈣后，和值下降，/出現(xiàn)上升，這反映出氯化鈣能夠提高水稻幼苗的抗鉛脅迫的能力，恢復(fù)反應(yīng)中心活性。此外，2種儀器測(cè)量的數(shù)值和圖像均反映出相同的趨勢(shì)。

植物在正常條件下吸收的光能主要在3個(gè)步驟中消耗：光合作用電子轉(zhuǎn)移、葉綠素?zé)晒獍l(fā)射和散熱。 這3種途徑之間又存在此消彼長(zhǎng)的關(guān)系，所以通過(guò)測(cè)定熒光變化可以了解光合作用和熱耗散的情況。反映了原初反應(yīng)中原初電子受體的還原情況和PSⅡ開放的程度，所代表的是穩(wěn)態(tài)熒光衰減率。本試驗(yàn)中，鉛脅迫顯著降低了和，說(shuō)明鉛脅迫改變了光能的消耗途徑，PSⅡ開放的程度降低，植物活力下降，能量可能更多以熱能的形式散失。對(duì)于施加氯化鈣的各組，和的數(shù)值均有一定的升高，說(shuō)明水稻幼苗的能量更多地被有效利用，植物體活性有所提高。

比活性參數(shù)反映的是卡爾文循環(huán)開始前，植物體能量吸收、轉(zhuǎn)化、傳遞和利用的過(guò)程。、和表現(xiàn)了PSⅡ受體側(cè)能量分配的比率。單鉛脅迫下ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC和均顯著升高，和數(shù)值均出現(xiàn)了顯著下降，說(shuō)明鉛改變了能量的利用方式和份額，更多的能量以熱能的形式被消耗，從而降低了用于傳遞電子的能量比例。對(duì)于外施10、20 mmol/L氯化鈣組的ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC和均顯著下降，和數(shù)值上升，且2組趨勢(shì)較為一致，這表明外施氯化鈣處理在能量運(yùn)動(dòng)方式上明顯區(qū)別于單鉛脅迫組，在一定程度上改善鉛對(duì)于能量運(yùn)動(dòng)方式的影響，被有效利用的能量更多，從而促進(jìn)水稻幼苗的正常生長(zhǎng)和光合作用；30 mmol/L氯化鈣處理組相比于單鉛脅迫組ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC差別不大，升高更多，和降低更為明顯，這可能是由于鈣離子濃度過(guò)高對(duì)鉛脅迫水稻幼苗的傷害造成了近一步傷害。

通過(guò)以上結(jié)果可以看出，外源氯化鈣可以有效降低鉛脅迫對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)的抑制，提高鉛脅迫下水稻幼苗SPAD值、光能利用效率。這主要是外源氯化鈣提高了水稻幼苗光合電子傳遞效率，對(duì)PSⅡ反應(yīng)中心起到保護(hù)作用，在一定程度上緩解了鉛脅迫對(duì)水稻PSⅡ的傷害。其次，綜合來(lái)看，外施10、20 mmol/L CaCl處理效果更理想。綜上，適宜濃度的外源氯化鈣能夠在一定程度上對(duì)鉛脅迫下的水稻幼苗起到緩解作用，從而能夠?yàn)闇p輕鉛對(duì)植物的傷害提供理論依據(jù)，為解決鉛對(duì)于農(nóng)業(yè)方面的影響提供新思路。