包 穎

生命科學(xué)與技術(shù)

月季RcNAC72基因的克隆及表達(dá)分析

包 穎

（唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000）

為揭示月季NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能，以月季“月月粉”生根的組培苗為材料克隆得到一個(gè)基因，命名為。生物信息學(xué)分析表明，基因全長為1 672 bp，開放閱讀框（ORF）為1 059 bp，可編碼353個(gè)氨基酸。基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，RcNAC72在N端具有保守的結(jié)構(gòu)域，與草莓FvNAC72-like、桃PpNAC72、梅花PmNAC72-like、蘋果MdNAC91蛋白序列分別有88.34%、80.74%、80.70%、79.96%的相似性。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，RcNAC72與梅花PmNAC72-like、桃PpNAC72、甜櫻桃PaNAC72、櫻花PsNAC72，親緣關(guān)系較近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，高鹽、水楊酸、茉莉酸甲酯均可誘導(dǎo)基因上調(diào)表達(dá)，高鹽，水楊酸，高鹽與水楊酸共處理時(shí)，根系中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于葉片。綜上推測基因主要在月季根中作為調(diào)節(jié)因子參與鹽脅迫響應(yīng)。

月季“月月粉”；RcNAC72；基因克??；表達(dá)分析

NAC轉(zhuǎn)錄因子家族是近10年新發(fā)現(xiàn)的最大的一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子[1]。NAC是由NAM、ATAF、CΜC這三者的首字母而命名的，其中NAM基因是在研究矮牽牛的時(shí)候被發(fā)現(xiàn)的，ATAF1、ATAF2、CΜC2的基因結(jié)構(gòu)與NAM相似，均在研究擬南芥的時(shí)候被發(fā)現(xiàn)[2-3]。NAC轉(zhuǎn)錄因子的C端為氨基酸序列具有高度多樣性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，能激活轉(zhuǎn)錄也能抑制轉(zhuǎn)錄。由于轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的結(jié)構(gòu)具有不穩(wěn)定性，使得NAC蛋白能夠與目標(biāo)蛋白互作，從而使NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)答非生物脅迫和病原菌侵染等生物脅迫的過程中起到重要的調(diào)控作用[4]。

研究證明，擬南芥類基因可被鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，鹽脅迫處理后的擬南芥植株根部組織中33個(gè)基因的表達(dá)水平發(fā)生改變，其中26個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，7個(gè)基因下調(diào)表達(dá)[5]。Tyagi等利用水稻基因芯片數(shù)據(jù)庫分析了水稻族基因在高鹽、干旱、低溫脅迫后的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)45個(gè)鹽脅迫響應(yīng)基因，其中33個(gè)上調(diào)表達(dá)，12個(gè)下調(diào)表達(dá)[6]。干旱、高鹽等逆境脅迫或脫落酸（ABA）能誘導(dǎo)水稻和擬南芥等類基因的表達(dá)，而且功能研究也證明這些類基因在抗旱、耐鹽反應(yīng)中具有重要作用[7-8]。

古老月季品種“月月粉”（‘Old Blush'）因其為二倍體且是月季育種的重要親本之一，所以是月季分子生物學(xué)研究的重要材料[9]。鹽堿地區(qū)的環(huán)境脅迫嚴(yán)重制約著園林植物景觀規(guī)劃的發(fā)展，鹽脅迫導(dǎo)致大多數(shù)月季品種生長不良、病蟲害加重，嚴(yán)重影響月季的生長發(fā)育和觀賞效果。目前，國內(nèi)外對(duì)月季抗鹽性的研究主要集中在生理水平，對(duì)于月季耐鹽性分子機(jī)理研究較少[10]。目前還沒有關(guān)于月季響應(yīng)鹽脅迫NAC類轉(zhuǎn)錄因子的研究報(bào)道。因此，克隆類基因，研究其在月季響應(yīng)鹽脅迫的時(shí)空表達(dá)模式具有重要的理論意義。

本研究利用前期已經(jīng)完成的月季“月月粉”在鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)[11]，篩選獲得1個(gè)表達(dá)水平具有顯著性差異的類基因。為驗(yàn)證月季“月月粉”轉(zhuǎn)錄因子RcNAC72是否參與鹽脅迫逆境應(yīng)答，我們分析了基因?qū)}脅迫以及激素（茉莉酸甲酯MeJA和水楊酸SA）的誘導(dǎo)表達(dá)模式。同時(shí)進(jìn)一步對(duì)月季RcNAC72進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測其生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

月季“月月粉”購自昆明楊月季園藝有限責(zé)任公司。將其栽植于唐山師范學(xué)院溫室內(nèi)，并進(jìn)行扦插繁殖。選取生長健壯、無病蟲害、植株大小一致的“月月粉”當(dāng)年生扦插苗作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.1.2 試劑

月季總RNA提取采用EASY spin植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄采用Prime Script? RT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒，（寶生物工程（大連）有限公司）Real time- PCR熒光染料混合液SYBR? Premix Ex Taq?（寶生物工程（大連）有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成

RNA的提取采用EASY spin植物RNA快速提取試劑盒；利用Roche公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。上述操作過程均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 RcNAC72基因的克隆

利用月季“月月粉”cDNA序列為模板設(shè)計(jì)CDS全長擴(kuò)增引物（詳見表1）并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為10×KOD Buffer 5 μl；MgSO4 3 μl；dNTPs 5 μl；cDNA 1 μl；上下游引物各1.5 μl；KOD Plus高保真酶1 μl；用無菌ddH20補(bǔ)齊至20 μl?；靹螂x心后于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，56.1 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min以上程序35個(gè)循環(huán)；68 ℃ 5 min；4℃反應(yīng)終止。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用TaKaRa Mini BESTAgarose Gel DNA Extraction Kit試劑盒（大連TaKaRa公司）回收目的條帶，并與pMD18-T載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落鑒定，根據(jù)菌落PCR結(jié)果，將鑒定出的陽性克隆交由諾賽生物工程有限公司測序。

1.2.3 月季轉(zhuǎn)錄因子RcNAC72的生物信息學(xué)分析

根據(jù)本課題組前期月季“月月粉”鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果和月季全基因組數(shù)據(jù)[12]，獲取基因CDS和基因全長序列。根據(jù)所獲得的基因的cDNA和基因全長序列，使用DNAMAN軟件分析RcNAC72氨基酸序列同源性；使用clutaLX進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析，使用MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.2.4 脅迫處理

選取根系生長健壯的“月月粉”幼苗，用1/2的營養(yǎng)液水培緩苗一周。之后用全Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行鹽脅迫（200 mmol·L-1NaHCO3）、激素處理（1 μmol·L-1MeJA，200 μmol·L-1SA）、鹽與激素共處理（200 mmol·L-1NaHCO3+1 μmol·L-1MeJA，200 mol·L-1NaHCO3+200 μmol·L-1SA），每個(gè)處理分別于處理后0 h、2 h、6 h、12 h、2 4 h、48 h進(jìn)行月季根系和葉片的取樣，并置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｃ總€(gè)處理5株，3次重復(fù)。本實(shí)驗(yàn)中鹽處理濃度參照丁晗[13]的方法，MeJA處理濃度參照嚴(yán)加坤等[14]的方法，SA處理濃度參照付乃鑫等[15]的方法。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

采用軟件Primer5.0設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量引物，內(nèi)參基因?yàn)?，引物序列見?。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用的引物

利用ABI7500熒光定量PCR儀檢測基因的表達(dá)量。20 μL反應(yīng)體系：3 μl cDNA模板，1 μl上游引物，1 μl下游引物，10 μl SYBR?Premix Ex Taq II（2×），5 μl ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃，30 s；94 ℃，5 s；60 ℃，2 min；40個(gè)循環(huán)。每處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次平行樣重復(fù)。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算，其中：

?t=t,RcMYB102-tRcActin

ΔΔt=Δt(h)-Δt(0)

所有數(shù)據(jù)均用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 月季RcNCA72生物信息學(xué)分析

根據(jù)前期鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)和月季全基因組數(shù)據(jù)，獲得了月季72基因的cDNA和基因序列全長（圖1）。

M: DNA分子量標(biāo)記；A: RcNAC72基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 RcNAC72與其他植物NAC類同源蛋白序列多重比對(duì)

圖3 月季RcNAC72與其他物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹

測序結(jié)果表明，基因全長1 672 bp，開放閱讀框（ORF）1 059 bp，編碼353個(gè)氨基酸。利用DNAMAN軟件對(duì)RcNAC72蛋白序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析表明，RcNAC72蛋白序列與同科的草莓FvNAC72-like、桃PpNAC72、梅花PmNAC72- like、蘋果MdNAC91蛋白序列分別有88.34%、80.74%、80.70%、79.96%的相似性；利用clutaLX軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析表明RcNAC72存在N-端保守氨基序列（如圖2所示）。利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建RcNAC72蛋白與其他植物的NAC類蛋白的氨基酸序列進(jìn)化樹結(jié)果表明，RcNAC72與梅花PmNAC72-like、桃PpNAC72、甜櫻桃PaNAC72、櫻花PsNAC 72處于同一分支，親緣關(guān)系較近（如圖3所示）。

2.2 月季RcNAC72在不同處理下的表達(dá)模式分析

鹽脅迫、外源激素SA和MeJA處理均能誘導(dǎo)基因的上調(diào)表達(dá)（圖4）。

a: 鹽脅迫處理；b: 水楊酸處理；c: 茉莉酸處理；d: 鹽與水楊酸共處理；e: 鹽與茉莉酸共處理

研究結(jié)果顯示，在高鹽處理下，根與葉中基因相對(duì)表達(dá)量均呈顯著上升趨勢，在處理48 h達(dá)到峰值，分別為對(duì)照的25.38倍和25.42倍。在外施水楊酸處理下，根中基因相對(duì)表達(dá)量在12 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的5.51倍，隨后下降；葉中基因相對(duì)表達(dá)量在48 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的10.44倍。在外施MeJA處理下，葉中基因相對(duì)表達(dá)量在6 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的7.55倍，而根中基因相對(duì)表達(dá)量在24 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的6.80倍。高鹽與SA共處理下，根與葉中基因相對(duì)表達(dá)量均呈顯著上升趨勢，且根中基因相對(duì)表達(dá)量較單獨(dú)處理顯著升高。高鹽與MeJA共處理下，根中基因相對(duì)表達(dá)量在24 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的17.70倍；葉中基因相對(duì)表達(dá)量在6 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的21.82倍。上述結(jié)果表明，基因在葉和根中的表達(dá)模式存在明顯的差異，并且高鹽、SA、高鹽與SA共處理時(shí)，根中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于葉片中，推測基因主要在月季根中起到重要作用。

3 討論

鹽脅迫不僅會(huì)導(dǎo)致植株產(chǎn)生多種表型變化，如植物失水、黃化、落葉和萎蔫，還會(huì)引起植物體內(nèi)的生理變化，如活性氧的過度積累加速了植物萎蔫[16]。植物通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合作用和能量代謝等生物途徑調(diào)節(jié)對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)。植物應(yīng)對(duì)環(huán)境中各種非生物脅迫的方式復(fù)雜而有序，而轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控是其中一種重要的途徑。研究表明NAC家族在植物的生長發(fā)育過程以及響應(yīng)非生物脅迫的過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[17]。隨著研究的不斷深入，越來越多的報(bào)道證實(shí)NAC轉(zhuǎn)錄因子與植物響應(yīng)高鹽脅迫密切相關(guān)[18-20]。

沙柳基因在鹽脅迫和高溫脅迫下均可應(yīng)答，且較為顯著[21]。郭文芳等研究發(fā)現(xiàn)柚和檸檬對(duì)低溫、干旱、高鹽和脫落酸（ABA）等脅迫的響應(yīng)都較敏感，表達(dá)量均有明顯變化，且在干旱和高鹽脅迫時(shí)和表達(dá)隨時(shí)間推移呈逐漸上升趨勢[22]。邵帥等研究表明茄子在受赤霉素（GA）、低溫和高鹽誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá)，且在根中優(yōu)先表達(dá)，這一表達(dá)模式與本研究結(jié)果相似[23]。一些植物激素在鹽脅迫響應(yīng)過程中也起著重要的調(diào)節(jié)作用，在鹽脅迫條件下，蘋果MdNAC047直接與乙烯啟動(dòng)子結(jié)合并激活其轉(zhuǎn)錄，增加了乙烯反應(yīng)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)了蘋果對(duì)鹽脅迫的耐受性[24]。吉璐研究發(fā)現(xiàn)南荻基因在高鹽、干旱、MeJA和SA誘導(dǎo)下都上調(diào)[25]。擬南芥AtNAC055和AtNAC019均可響應(yīng)茉莉酸的應(yīng)答。在本研究中，RcNAC72響應(yīng)SA應(yīng)答較MeJA更為敏感。

綜上，本研究從月季“月月粉”中克隆分離了一個(gè)與鹽脅迫應(yīng)答相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，并對(duì)其序列結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式進(jìn)行了初步研究。本研究結(jié)果為研究基因的鹽脅迫分子機(jī)制和耐鹽功能提供了依據(jù)，同時(shí)為利用基因工程技術(shù)改良月季抗逆性提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

[1] Nakashima K, Takasaki H, Mizoi J, et al. NAC trans- cription factors in plant abiotic stress responses[J]. BBA Gene Regul Mech, 2012, 1819(2): 97-103.

[2] Souer E, Houwelingen A, Kloos D, et al. The no apical meristem gene of petunia is required for pattern formation in embryos and flowers and is expressed at meristem and primordial boundaries[J]. Cell, 1996, 85(2): 159-170.

[3] Aida M, Ishida T, Fukaki H, et al. Genes involved in organ separation in: ananalysis of the cup-shaped cotyledon mutant[J]. Plant Cell, 1997, 9(6): 841-857.

[4] 潘凌云,馬家冀,李建民,等.植物鹽脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報(bào),2022,38(1):1-16.

[5] Jiang Y Q, Deyholos M K. Comprehensive transcriptional profiling of NaCl-stressedroots reveals novel classes of responsive genes[J]. BMC Plant Biol, 2006, 25(6): 25-32.

[6] Almeida DM, Almadanim MC, Louren?o TAbreu IA, et al. Screening for abiotic stress tolerance in rice: salt, cold, and drought. environmental responses in plants[J]. Methods in Molecular Biology, 2016, 1398(2): 155-182.

[7] Hu HH, You J, Fang Y J, et al. Characterization of transcription factor gene SNAC2 conferring cold and salt tolerance in rice[J]. Plant Mol Biol, 2008, 67(2): 169-181.

[8] Takasaki H, Maruyama K, Kidokoro S,et al. The abiotic stress-responsive NAC-type transcription factor OsNAC5 regulates stress-inducible genes and stress tolerance in rice[J]. Mol Genet Genomics, 2010, 284(3): 173-183.

[9] 晏慧君.月季丁香酚合成酶基因RcEGS1的功能研究[D].昆明:云南大學(xué),2019:14-16.

[10] 思妮.耐鹽月季的選育及表達(dá)擬南芥AtDREB2A-CA對(duì)月季耐鹽性的研究[D].天津:天津大學(xué),2012:40-42.

[11] Bao Y, Chen C, Fu L, et al. Comparative transcriptome analysis of‘Old Blush’ provides insights into the crucial factors and signaling pathways in salt stress response[J]. Agronomy Journal, 2021, 113(4): 3031-3050.

[12] Raymond O, Gouzy J, Just J, et al. The rosa genome provides new insights into the domestication of modern roses[J]. Nature Genetics, 2018, 50(4): 772.

[13] 丁晗.野生玫瑰耐鹽相關(guān)基因RrNHX1和RrVHA-c的克隆與表達(dá)分析[D].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2014:44-45.

[14] 嚴(yán)加坤,嚴(yán)榮,汪亞妮.外源茉莉酸甲酯對(duì)鹽脅迫下玉米根系吸水的影響[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2019,46(1):1-6.

[15] 付乃鑫,賀明榮,諸葛玉平,等.外源SA對(duì)鹽脅迫下冬小麥幼苗生長的緩解效應(yīng)及其機(jī)理[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2019,24(3):10-17.

[16] 包穎,魏琳燕,陳超.水楊酸和茉莉酸甲酯對(duì)鹽脅迫下月季品種月月粉生理特性的影響[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)),2020,35(6):1040-1045.

[17] 張丹,馬玉花.NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)非生物脅迫中的作用[J].生物技術(shù)通報(bào),2019,35(12):144-151.

[18] Puranik S, Bahadur R P, Srivastava P S, et al. Molecular cloning and characterization of a membrane associated NAC family gene, SiNAC from foxtail millet [(L.) P. Beauv.] [J]. Mol Biotech, 2011, 49(2): 138- 150.

[19] 劉彬,曹尚杰,王營,等.過表達(dá)細(xì)葉百合LpNAC6基因增強(qiáng)煙草的耐鹽性[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2020,42(4):69- 79.

[20] 翟玲俠,于崧,侯玉龍,等.蕓豆鹽堿響應(yīng)NAC轉(zhuǎn)錄因子的分子特性分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2021,36(6):16- 25.

[21] 楊海峰,薄高峰,于興旺,等.沙柳SpsNAC042基因克隆及逆境表達(dá)分析[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào),2021,36(5):11-17.

[22] 郭文芳,劉德春,楊莉,等.柑橘抗逆基因NAC83的克隆與表達(dá)分析[J].園藝學(xué)報(bào),2015,42(3):445-454.

[23] 邵帥,徐嶺賢,王紹輝,等.茄子SmNAC1基因的克隆與表達(dá)分析[J].園藝學(xué)報(bào),2014,41(5):975-984.

[24] An J P, Yao J F, Xu R R, et al. An apple NAC transcription factor enhances salt stress tolerance by modulating the ethylene response[J]. Physiol Plant, 2018, 164(3): 279-289.

[25] 吉璐.南荻抗逆相關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子的克隆及功能鑒定[D].長沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2013:29-30.

Gene Cloning and Expression Analysis of

BAO Ying

(Department of Life Sciences, Tangshan Normal University, Tangshan 063000, China)

In order to reveal the function of the NAC transcription factor in, an NAC gene namedwas cloned from root fissue culture of“Old Blush”. Bioinformatics analysis showed that the full length ofgene was 1 672 bp, and the open reading frame (ORF) was 1 059 bp, encoding 353 amino acids. Sequence alignment revealed that RcNAC72 had a conserved domain at the N-terminal, and its protein sequences were 88.34%, 80.74%, 80.70% and 79.96% similar to those of FvNAC72-like, PpNAC72, PmNAC72-like and MdNAC91, respectively. The results of phylogenetic tree showed that RcNAC72 was phylogenetically closed to PmNAC72-like, PpNAC72, PaNAC72 and PsNAC72. Real-time fluorescence quantitative analysis showed that high salt, salicylic acid, methyl jasmonate could induce the increasing expression of. Theexpression level ofgene in roots was significantly higher than that in leaves. In conclusion,gene mainly acts as a regulatory factorinrootsin response to salt stress.

; RcNAC72; gene cloning; expression analysis

S688

A

1009-9115(2022)03-0044-06

10.3969/j.issn.1009-9115.2022.03.013

河北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2021105002），唐山師范學(xué)院校內(nèi)科研項(xiàng)目（2022C54）

2021-12-18

2022-03-17

包穎（1983-），女，河北廊坊人，博士，講師，研究方向?yàn)樵录具z傳育種與逆境分子生物學(xué)。

（責(zé)任編輯、校對(duì)：范永山）