周凡萍，黃墩兵，黃賽娥

（1.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350000；2.浙江醫(yī)院，浙江 杭州 310013；3. 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州 350000）

0 引言

腦卒中后認(rèn)知功能障礙（post-stroke cognitive impairment,PSCI）是一種常見并且嚴(yán)重的腦卒中后遺癥，常導(dǎo)致患者注意功能、計(jì)算能力和執(zhí)行功能等腦高級(jí)功能障礙[1-3]，影響患者康復(fù)進(jìn)程和效果。當(dāng)前康復(fù)鄰域評(píng)定患者認(rèn)知功能的方式停留在各種量表的使用，但是對(duì)于意識(shí)不清、言語(yǔ)障礙、情感障礙、雙側(cè)手運(yùn)動(dòng)不能的患者，量表有其局限性。臨床上目前也沒辦法完全克服量表多次使用后失效的問題。所以，如果能夠?qū)颊哐暹M(jìn)行生物標(biāo)志物的檢測(cè)，快速、簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)地利用患者血清生物標(biāo)志物對(duì)對(duì)患者進(jìn)行認(rèn)知功能的評(píng)估，對(duì)PSCI的早期診斷、早期治療意義重大，也有利于PSCI的臨床管理。miRNAs是人體內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸。miRNAs在血液中的表達(dá)量不是穩(wěn)定不變的，會(huì)隨著機(jī)體生理病理的改變而改變[4]。本團(tuán)隊(duì)前期工作中已對(duì)單個(gè)miRNAs與PSCI的關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)血清miR-132的表達(dá)量與PSCI密切相關(guān)，患者血清miR-132的高表達(dá)預(yù)示著PSCI的程度越嚴(yán)重[5]。本次實(shí)驗(yàn)意在進(jìn)一步通過(guò)Solexa高通量測(cè)序獲得PSCI患者血清miRNAs的表達(dá)譜，從中篩選出差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，并做相關(guān)分析，尋找臨床診斷PSCI的潛在新分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 研究設(shè)計(jì)及對(duì)象來(lái)源

本次研究方法屬于病例-對(duì)照，所有受試人員都招募于福建省康復(fù)醫(yī)院，對(duì)所有就診人員進(jìn)行公開招募，時(shí)間跨度為2017年1月至2019年9月。按照表1-1、表1-2、表1-3中納排條件將受試人員分為三個(gè)組，分別為PSCI組、PSCN組、AMC組。三組間年齡、性別、受教育年限、基礎(chǔ)疾病相匹配，另外PSCI組、PSCN組間卒中類型、病灶、病程、腦卒中損傷程度相匹配。

1.2 研究對(duì)象納排標(biāo)準(zhǔn)

基于本項(xiàng)研究的不同之處，本團(tuán)隊(duì)充分研究了將既往有關(guān)腦卒中后認(rèn)知功能障礙的隨機(jī)對(duì)照研究的納排條件之后，決定將《Trials》雜志里的一項(xiàng)有關(guān)PSCI的隨機(jī)對(duì)照研究中的納排要求進(jìn)行了刪減，確定了下表納排標(biāo)準(zhǔn)，詳見表1、2、3。

表1 腦卒中后認(rèn)知功能障礙組（PSCI）

表2 腦卒中后認(rèn)知功能正常組（PSCN）

表3 年齡匹配對(duì)照組（AMC）

1.3 標(biāo)本采集采取受試人員空腹血5mL，隨即在低速離心機(jī)中離心，速度設(shè)置為3000 rpm，時(shí)間為5min，經(jīng)初步離心后取最上層的血清，轉(zhuǎn)移至對(duì)應(yīng)編號(hào)的1.5mL無(wú)Rnase EP管中。然后將EP管放入低溫高速離心機(jī)中離心5min，速度為于12000 rpm，溫度為4 ℃，完全清除標(biāo)本中殘余的血細(xì)胞。將標(biāo)本取出按序號(hào)分組放入凍存盒，凍存盒上標(biāo)注組名，置于-80℃冰箱保存，用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 Solexa測(cè)序

從三組血清標(biāo)本中各挑選5個(gè)樣本，三組間性別、年齡、文化程度、基礎(chǔ)疾病相匹配，另外PSCI組、PSCN組間腦卒中類型、發(fā)病部位、病程、腦卒中損傷程度相匹配。將標(biāo)本埋于干冰送往廣州市基迪奧生物有限公司進(jìn)行高通量的Solexa測(cè)序。

1.5 血清RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄

本研究采用miRNA純化試劑盒（北京艾德萊公司，RN4601），嚴(yán)格遵照配套使用說(shuō)明書進(jìn)行操做分離提取miRNA。分離提取后的樣本都需行濃度和純度的檢測(cè)，檢測(cè)使用的是德國(guó)Thermo公司NanoDrop 2000c分光光度計(jì)。通過(guò)檢驗(yàn)之后篩選出A260/A280比值在1.80-2.12之間的、濃度在20 ng/μL以上的miRNAs樣品進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。然后使用南京諾唯贊生物科技有限公司的試劑盒（MQ101-02）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，選擇miR-16作為內(nèi)參進(jìn)行校正[7]，其序列為：TAG CAG CAC GTA AAT ATT GGC GT。

1.6 RT-qPCR檢測(cè)

使用南京諾唯贊生物科技有限公司提供的ChamQTMSYBR qPCR Master Mix (MR101-02)試劑盒進(jìn)行miRNAs檢測(cè)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書步驟操作。得到的miRNAs的Ct值與miR-16的Ct值相減得到差值-ΔCt，2-ΔCt則表示miRNAs相對(duì)表達(dá)量，然后經(jīng)由對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，即log102-ΔCt，最終得到正?；腃t值。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

本研究通過(guò)IBM SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。三組組間比較，符合正態(tài)分布使用單因素方差分析，不符合則使用Kruskal-Wallis H（K）檢驗(yàn)。兩組組間比較，符合正態(tài)分布使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合則使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布使用Pearson相關(guān)進(jìn)行分析，不符合則使用Spearman相關(guān)分析。最后，通過(guò)ROC曲線和曲線下面積（area under curve,AUC）來(lái)評(píng)估m(xù)iRNAs的診斷能力。

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料的分布三組受試者性別、年齡、受教育水平等一般資料差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表4 三組間一般資料的分布（±s, n）

表4 三組間一般資料的分布（±s, n）

特征 PSCI(n=60) PSCN(n=60) AMC(n=60) P 年齡（歲） 61.08±10.3160.65±9.9658.97±9.100.295 教育程度（年） 7.50±3.038.10±2.777.45±2.770.429 MoCA評(píng)分 9.32±6.1526.75±0.8927.45±1.25 ＜0.001 性別（男/女） 42/1839/2131/290.101 腦梗死/腦出血 33/2723/37 - 0.067 左側(cè)/右側(cè)/雙側(cè) 27/29/422/36/2 - 0.381 高血壓史 28/3223/3724/360.619 糖尿病史 20/4027/3321/390.362 高血脂癥史 26/3435/2532/280.246 心臟病史 17/4316/4420/400.706 吸煙史 19/4119/4115/450.652

2.2 Solexa測(cè)序結(jié)果

根據(jù)此前研究，我們將log2_FC(PSCI/PSCN)≥3和P value＜0.05的miRNAs作為顯著差異表達(dá)的miRNAs。本研究中，我們共篩選出10個(gè)差異表達(dá)miRNAs。見表5。

表5 顯著差異表達(dá)miRNAs

2.3 第二階段RT-qPCR驗(yàn)證

小樣本驗(yàn)證階段發(fā)現(xiàn)PSCI組與PSCN組相比 較，miR-20a-5p,miR-20b-5p,miR-191-5p, miR-93-5p,miR-5991-y和miR-30d-5p顯著上調(diào)。miR-193b-5p,miR-134,miR-132-5p和 miR-214-y顯著下調(diào)。見圖2-1a。在大樣本驗(yàn)證階段，我們發(fā)現(xiàn)miR-5991-y, miR-30d-5p,miR-132-5p和miR-214-y表達(dá)量無(wú)顯著性差異，其余6個(gè)miNRAs表達(dá)情況與小樣本量階段一致。其中，miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-191-5p和miR-93-5p顯著上調(diào)，miR-193b-5p和miR-134顯著下調(diào)。見圖1。

圖1 a 小樣本量階段PSCI組與PSCN組miRNAs表達(dá)量。b大樣本量階段PSCI組與PSCN組miRNAs表達(dá)量(*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001)

此外，我們檢測(cè)60例AMC患者血清中miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-191-5p，miR-93-5p，miR-193b-5p和miR-134表達(dá)量。結(jié)果顯示，miR-20a-5p，miR-20b-5p，miR-191-5p和miR-93-5p在PSCN和AMC患者之間存在顯著差異，miR-20a-5p，miR-93-5p，miR-193b-5p和miR-134在PSCI和AMC患者中存在顯著差異，相較于AMC患者，miR-20a-5p和miR-93-5p在PSCI中顯著上調(diào)，而miR-193b-5p和miR-134顯著下調(diào)。見圖2。

圖2 PSCI、PSCN和AMC患者中miRNAs相對(duì)表達(dá)量

2.4 ROC分析

采用ROC曲線分析6種血清miRNA對(duì)PSCI的 診 斷 價(jià) 值，6種 血 清miRNA（miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-191-5p，miR-93-5p，miR-193b-5p和miR-134）的ROC曲線下面積分別為0.862(95%CI:0.806,0.918)、0.726(95%CI:0.652,0.799)、0.781(95%CI:0.710,0.852)、0.897(95%CI:0.852,0.943)、0.762(95%CI:0.830,0.694)、0.877(95%CI:0.926,0.829)、0.998(95%CI:0.995,1)。ROC曲線分析結(jié)果顯示miR-93-5p診斷效能最高，miR-134次之。

我們進(jìn)一步采用多元Logistic回歸方法計(jì)算6個(gè)血清miRNAs組合診斷PSCI的ROC曲線，構(gòu)建了回歸方程：Logit(p)=0.204-19.042×(miR-20a-5p)-7.669×(miR-20b-5p)-18.586×(miR-191-5p)-31.898×(miR-93-5p)+10.181×(miR-193b-5p)+21.03×(miR-134)。ROC曲線分析6個(gè)血清miRNAs組合診斷PSCI的靈敏度100%，特異度99.2%，比單個(gè)血清miRNAs診斷PSCI的敏感度和特異性高，AUC為0.998，具有良好的診斷效能。見表6和圖3。

圖3 6個(gè)miRNAs的ROC曲線圖

表6 6個(gè)miRNAs的ROC曲線分析

3 討論

我國(guó)腦卒中發(fā)病率逐年升高，一半以上的腦卒中患者出現(xiàn)PSCI[8]。PSCI患者無(wú)法與周圍人群進(jìn)行正常交流，積極主動(dòng)性差。此外，PSCI患者因交流的障礙不能聽從指令配合康復(fù)訓(xùn)練，康復(fù)進(jìn)程慢，效果差，日常生活嚴(yán)重依賴。認(rèn)知障礙的評(píng)估常用評(píng)定量表[9]，存在局限性。研究表明，miRNAs能穩(wěn)定存在血清中[10]，且血清提取方便快捷，成本低廉。因此，血清miRNAs有望作為PSCI的預(yù)測(cè)、診斷及評(píng)估的方便快捷指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示6個(gè)miRNAs（miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-191-5p，miR-93-5p，miR-193b-5p和miR-134）的相對(duì)表達(dá)量在PSCI、PSCN和AMC患者之間存在顯著性差異（P＜0.01）。上述6個(gè)miRNAs在多個(gè)研究報(bào)道中提及，闡明了miRNAs與突觸可塑性、認(rèn)知相關(guān)疾病、記憶等關(guān)系。Kart Varendi等[11]的研究表明腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)與血清miR-191水平相關(guān)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低濃度的miR-191會(huì)促進(jìn)BDNF的表達(dá)，miR-191的高表達(dá)反而不利于BDNF的信使RNA的翻譯，而多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)BDNF有助于神經(jīng)元的生長(zhǎng)，在突觸可塑性方面有著積極作用[12-13]。Myrrhe van Spronsen等[14]對(duì)各個(gè)發(fā)育時(shí)期的海馬神經(jīng)元微小RNAs表達(dá)譜進(jìn)行研究，他們研究數(shù)據(jù)顯示miR-191與海馬NMDA受體依賴的可塑性相關(guān)。Hui Dong等[15]的研究中同樣利用Solexa技術(shù)獲得了阿爾茨海默?。ˋD）患者與非癡呆人群血清微小RNAs的表達(dá)譜，對(duì)比表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的微小RNAs，發(fā)現(xiàn)了miR-191、miR-93在兩組人群中存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Subodh Kumar等[16]亦研究了miRNAs與AD的關(guān)系，其中就包括miR-191-5p，所有相關(guān)微小RNA中，miR-191-5p曲線下面積最大，相關(guān)性最強(qiáng)。亦有研究表明，miR-20a-5p在AD患者DE 血清中明顯上調(diào)[17]。Pete Heinzelman等[18]及Liu等[19]的研究不僅表明miR-193b減少與AD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，對(duì)miR-193b的調(diào)節(jié)還有望成為治療AD的一種手段。胡雅坤等[20]的研究發(fā)現(xiàn)miR-134的存在可下調(diào)BDNF 表達(dá)，從而促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

進(jìn)一步行ROC曲線獨(dú)立分析結(jié)果提示單一miRNA對(duì)診斷PSCI有一定的指導(dǎo)意義。我們采用多元邏輯回歸方法計(jì)算6個(gè)miRNAs組合的ROC曲線。Logistic回歸模型方法計(jì)算6個(gè)血清miRNAs組合的AUC為0.998，說(shuō)明6個(gè)miRNAs具有較高的診斷PSCI的效能。這些結(jié)果說(shuō)明6個(gè)miRNAs組合物作為診斷PSCI的生物標(biāo)志物存在潛在價(jià)值。