楊仁媛，梁新然，李祖然，湛方棟 ，李 濤，趙之偉

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201；3.云南大學(xué)省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650091)

隨著全球工業(yè)化的不斷發(fā)展，重金屬年排放量驚人。據(jù)統(tǒng)計，中國土壤總超標(biāo)率為16.1%，無機污染物中鎘(Cd)污染最為嚴(yán)重，其點位超標(biāo)率高達7%，位居無機污染物之首[1]。Cd在自然界中含量小，分布廣泛，主要存在于土壤中，造成Cd污染最主要的因素是人為污染，包括礦山開采、金屬冶煉、合金制造、水泥生產(chǎn)以及農(nóng)藥和化肥使用等[2]。目前治理鎘污染的方法包括物理法、化學(xué)法、生物法和聯(lián)合修復(fù)法，其中，生物吸附法對治理重金屬污染和放射性元素非常有效，它是通過生物的細(xì)胞壁或代謝產(chǎn)物進行吸附[3-5]。真菌具有分布廣泛、種類多樣、菌絲體粗大、易大規(guī)模培養(yǎng)、生物活性強、抗逆性強、生物量大和對營養(yǎng)條件要求簡單等優(yōu)勢，受到了廣泛關(guān)注[6]。

深色有隔內(nèi)生真菌(dark septate endophytes，DSE)泛指子囊菌或半知菌，它能在活的植物根內(nèi)定殖，卻不會使植物產(chǎn)生明顯病理學(xué)特征，能產(chǎn)無性孢子或不產(chǎn)孢，具有典型橫隔膜和微菌核結(jié)構(gòu)，廣泛分布于各種生境[7-9]，即使在嚴(yán)重Cd污染生境中，植物根系仍普遍存在DSE。DSE具有重要的生態(tài)功能，能夠促進植物生長，增強植物抵抗脅迫的能力，影響植物對重金屬的吸收累積[10]。已有研究表明：DSE菌絲能夠耐受高劑量重金屬脅迫，具有較強的吸附能力，如DSE菌株P(guān)hialocephala fortiii和Phaeoacremonium mortoniae對鉛(Pb)有較強的富集能力和耐受性[11]；DSE菌株枝狀枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)B142的非活性菌絲能夠吸附Pb[12]；DSE菌株棘殼孢屬(Pyrenochaetasp.) SR35、根盤菌屬(Rhizopycnis vagum) SR37和SR44以及Paraphaeosphaeriasp.SR46 的Cd吸附能力不同，最大Cd吸附量可達3.01～7.89 mg/g[13]。DSE對重金屬的吸附能力及耐受性因細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的不同而存在差異，除此之外，pH值、菌絲用量、吸附溫度、吸附時間和初始Cd質(zhì)量濃度等因素都會影響真菌對Cd的吸附[14]，目前，關(guān)于DSE菌絲Cd吸附特征尚不清楚。

在吸附過程中，吸附物與被吸附物之間存在相互作用，采用吸附平衡等溫線對其進行描述并確定吸附機理，其中Langmuir吸附模式和Freundlich吸附模式應(yīng)用最為廣泛[15]。描述吸附劑吸附溶質(zhì)速率的是吸附動力學(xué)，它被用來驗證吸附過程中的試驗數(shù)據(jù)，有助于探討吸附機理，目前常用的是準(zhǔn)一級速率方程和準(zhǔn)二級速率方程[16]。本研究以1株DSE-嗜魚外瓶霉(Exophiala pisciphila)為對象，探討DSE活體菌絲對Cd的等溫吸附、吸附動力學(xué)及其影響因素，采用紅外光譜分析DSE菌絲Cd吸附的化學(xué)基團，研究不同解吸劑對DSE菌絲解吸Cd的影響，探討DSE對Cd的吸附特征，為利用DSE吸附去除Cd提供參考和科學(xué)依據(jù)，也為利用真菌吸附去除重金屬污染提供材料。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

從云南會澤鉛鋅礦區(qū)野生密序野古草根[Arundinella bengalensis(Spreng.) Druce]分離出1株DSE-嗜魚外瓶霉(E.pisciphilaACCC32496)，現(xiàn)保存于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號：ACCC32496。用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)菌種，4 ℃保存，每2個月轉(zhuǎn)接菌種。

1.2 Cd處理與培養(yǎng)條件

在250 mL三角瓶中加入MMN液體培養(yǎng)基100 mL，再分別添加0、0.25、0.50、1.00、2.00和4.00 mL 10 mg/mL的Cd2+母 液(CdCl2·2.5H2O)，使Cd2+質(zhì)量濃度分別為0、25、50、100、200和400 mg/L。MMN液體培養(yǎng)基由CaCl2·2H2O 0.05 g/L、麥芽糖3.0 g/L、氯化鈉 0.025 g/L、葡萄糖10.0 g/L、磷酸二氫鉀 0.5 g/L、VB1 (硫胺素) 0.1 mg/L、MgSO4·7H2O 0.15 g/L、FeCl3(1%)1.2 mL/L和NaNO33.0 g/L配制而成[17]。滅菌處理后，接種1片直徑為6 mm的菌株菌塊，在28 ℃、120 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)7 d。

1.3 不同因子對菌絲Cd吸附量的影響

1.3.1 Cd吸附量的計算

無Cd培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，過濾收集菌絲球，無菌水沖洗3次，抽濾去除水分得到菌絲鮮樣，稱量得菌絲體鮮質(zhì)量；將菌絲鮮樣于 75 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱量得菌絲體干質(zhì)量；計算菌絲鮮樣含水率，并通過干濕比換算得到干菌體質(zhì)量，用于計算Cd吸附量。吸附完成后，取1 mL過濾溶液用于測定Cd質(zhì)量濃度，并根據(jù)公式計算Cd吸附量：

式中：q為Cd吸附量，mg/g；C0為Cd2+初始質(zhì)量濃度，mg/L；Ce為反應(yīng)后剩余Cd質(zhì)量濃度，mg/L；m為干菌體質(zhì)量，g；V為反應(yīng)液體積，L。

1.3.2 菌絲Cd吸附量的影響因子

(1) pH值：在100 mg/L Cd2+溶液中加入0.5 g菌絲鮮樣，調(diào)節(jié)溶液pH值為3、4、5、6、7、8，在30 ℃、120 r/min恒溫培養(yǎng)箱中振蕩吸附2 h，測定濾液中Cd質(zhì)量濃度，確定菌絲吸附Cd的最佳pH值。

(2) Cd初始質(zhì)量濃度：在 25、50、100、200、300和400 mg/L Cd2+溶液中分別加入0.5 g菌絲鮮樣，調(diào)節(jié)到最佳pH值，在30 ℃、120 r/min恒溫培養(yǎng)箱中振蕩吸附2 h，測定濾液Cd質(zhì)量濃度。

(3) 吸附時間：在50 mL 300 mg/L Cd2+溶液中加入0.5 g菌絲鮮樣，調(diào)節(jié)pH值，在30 ℃、120 r/min恒溫培養(yǎng)箱中振蕩吸附，分別在5、10、20、30、40和50 min以及1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60和72 h取樣。每次取樣體積為0.5 mL，測定Cd質(zhì)量濃度。

1.4 嗜魚外瓶霉菌絲吸附Cd的等溫吸附模型與動力學(xué)模型

利用吸附等溫模型描述吸附達到平衡時的吸附量(qe)與溶液中吸附質(zhì)質(zhì)量濃度(Ce)間的定量關(guān)系，可為吸附機理的研究提供依據(jù)。采用Langmuir方程和Freunndlich方程2種等溫吸附模型對嗜魚外瓶霉菌絲吸附Cd的過程進行擬合，Langmuir方程和Freunndlich方程表達式見式(1)和式(2)：

式中：qe為吸附平衡后Cd在單位質(zhì)量吸附劑上的平衡吸附容量，mg/g；qm為理論最大吸附量，mg/g；KL為Langmuir吸附常數(shù)，L/mg；Ce為吸附平衡時溶液中Cd質(zhì)量濃度，mg/L；KF為Freunndlich吸附常數(shù)，mg1-1/n·L1/n·g-1；n為經(jīng)驗參數(shù)，與吸附體系性質(zhì)有關(guān)。吸附過程隨時間變化的關(guān)系是吸附動力學(xué)的研究內(nèi)容，其對更好地了解吸附劑對吸附質(zhì)的吸附過程具有重要意義。吸附動力學(xué)常用準(zhǔn)一級速率方程和準(zhǔn)二級速率方程對試驗數(shù)據(jù)進行擬合。準(zhǔn)一級速率方程和準(zhǔn)二級速率方程表達式分別為式(3)和式(4)：

式中：t為吸附時間，min；qe為吸附平衡時的吸附容量，mg/g；qt為吸附時間為t時的吸附容量，mg/g；K1和K2為吸附速率常數(shù)。

1.5 菌絲傅立葉紅外光譜測定

采用壓片法測定菌絲的紅外光譜。取75 ℃烘干并粉碎成粉末狀的菌絲體2 mg，與烘干的溴化鉀200 mg充分研磨，壓片，采用FTIR紅外光譜儀測繪其光譜，并進行分析，探討嗜魚外瓶霉菌絲吸附Cd涉及的基團。

1.6 菌絲Cd解吸試驗

按1.3節(jié)的方法獲得不同質(zhì)量濃度Cd的菌絲鮮樣及鮮樣含水量。分別以0.1 mol/L的HNO3、Na2EDTA、CaCl2和NaOH為解吸劑，向50 mL解吸劑中加0.5 g菌絲鮮樣，在30 ℃、120 r/min恒溫培養(yǎng)箱中振蕩吸附2 h，過濾，用火焰原子吸收法測定濾液中Cd質(zhì)量濃度，計算解吸劑從菌絲體上解吸的Cd含量，計算公式為：

式中：De為菌絲對Cd的解吸量；c為解吸完成時濾液中Cd的質(zhì)量濃度；V為解吸體系體積；m為稱取的菌絲質(zhì)量。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

用Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)整理；用IBM SPSS Statistics 24進行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差數(shù)法(LSD)和新復(fù)極差法(Duncan’s)進行多重比較；采用Origin 9.5進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值與初始質(zhì)量濃度對嗜魚外瓶霉菌絲Cd吸附量的影響

由圖1可知：不同pH值條件下，嗜魚外瓶霉菌絲對Cd的吸附量不同。隨著pH值的增大，Cd吸附量先增加后下降，當(dāng)pH值為5時，吸附量達到最大值，為9.09 mg/g。由圖1還可知：隨著Cd初始質(zhì)量濃度的增加，嗜魚外瓶霉菌絲對Cd吸附量也增加。Cd初始質(zhì)量濃度為400 mg/L時，達到吸附飽和狀態(tài)，吸附量基本穩(wěn)定，即嗜魚外瓶霉菌絲對Cd的最大吸附量為14.14 mg/g。

圖1 pH值與初始質(zhì)量濃度對嗜魚外瓶霉菌絲Cd吸附量的影響Fig.1 Effects of pH value and initial mass concentration on the Cd adsorption amount by Exophiala pisciphila mycelium

2.2 吸附時間對嗜魚外瓶霉菌絲Cd吸附量的影響

由圖2可知：嗜魚外瓶霉菌絲Cd吸附過程大致分為2個階段：第1階段為快速吸附，第2階段為緩慢吸附，60 min內(nèi)Cd吸附量為11.37 mg/g，占總吸附量的79.3%，在 24 h基本達到吸附平衡。

圖2 吸附時間對嗜魚外瓶霉菌絲Cd吸附量的影響Fig.2 Effect of adsorption time on the Cd adsorption amount by E.pisciphila mycelium

2.3 嗜魚外瓶霉菌絲吸附Cd的等溫吸附模型與動力學(xué)模型

由圖3可知：嗜魚外瓶霉菌絲吸附Cd的Langmuir等溫吸附方程擬合的相關(guān)系數(shù)為0.991 7，該方程得出Cd理論最大吸附量(qm)為16.31 mg/g；Fleundlich等溫吸附方程擬合的相關(guān)系數(shù)為0.959 8，該方程得到的qm為15.24 mg/g。可見，Langmuir吸附等溫模型相關(guān)系數(shù)更高，其qm與Cd吸附試驗值更接近。因此，嗜魚外瓶霉菌絲吸附Cd更符合Langmuir吸附等溫模型。

圖3 嗜魚外瓶霉菌絲吸附Cd的Langmuir吸附等溫線(a) 和Freundlich吸附等溫線(b)Fig.3 Langmuir adsorption isotherm (a) and Freundlich adsorption isotherm (b) of Cd by E.pisciphila mycelium

由圖4可知：準(zhǔn)一級速率方程的相對系數(shù)為0.921 2，較準(zhǔn)二級速率方程的相對系數(shù)(0.999 0)小，即準(zhǔn)一級速率方程獲得的理論平衡吸附量與試驗結(jié)果相差較大。準(zhǔn)一級速率和準(zhǔn)二級速率方程獲得的理論平衡吸附量分別為16.67 和14.25 mg/g，準(zhǔn)二級速率方程所得結(jié)果與試驗結(jié)果更接近。因此，嗜魚外瓶霉菌絲吸附Cd更符合準(zhǔn)二級速率方程。

圖4 嗜魚外瓶霉菌絲吸附Cd的準(zhǔn)一級速率方程(a)和準(zhǔn)二級速率方程(b)Fig.4 Linearized pseudo-first order kinetic plots (a) and linearized pseudo-second order kinetic plots (b) of Cd by E.pisciphila mycelium

2.4 嗜魚外瓶霉菌絲Cd吸附的基團

由圖5可知：嗜魚外瓶霉菌絲在3 401.82 cm-1處的寬吸收峰為聚合體中的-NH基團的伸縮振動和-OH基團的吸收，2 925.48和2 856.06 cm-1處的強吸收峰為脂肪族-CH2和-CH3基團的伸縮振動，1 743.33和1 641.13 cm-1處的強吸收峰為酸、酯和酮中-C=O基團的對稱和非對稱伸縮振動，1 153.22、1 078.53和1 035.59 cm-1處的吸收峰為P-O基團的伸縮振動，P=O在1 153.22和1 078.53 cm-1處有非對稱和對稱伸縮振動，P-O-C基團在1 035.59 cm-1處有對稱伸縮振動?？梢姡若~外瓶霉菌絲吸附Cd涉及氨基、酰胺基、羧基、羥基和磷?；然鶊F。

圖5 嗜魚外瓶霉菌絲的紅外光譜Fig.5 FT-infrared spectrum of E.pisciphila mycelium

2.5 解吸劑對嗜魚外瓶霉菌絲Cd的解吸作用

由表1可知：HNO3和Na2EDTA的解吸能力基本相同，Cd質(zhì)量濃度為25、50、100、200、300和400 mg/L時，HNO3分別從菌絲上解吸出3.55、6.94、20.94、49.84和72.61 mg/g Cd，分別占菌絲Cd富集量的63.0%、66.4%、70.4%、75.6%和81.6%；Na2EDTA分別解吸出3.81、7.11、21.73、51.24和74.36 mg/g Cd，分別占菌絲Cd富集量的67.7%、68.1%、73.1%、77.7%和83.5%。Cd質(zhì)量濃度增加時，HNO3和Na2EDTA從嗜魚外瓶霉菌絲解吸出的Cd含量也顯著增加，占菌絲Cd富集量的比例也增加。對于CaCl2和NaOH而言，Cd質(zhì)量濃度增加時，菌絲解吸出的Cd含量增加，但占菌絲Cd富集量的比例下降?？梢姡?種解吸劑中HNO3和Na2EDTA的解吸能力最強。

表1 不同解吸劑從嗜魚外瓶霉菌絲解吸的Cd含量Tab.1 Content of cadmium desorption from Exophiala pisciphila mycelium using various eluants mg/g

3 討論

3.1 不同因子對真菌吸附Cd影響

在真菌吸附Cd2+的過程中，重金屬初始質(zhì)量濃度、pH值、吸附溫度和吸附時間以及真菌自身特性、吸附劑投加量和對菌體的不同預(yù)處理方法等因素都會對吸附能力產(chǎn)生影響[18-20]。pH使真菌的吸附位點發(fā)生變化，改變細(xì)胞膜通透性，對酶促反應(yīng)速率造成影響，使胞內(nèi)物質(zhì)的溶解性和電離性發(fā)生改變，轉(zhuǎn)變金屬溶液的化學(xué)特性，影響細(xì)胞壁表面的官能團活性[21]。在不同pH值的溶液中，Cd的狀態(tài)會發(fā)生變化，如酸性條件下易呈離子狀態(tài)，堿性條件下易形成沉淀。pH值升高導(dǎo)致溶液中H+濃度下降，弱化H+對吸附位的競爭能力，使吸附劑上負(fù)電荷的官能團增多，可更好地與Cd2+結(jié)合；同時，負(fù)電荷的增加使基團與Cd2+的電荷排斥力減弱，促進吸附劑對 Cd2+吸附，繼續(xù)增加pH值，溶液中Cd2+發(fā)生水解反應(yīng)，形成Cd(OH)2，降低去除率[22]。在本研究中，嗜魚外瓶霉菌絲對Cd吸附的最佳pH值為5，與目前已報道的產(chǎn)絮酵母菌廢菌體、煙曲霉和棘孢曲霉吸附Cd的最佳pH[23-25]一致。

此外，初始Cd2+質(zhì)量濃度和吸附時間也是決定真菌吸附能力的重要因素?？刂茣r間和初始Cd質(zhì)量濃度能提高真菌對Cd的吸附率。吸附劑相同時，增加離子初始質(zhì)量濃度和吸附時間會導(dǎo)致吸附量增加，最終達到飽和吸附量。這是因為吸附劑相同時，結(jié)合位點沒有達到飽和，初始Cd2+質(zhì)量濃度越大，吸附的Cd2+越多，吸附容量越高，當(dāng)位點趨于飽和時，吸附容量將達到穩(wěn)定狀態(tài)。研究顯示：生物對重金屬離子的吸附過程可分為快速過程和慢速過程[26]。吸附前期，吸附劑表面有大量的活性吸附位點，Cd被快速去除，隨著吸附位點不斷被Cd2+占據(jù)，反應(yīng)速度逐漸減緩，直到吸附平衡[27-28]。層迭靈芝子實體和球孢白僵菌株 JB15吸附Cd2+的過程分為快速吸附和慢速吸附[28-29]，與本研究結(jié)果一致。

3.2 真菌吸附Cd的等溫平衡與動力學(xué)

等溫吸附模型表示的是恒溫條件下物質(zhì)濃度對吸附到表面上的物質(zhì)數(shù)量產(chǎn)生的影響，其前提是存在一定數(shù)量的吸附位點，金屬離子被化學(xué)吸附在該位點，每一位點能吸附一分子金屬離子，位點是能量均衡的，且被吸附離子間不存在相互作用力[30-32]。Langmuir模型和Freundlich模型是描述絲狀真菌吸附Cd體系中最常用的平衡吸附模型。Langmuir模型適用于吸附劑表面含有限均一性吸附位點的單分子層吸附過程，符合該模型說明吸附劑表面均勻，吸附質(zhì)之間沒有相互作用，吸附是單層吸附，只發(fā)生在吸附劑的外表面[33-35]；Freundlich模型則是吸附位點非均一地分布在異質(zhì)表面，屬于多分子層吸附過程，適用于吸附劑表面異質(zhì)的吸附過程[30,35]。目前已報道的產(chǎn)絮酵母菌廢菌體[23]、球孢白僵菌株 JB15[29]、白腐菌[34]、簡青霉[35]、粗柄側(cè)耳、雙孢蘑菇、Calocybe indica[27]、Microsphaeropsissp.LSE10[36]、微紫青霉菌菌株GXCR[37]等Cd吸附的等溫式均符合Langmuir等溫吸附模型，與本研究嗜魚外瓶霉菌絲吸附Cd的吸附等溫式一致。

生物吸附是一個動態(tài)過程，目前已有許多描述吸附反應(yīng)速率的動力學(xué)方程。吸附動力學(xué)可以描述吸附劑對吸附質(zhì)的吸附速率以及受速率控制的吸附平衡時間[38-39]。目前，常用準(zhǔn)一級速率方程和準(zhǔn)二級速率方程描述生物吸附過程[40]。本研究表明：嗜魚外瓶霉菌絲Cd吸附過程符合準(zhǔn)二級速率方程，它預(yù)測的平衡吸附量與試驗結(jié)果更接近，還能更好地表達生物吸附過程，這與目前報道的醬油曲霉[19]、產(chǎn)絮酵母菌廢菌體[23]、棘孢曲霉[25]、層迭靈芝子實體[28]、簡青霉[35]、雙孢蘑菇、Calocybe indica[27]和Microsphaeropsissp.LSE10[36]等不同種類真菌菌絲吸附Cd的過程一致。

3.3 真菌吸附Cd機理

生物吸附分為主動吸附和被動吸附。被動吸附是物理性吸附，其過程不消耗能量，細(xì)胞壁上的官能團如-SH、-COOH、-NH2、-OH和-PO43-等可與金屬離子進行絡(luò)合、螯合和離子交換等反應(yīng)，靠官能團與離子之間的物理作用力將重金屬吸附[41]；主動吸附是化學(xué)性吸附，其過程需要消耗能量，通過細(xì)胞壁官能團與重金屬形成化學(xué)鍵，或者進行細(xì)胞內(nèi)酶促作用，將重金屬生物轉(zhuǎn)運、生物沉淀或生物積累[42-43]，通過真菌表面吸附的金屬離子與特定酶相結(jié)合，將其轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)。本研究的嗜魚外瓶霉菌絲對Cd的吸附作用是細(xì)胞表面吸附Cd的物理過程，該過程包括配位絡(luò)合、離子交換、靜電交感、氧化還原和無機微沉淀等[44]。真菌細(xì)胞壁上的活性基團如巰基、羧基和羥基等與重金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)而達到吸收重金屬的目的，不同真菌的細(xì)胞壁不同，吸附重金屬的能力也不同。研究表明：Penicilliumsp.PC1吸附去除Pb2+與 Cd2+的過程涉及O-H、C=O、C-N、N-H和C-H 等官能團[45]；在吸附過程中，醬油曲霉依靠菌體表面的酰胺基、羧基、羥基、磷酸基和氨基進行吸附[19]；在利用農(nóng)林廢棄物—耐性真菌復(fù)合吸附劑吸附Pb的過程中，起主要作用的是羥基、羧基、氨基和羰基等官能團[46]；羧基、酰胺、羥基和吡啶等官能團主要參與功能化的黃孢原毛平革菌對重金屬的吸附[47]；Microsphaeropsissp.LSE10通過羧基、氨基、磺酸基和羥基等基團對Cd進行吸附[36]；產(chǎn)菌核真菌Aspergillus oryzaeG15表面的羧基和氨基等基團在吸附Pb和Cu的過程中發(fā)揮了主要作用[48]。本研究表明：嗜魚外瓶霉菌絲吸附Cd的化學(xué)基團涉及氨基、酰胺基、羧基、羥基和磷?；取?/p>

4 結(jié)論

深色有隔內(nèi)生真菌嗜魚外瓶霉吸附Cd的最佳pH值為5，隨著Cd初始質(zhì)量濃度的增加，其對Cd吸附量也增加，直至吸附飽和。吸附過程分為快速吸附和慢速吸附，吸附24 h基本達到吸附平衡，吸附過程符合Langmuir吸附等溫模型，吸附動力學(xué)符合準(zhǔn)二級速率方程。嗜魚外瓶霉吸附Cd涉及氨基、酰胺基、羧基、羥基和磷?；然鶊F。0.1 mol/L HNO3、Na2EDTA、CaCl2和NaOH均能從嗜魚外瓶霉菌絲上解吸出一定量的Cd，其中，HNO3和Na2EDTA的解吸能力最強。