許忠偉 劉春月 石佳悅 邵霞 宋宇

（遼東學(xué)院，遼寧 丹東 118003；第一作者：2020358115@qq.com；*通訊作者：763869365@qq.cm）

土壤微生物是自然系統(tǒng)和管理生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分[1]。植物可依靠根系和土壤微生物之間的相互作用來促進(jìn)其營養(yǎng)吸收。根際是根的表面和貼近根的周圍的土層，受植物根系分泌物、脫落物和植物殘體等影響，是植物、土壤和微生物的連接紐帶，內(nèi)含不計其數(shù)的微生物，是地球上最活躍的界面之一。在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，根際微生物群對作物生長、營養(yǎng)和健康有著深刻的影響[2]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，常規(guī)種植的水稻根際微生物群落得到了一定研究[3]。人們通過在稻田中引入魚、小龍蝦、鱉等生物進(jìn)行稻田復(fù)合種養(yǎng)，不僅改善了農(nóng)田環(huán)境、滿足了人們對綠色安全稻米的需求，而且還有助于解決長期大量使用化肥農(nóng)藥所造成的環(huán)境污染、土壤肥力下降和藥物殘留等一系列問題[4-5]。目前對共作稻田的研究主要集中在對稻田水體環(huán)境、病蟲害防治、水稻產(chǎn)量、某個特定生長時期根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響上以及不同稻田共作模式對表層土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響及多樣性分析等方面[6-12]，對稻蟹共作田根際細(xì)菌群落在水稻不同生育期的變化規(guī)律知之甚少。為此，作者設(shè)計了本試驗，以期為水稻不同生育期專用菌劑開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗方法

以粳稻品種越光為試驗材料，試驗地點(diǎn)設(shè)在遼寧省東港市北井子鎮(zhèn)蓋家壩農(nóng)場，試驗稻田面積700 m2。水稻于2020 年5 月10 日進(jìn)行移栽，栽插規(guī)格30 cm×15 cm。于3 月份和7 月份施用日照益康有機(jī)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的海藻生物有機(jī)肥，用量均為1.35 kg/hm2。4 月末投放河蟹苗，投放量為 0.5 kg/hm2，10 月末收蟹。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 土壤樣品采集與處理

分別在水稻分蘗期（6 月 29 日）、拔節(jié)期（7 月 31日）、抽穗期（9 月 2 日）和成熟期（10 月 15 日）在稻田上隨機(jī)選取5個點(diǎn)，采用破壞性取樣法將水稻整株挖出，勿傷害根系，抖落大塊土壤后用無菌刷刷取根際區(qū)域約5 mm 緊密粘附在根表面的土壤，每5 株為1個重復(fù)，每個時期3 次重復(fù)。混合后的樣品分成兩份，一份裝入密封袋，帶回風(fēng)干處理，用于理化指標(biāo)分析；一份裝入50 mL 離心管中，于-80℃溫度下冷凍保存，用于微生物多樣性分析。稻蟹共作田的分蘗期、拔節(jié)期、抽穗 期 和成熟 期 分別 用 HXTFN、HXTBJ、HXTCHS 和HXTCS 表示。

1.2.2 土壤理化因子

土壤pH 值采用酸度計法測定；有機(jī)質(zhì)測定采用重鉻酸鉀氧化-分光光度法；速效鉀測定采用氯化鈣浸提-火焰光度計法；速效磷測定采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法；全氮測定采用凱氏定氮法[13]。

1.2.3 土壤樣品總DNA 提取、PCR 擴(kuò)增及高通量測序

利用FastDNA?Spin Kit for Soil 試劑盒進(jìn)行基因組DNA 提取，擴(kuò)增引物為338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG；806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。PCR擴(kuò)增程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃45 s，27個循環(huán)；72 ℃ 10 min；PCR 產(chǎn)物經(jīng)鑒定、純化、定量和Miseq 文庫構(gòu)建后，利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺進(jìn)行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Trimmomatic[14]軟件對MiSeq 高通量測序得到的Raw Data 的雙端序列數(shù)據(jù)進(jìn)行去雜，使用 FLASH（1.2.11）[15]軟件進(jìn)行拼接。再通過 QIIME（1.9.1）[16]軟件進(jìn)行質(zhì)控和usearch[17]軟件去除嵌合體序列即得到優(yōu)質(zhì)序列。利用Uparse（version 7.1）軟件按照97%相似性對非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行OTU 聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU 的代表序列。采用RDP classifier（version 2.1.1）貝葉斯算法對97%相似水平的OTU 代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并分別在各個分類學(xué)水平上對比Silva（Release132 數(shù)據(jù)庫），統(tǒng)計各樣本的群落物種組成。利用R 軟件生成組間OTU 維恩圖，利用 mothur（1.30.2）軟件計算 α 多樣性指數(shù)[18-20]，利用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生育期水稻根際土壤理化因子

如表1 所示，稻蟹共作田在不同生長時期根際土壤的理化因子都有所變化，成熟期的pH 值最高，與拔節(jié)期差異顯著。分蘗期和拔節(jié)期速效磷的含量與抽穗期和成熟期差異顯著。速效鉀含量隨水稻的生長發(fā)育逐漸降低，有機(jī)質(zhì)和全氮含量都是抽穗期最高且與成熟期差異顯著。

表1 稻蟹共作田不同生育期水稻根際土壤理化因子

2.2 不同生育期根際土壤細(xì)菌群落豐富度和α 多樣性指數(shù)

從表2 可以看出，稻蟹共作田的4個生育期的覆蓋度均超過0.960，接近于1，說明高通量測序到達(dá)一定深度，可以說明結(jié)果的準(zhǔn)確性。稻蟹共作田的4個生育期12個樣本共獲得444 882個有效序列，樣本的有效序列在分蘗、拔節(jié)、抽穗和成熟期分別讀取了28 311 ±3 377、40 166±6 952、44 800±8 099 和 35 017±10 099。獲得6 637個OTU，其中，抽穗期獲得的有效序列數(shù)和OTU 數(shù)均超過另外 3個時期。Chao1 和 Shannon 指數(shù)均可作為α 多樣性指數(shù)的度量指標(biāo)，Chao1 指數(shù)可用來計算菌群豐度，其值越高，代表菌群的豐度值越大，菌群的物種總數(shù)越多；Shannon 指數(shù)是計算菌群多樣性的指數(shù)，其值越大，說明群落多樣性越高。從表2 可以看出，河蟹稻田4個生育期的Chao1 指數(shù)表現(xiàn)為抽穗期＞拔節(jié)期＞成熟期＞分蘗期，Shannon 指數(shù)4個時期差別不大，說明隨著水稻的生長發(fā)育，根際微生物的物種總數(shù)會發(fā)生變化但菌群的多樣性變化不明顯。

表2 稻蟹共作田不同生育期根際土壤細(xì)菌群落豐富度和α 多樣性指數(shù)

2.3 不同生育時期根際土壤細(xì)菌群落比較

圖1 為稻蟹共作田不同生育期PCA 分析圖。PCA分析即為主成分分析，可通過樣本間距離的遠(yuǎn)近來說明細(xì)菌群落的相似性或差異性。PC1 軸和PC2 軸對結(jié)果的解釋度分別為38.33%和19.52%，從圖1 可以看出，拔節(jié)期和抽穗期距離較近，說明細(xì)菌群落相似性較高，它們和分蘗期及成熟期以及分蘗期和成熟期之間都有一定距離，說明隨著水稻的生長發(fā)育，細(xì)菌群落都在發(fā)生變化且有一定差異性。從圖2 可以看出，分蘗期、拔節(jié)期、抽穗期和成熟期的OTU 數(shù)分別為4 690、5 056、5 139 和 5 048。獨(dú)有的 OTU 數(shù)分別為 273、294、264 和 328個。4個時期共有的 OTU 數(shù)是 3 122個。隨著水稻的生長發(fā)育，OTU 數(shù)會增加，物種數(shù)量會增加，到成熟期OTU 數(shù)雖有所下降，但特有的OTU 數(shù)即特有的物種數(shù)最多。

圖1 不同生育期PCA 分析圖

圖2 不同生育期根際土壤細(xì)菌群落OTU 韋恩圖

2.4 不同生育期根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

如圖3 所示，基于高通量測序，所有樣品中綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門(Actinobacteriota)、變形菌門（Proteobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteriota）所占比例較大，分別為 18.96%～28.44%、13.28%～22.90%、12.35%～19.52%和11.43%～14.20%，是稻蟹共作田根際土壤的主要菌群。此外，樣品中還檢測到擬桿菌門（Bacteroidota）、脫硫桿菌門（Desulfobacterota）、厚壁菌門（Firmicutes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirota）、Myxococcota、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）、MBNT15、疣微菌門（Verrucomicrobiota）和髕骨菌門（Patescibacteria）等。綠彎菌門的相對豐度隨著水稻的生長發(fā)育呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，分蘗期最低，抽穗期最高；放線菌門則呈現(xiàn)逐步下降的趨勢，分蘗期最高而成熟期最低；變形菌門是逐漸下降又升高的態(tài)勢，抽穗期最低而成熟期最高；酸桿菌門則呈現(xiàn)先升高又下降的趨勢，分蘗期最低而拔節(jié)期最高；脫硫桿菌門的相對豐度呈現(xiàn)先下降再逐步升高的趨勢，拔節(jié)期最低而成熟期最高；芽單胞菌門的相對豐度在分蘗期最高而成熟期最低；髕骨菌門的相對豐度則在分蘗期最低而成熟期最高。如圖4 所示，樣品中檢測到的優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞1%）有31個。在所有菌屬中norank_f_norank_0_norank_c_KD4-96 的相對豐度最高，其隸屬于綠彎菌門KD4-96 綱，在水稻4個生育時期中，其抽穗期相對豐度最高而成熟期最低。norank_f_norank_0_SBR1031 隸屬于綠彎菌門厭氧繩菌綱，分蘗期的相對豐度最低而抽穗期最高。norank_f_Bacteroidetes_VadinHA17 隸屬于擬桿菌門擬桿菌綱，分蘗期的相對豐度最低而成熟期最高?；跇悠分腥郝湄S度數(shù)據(jù)，運(yùn)用Kruskal-Wallis 秩和檢驗方法檢測不同樣本微生物群落中表現(xiàn)出的豐度差異的物種，結(jié)果顯示，基于細(xì)菌群落門水平上，綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門 (Actinobacteriota)、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）、脫硫桿菌門（Desulfobacterota）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）和髕骨菌門（Patescibacteria）在稻蟹共作田4個生育期內(nèi)的豐度差異顯著（圖5）。在優(yōu)勢菌屬中，norank_f_norank_0_norank_c_KD4 -96、norank_f_norank_0_SBR1031、norank_f_Bacteroidetes_VadinHA17 等3個菌屬的豐度差異顯著（圖 6）。

圖3 不同生育期根際土壤門水平細(xì)菌群落組成

圖4 不同生育期根際土壤屬水平細(xì)菌群落組成

圖5 細(xì)菌群落門水平Kruskal-Wallis 秩和檢驗圖

圖6 細(xì)菌群落屬水平Kruskal-Wallis 秩和檢驗圖

2.5 不同生育期根際土壤PICRUSt 功能預(yù)測

針對KEGG pathway, 運(yùn)用PICRUSt 軟件獲得稻蟹共作田不同生育期根際土壤的3個水平信息及其豐度，Pathway level 1 有 7 條代謝通路，Pathway level 2 有46 條代謝通路，Pathway level 3 有371 條代謝通路。在稻蟹共作田的不同生育期細(xì)菌群落的代謝通路都相似，但代謝通路的豐度值不同。其中有269 條代謝通路的豐度值是抽穗期高于其他3個時期。有50 條代謝通路存在顯著差異（圖7），尤其在氨基酸生物合成（Biosynthesis of amino acids）、 碳 代 謝（Carbon metabolism）、核糖體 （Ribosome）、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)器（ABC transporters）、嘌呤代謝（Purine metabolism）、群體感應(yīng)（Quorum sensing）等方面差異更為顯著，說明抽穗期具有較強(qiáng)的代謝能力。

圖7 代謝通路熱圖

3 討論與結(jié)論

本研究利用Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)通過對16SrRNA 基因的V3～V4 高變區(qū)的測序分析，成功獲得了稻蟹共作田4個生育期根際土壤細(xì)菌群落較全面的菌群信息。樣本共得到444 882個有效序列，6 637個OTUs，測序讀長在401～440 bp 之間，平均測序長度在 415 bp 左右?？煞譃?54個門，171個綱，381個目，600個科，1 028個屬，2 162個種。其中，分蘗期的 OTU數(shù)最少，為4 690個，分別比拔節(jié)期、抽穗期和成熟期減少7.80%、9.57%和7.63%。Venn 圖表明稻蟹共作田4個生育期根際土壤細(xì)菌群落之間共有的OTU 數(shù)是3 122個，分蘗和拔節(jié)期共有的OTU 數(shù)是3 828個，分蘗期和抽穗期共有的OTU 數(shù)是3 901個，分蘗期和成熟期共有的OTU 數(shù)是3 717個，拔節(jié)期和抽穗期共有的OTU 數(shù)是4 121個，抽穗期和成熟期共有的OTU 數(shù)是4 021個，說明抽穗期和拔節(jié)期共有的細(xì)菌類群最多。α多樣性分析表明在稻蟹共作田的4個生育期的Shannon 指數(shù)差異不明顯，抽穗期的Chao1 指數(shù)高于其他3個時期，說明抽穗期的細(xì)菌物種總數(shù)最多而4個時期種群的豐富度差異不大。PCA 分析表明，拔節(jié)期和抽穗期細(xì)菌群落相似度高，但這2個時期和其余2個時期的細(xì)菌群落都有一定差異。

研究表明，植物根際中存在的大量微生物是參與根際微域活動的主要成員[21]。它們和植物相互作用，可調(diào)控土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和豐度的變化[22]。稻蟹共作田不同生育期的土壤根際細(xì)菌優(yōu)勢門（相對豐度＞10%）、優(yōu)勢屬（相對豐度＞1%）基本相同。土壤細(xì)菌優(yōu)勢門（相對豐度＞10%）是綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteriota），優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞1%）有 31個。有研究證實(shí)，稻田中含氮量提升后可使綠彎菌門的豐度上升[23]，稻蟹共作田4個生長時期水稻根際土壤的全氮量是抽穗期最高，綠彎菌門的相對豐度在抽穗期也最高。吳晶[24]研究表明，放線菌門與稻田中速效鉀含量正相關(guān)。本研究中，水稻根際土壤中速效鉀的含量隨著水稻的生長發(fā)育逐漸下降，放線菌門的相對豐度也呈現(xiàn)相同的趨勢，分蘗期豐度最高、成熟期最低。王寧等[25]研究證實(shí)，變形菌門與pH 值正相關(guān)，成熟期的pH 最高，變形菌門的相對豐度也是在成熟期最高。研究證實(shí)，酸桿菌門與pH 值負(fù)相關(guān)[26]，拔節(jié)期的pH 值最低而酸桿菌門在拔節(jié)期的相對豐度最高。

土壤微生物通過參與土壤有機(jī)質(zhì)分解和礦化等過程來影響土壤養(yǎng)分循環(huán)，并調(diào)節(jié)土壤的功能[27]。利用PICRUSt 方法對菌群代謝功能預(yù)測, 稻蟹共作田不同生育期在3個代謝水平通路上都是相似的，有50 條代謝通路存在顯著差異，269 條代謝通路的豐度值是抽穗期高于其他3個時期。高通量測序結(jié)果顯示，抽穗期獲得的有效序列數(shù)、OTU 數(shù)和Chao1 指數(shù)在4個生育時期中最多，說明該時期的物種總數(shù)最多，而且群落門水平的柱形圖顯示，綠彎菌門在抽穗期的豐度最高，研究已證實(shí)綠彎菌的營養(yǎng)方式極為多樣，可涵蓋已知的所有類型?；墚愷B(yǎng)是綠彎菌門微生物的主要營養(yǎng)方式，除此之外還包括化能自養(yǎng)、光能自養(yǎng)、光能異養(yǎng)及混合營養(yǎng)型。同一物種可隨外界條件的改變切換所需要的不同營養(yǎng)模式，因此使得綠彎菌門可以驅(qū)動自身各種代謝與外界物質(zhì)交換來獲取和利用能源、碳源等來參與了C、N、S 等一系列重要生源元素的生物地球化學(xué)循環(huán)過程[28]。所以抽穗期的代謝功能最強(qiáng)。

稻蟹共作田不同生育期水稻根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能分析結(jié)果表明，抽穗期的細(xì)菌物種數(shù)目最多且代謝功能最強(qiáng)。