夏詩琪，陳宜均，李 婷，李康琴，鄧紹勇★

(1.江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌330013；2.國家林業(yè)草原梔子工程技術(shù)研究中心，江西 南昌330013)

植物花粉是攜帶大量的遺傳信息的雄性生殖細(xì)胞，是植物生長、遺傳、變異的基礎(chǔ)[1-2]?；ǚ坌螒B(tài)具有很強的遺傳保守性和穩(wěn)定性，其固有的輪廓，紋飾，萌發(fā)孔數(shù)目、位置等特征反映物種獨特的生物信息，利用這些固有特征進行分類鑒定，具有十分重要的科學(xué)價值[3-4]。國內(nèi)外的許多學(xué)者對肉蓯蓉（Cistanche deserticola）、桉樹（Eucalyptus robusta）、泡桐（Paulownia fortunei）等花粉形態(tài)進行了觀察，為品種的分類鑒定、親緣關(guān)系等提供了數(shù)據(jù)支撐[5-7]?；ǚ哿ｓw積小，單純通過普通光學(xué)顯微鏡無法觀察到花粉的外壁紋飾，而外壁紋飾多樣，是植物分類及鑒定的重要性狀[8-9]。因此具有高分辨率、直觀立體的掃描電鏡是研究花粉形態(tài)的重要工具。用掃描電鏡觀察時，最好用新鮮的花粉制備樣品，但是由于制樣時間長，花粉離體時間太久會影響花粉的微觀形態(tài)[10-11]，因此選用合適的電鏡樣品制備方法尤為重要。通過查閱文獻，常用的電鏡樣品制備方法有常規(guī)生物電鏡制備、直接干燥法制備、導(dǎo)電雙面膠帶拉斷法、新鮮材料直接噴金等。導(dǎo)電雙面膠帶拉斷法可以觀察到花粉內(nèi)部，但是對操作人員的技術(shù)要求嚴(yán)格[12]。新鮮材料直接噴金操作簡單、節(jié)約時間，然而在樣品制備過程中可能影響花粉形態(tài)[13]。常規(guī)生物電鏡制備、直接干燥法制備最常用，因此該研究采用這兩種方法制備樣品，研究兩種不同制樣方法處理的效果，以期為相關(guān)研究人員在花粉電鏡樣品制備方法的選擇上提供參考。

全世界梔子屬(Gardenia)植物約250 種，分布于東半球的熱帶和亞熱帶地區(qū)。我國梔子屬植物種類較少，有6 種、1 變種，其中梔子(G. jasminoides)廣泛分布于長江以南各省區(qū)，其他種野生分布區(qū)極其狹窄。近年來，本課題組采用數(shù)量分類、分子標(biāo)記等方法對梔子屬栽培品種與近緣種進行分類研究[14-15]，然而，目前國內(nèi)幾乎沒有對不同類型梔子花粉的形態(tài)研究。作者以金福水梔（G. jasminoides‘Jinfu’）、狹葉梔子（G. stenophylla）、梔子和荷花梔子（G. jasminoides‘Hehua’）4 種梔子屬植物[16]的花粉為實驗材料，采用常規(guī)生物電鏡制備和直接干燥法制備掃描電鏡樣品，觀察了4 種梔子花粉的微觀形態(tài)，為梔子花粉形態(tài)研究、本屬植物系統(tǒng)分類、親緣關(guān)系和系統(tǒng)演化方式提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

4 種梔子屬植物金福水梔、狹葉梔子、梔子和荷花梔子來自江西省林業(yè)科學(xué)院內(nèi)的梔子種質(zhì)資源基因庫基地。2020年5 月下旬剪取即將開放的4 種梔子屬植物的花枝，帶回實驗室進行隔離水培，待花朵開放后取花粉進行后續(xù)處理。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)生物電鏡樣品處理

取上述4 種梔子的花粉各1 份，分別裝在4 個離心管中, 各加入1.8 mL 戊二醛溶液(2.5%、pH=6.8)，4℃固定過夜；2000 r·min-1離心30 s，去掉上清液；于室溫條件下，用0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液(pH=7)漂洗沉淀物3 次，每次15 min；然后采用乙醇梯度洗脫法將樣品脫水處理（乙醇濃度分別為30%、50%、70%、80%、90%、100%），每個濃度處理15 min；用適量純丙酮處理2 次，每次20 min；樣品在通風(fēng)櫥中吹干去除殘留的丙酮；最后將花粉樣品用濾紙密實包裹，置于干燥器內(nèi)干燥。待花粉完全干燥后，制備電鏡樣品，步驟如下：用大小合適的導(dǎo)電膠帶輕輕粘取少量的花粉，吹掉表面未粘牢的多余花粉，避免花粉堆積影響電鏡觀察。

1.2.2 直接干燥電鏡樣品處理

取金福水梔、狹葉梔子、梔子和荷花梔子4 種梔子的花粉各1 份，將花粉樣品用濾紙密實包裹，于干燥器中干燥。待花粉完全干燥后，制備電鏡樣品，制備步驟同1.2.1。

1.2.3 電鏡觀察

將導(dǎo)電膠未粘住花粉的一面粘在樣品臺上，噴金處理后，用JFC-1600 型掃描電鏡觀察花粉的微觀形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.14 種梔子花粉結(jié)構(gòu)形態(tài)分析

花粉形態(tài)和大小比較：植物花粉可以分為單粒花粉和復(fù)合花粉（包括2 合、4 合、16 合等），梔子屬4 個種的花粉均為四合花粉，呈正四面體緊密排列（圖1）。極面觀可見1 粒在上，3 粒在下（圖1：A3、C3、E3、G3）；赤面觀兩粒在上，2 粒在下（圖1：A4、C4、E4、G4）。4 種梔子花粉四合體縫均較深，單?；ǚ蹫榍蛐位蛘呓蛐?，四合花粉的相鄰單粒花粉孔相連，具3孔，呈120°等距離排列，呈裂縫狀，可見溝內(nèi)有萌發(fā)孔（圖1：C5），孔邊加厚。4 種梔子花粉形態(tài)無明顯差異，但是花粉大小和萌發(fā)孔尺寸有差異。狹葉梔子（39.5～40.4 μm×42.0～43.6 μm）花粉粒最大，其次是荷花梔子（35.2～38.6 μm×39.8～41.8 μm）、梔子（33.2～34.6 μm×36.0～41.6 μm）、金福水梔（35.2～36.0 μm×36.8～38.5 μm）。梔子萌發(fā)孔窄且長，荷花梔子萌發(fā)孔短且寬，金福水梔和狹葉梔子的萌發(fā)孔大小居中。雖然花粉和萌發(fā)孔大小存在差異，但是這種差異不顯著，不足以作為種間和品種間的分類標(biāo)準(zhǔn)。

花粉外壁紋飾差異比較：梔子屬4 個種的花粉雖然在形狀、結(jié)構(gòu)上極為相似，但是外壁紋飾上存在一定差異。在放大1800 倍的掃描電鏡下，可觀察到花粉表面有細(xì)密瘤狀顆粒突起，形狀大小不一（圖1：A5、C5、E5、G5）；梔子花粉外壁瘤狀顆粒較小、致密、均勻，荷花梔子花粉外壁瘤狀顆粒較大、稀疏、不均勻。

總之，這4 種梔子花粉的形狀、結(jié)構(gòu)很相似，具有屬的共同特性。但是在花粉粒大小，萌發(fā)孔的長度和寬度、表面瘤狀顆粒大小上存在差異。本研究認(rèn)為，花粉粒大小、萌發(fā)孔的長度和寬度等差異不顯著，梔子花粉外壁紋飾差異明顯且直觀；外壁紋飾可作為重要的孢粉學(xué)指標(biāo)之一，用于分析梔子屬植物分類情況。

2.2 兩種不同方法處理的效果分析

整體上，可以看到兩種不同方法處理的梔子屬植物花粉結(jié)果存在明顯差異。采用常規(guī)生物電鏡樣品制備方法制備的梔子屬花粉粒飽滿、無皺縮變形，萌發(fā)孔清晰可見，外壁瘤狀顆粒均勻，紋飾明顯（圖1：A1-A5、C1-C5、E1-E5、G1-G5）。采用直接干燥處理的梔子屬花粉粒仍具有四面體結(jié)構(gòu)，極面觀1 粒在上，3 粒在下（圖1：B3、D3、F3、H3），赤面觀2 粒在上，2 粒在下（圖1：B4、D4、F4、H4）。然而單?；ǚ勖黠@塌陷、皺縮、變形，四合體縫加深，萌發(fā)孔由于擠壓呈閉合狀態(tài)，外壁瘤狀顆粒變大、粗糙且不均勻。

圖1 不同方法處理下4 種梔子花粉形態(tài)掃描電鏡結(jié)果Fig. 1 SEM images of pollens of 4 Gardenia species under different treatments

3 討論

被子植物的種類遠(yuǎn)較裸子植物的多，因而花粉類型也更為多樣化，根據(jù)花粉粒的存在形式，有無萌發(fā)孔，以及萌發(fā)孔的形態(tài)、位置、數(shù)目等特征，可分為復(fù)合花粉、具多孔溝、具散孔等十幾種[17]。本研究經(jīng)掃描電鏡觀察，4 種梔子屬植物金福水梔、狹葉梔子、梔子和荷花梔子的花粉形態(tài)為四合花粉，正四面體結(jié)構(gòu)，花粉為近球形或球形，具3 孔，表面具瘤狀顆粒突起，其輪廓形態(tài)特征基本一致。植物花粉形態(tài)通常是由基因控制，受到環(huán)境各因子的影響很小，相對比較穩(wěn)定。本研究4 種梔子花粉外觀形態(tài)無明顯差異，差異體現(xiàn)在花粉大小上，該差異較小，無法作為分類標(biāo)準(zhǔn)，究其原因，一是所測量的種和個體較少，無法代表群體表現(xiàn)，二是電鏡拍攝花粉的極面不完全一致，三是與花粉新鮮程度、處理時間長短、處理方式有關(guān)。然而梔子花粉外壁紋飾差異明顯，可以通過外壁紋飾分析梔子屬植物分類情況。因此，外壁紋飾可作為重要的孢粉學(xué)指標(biāo)之一，這與張雅瓊[18]等人的研究結(jié)果一致。

掃描電鏡由于具有高分辨率，圖像立體直觀等優(yōu)點，已被廣泛運用于植物孢子微觀形態(tài)的觀察[19]。對花粉的干燥處理是樣品制備的關(guān)鍵，直接影響掃描電鏡的結(jié)果。對于某些外壁較厚且含水量低的花粉，采用操作簡單的干燥處理法即可滿足研究需要。而本研究中，相比于常規(guī)生物電鏡樣品制備方法，直接干燥方法處理發(fā)現(xiàn)花粉形態(tài)、萌發(fā)孔、外壁紋飾均有不同程度的變形，會嚴(yán)重影響觀察者對花粉真實形態(tài)及差異性的分析。梔子屬花粉外壁薄且含水量高，直接干燥過程中水分會迅速流失，受到表面張力的作用，其表面結(jié)構(gòu)易發(fā)生塌陷、皺縮和變形[7]。常規(guī)生物電鏡樣品制備方法能將脫離了植物體的花粉及時用戊二醛固定處理，消除表面張力的影響，避免失水變形，以更好的維持花粉的微觀結(jié)構(gòu)[20]。不同種類植物花粉的外壁厚度和含水量差別較大，掃描電鏡樣品制備應(yīng)根據(jù)花粉的自身特性個性化制定，某些壁軟且薄的花粉容易變形，建議大批量制備電鏡樣品前，用常規(guī)生物電鏡樣品制備方法制樣觀察對比有無變形，避免實驗材料的浪費和實驗結(jié)果的誤差。