劉小平，郭崇炎，周 蓉，周勇輝，羅素梅，廖海紅，陶秀花

（1.贛州市蔬菜花卉研究所，江西 贛州 341404；2 贛州市蔬菜花卉種質(zhì)資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 贛州 341404；3.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000；4.江西九連山國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，江西 贛州 341000；5.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，江西 南昌 330299）

銳尖山香圓（Turpinia arguta）為省沽油科（Staphyleaceae）山香圓屬（Turpinia）落葉灌木，高可達(dá)3 m，俗名黃柿、尖樹和五寸鐵樹[1]，常生長于溝谷常綠闊葉林邊緣或灌木叢下，野生分布主要在江西省、廣東省、湖南省和福建省等地[2]。銳尖山香圓性寒味甘苦，具有清熱解毒、利咽消腫的功效，對治療咽喉炎、扁桃體炎和佐劑關(guān)節(jié)炎有顯著療效[3-4]。銳尖山香圓中的總黃酮是其藥效的主要有效成分，其所含的女貞苷和野漆樹苷也具有較強(qiáng)的藥理活性[5]。醫(yī)藥市場上采用銳尖山香圓開發(fā)的產(chǎn)品包括山香圓片、山香圓顆粒和山香圓口服液等，藥材需求量大[3,6]。

目前，學(xué)者們對銳尖山香圓的研究主要集中于其野外自然分布、藥效成分分析和臨床應(yīng)用等方面[7-9]，而關(guān)于其分子生物學(xué)方面的研究報(bào)道則甚少[10]。近十幾年來，以銳尖山香圓為原料的相關(guān)藥用產(chǎn)品不斷開發(fā)，銳尖山香圓野生種質(zhì)資源被掠奪式利用[11]，高產(chǎn)高效新品種卻一直沒有培育出來。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)快速發(fā)展，分子生物遺傳分析和改良也必將運(yùn)用到銳尖山香圓的種質(zhì)資源保護(hù)、遺傳多樣性分析和新品種選育中，而高質(zhì)量基因組DNA 的獲取則是開展銳尖山香圓分子生物學(xué)研究的重要前提。該試驗(yàn)通過對CTAB 法、SDS 法、高鹽低pH 值法和尿素法提取銳尖山香圓DNA 的效果比較研究，獲得了較為理想的銳尖山香圓基因組DNA 提取方法，為銳尖山香圓后續(xù)分子遺傳學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

銳尖山香圓植株綠色健康葉片（江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

離心機(jī)（湖南湘儀）；超微量紫外分光光度計(jì)（賽默飛世爾）；恒溫水浴鍋（上海尚儀）；凝膠成像儀（德國耶拿）；PCR 儀（德國耶拿）；水平電泳儀（北京六一）；移液器（北京大龍）。

所用試劑中DNA Marker、限制性內(nèi)切酶為寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品，Taq Master Mix 為南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品，其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 DNA 提取方法

1.3.1 CTAB 法

參考張宇等[12]的方法，并加以改進(jìn)。取0.1 g 銳尖山香圓葉片用液氮研磨成粉末后立即加入1 mL 65℃預(yù)熱提取緩沖液（2% CTAB、20 mmol·L-1EDTA.Na2、100 mmol·L-1Tris-HCl、1.5 mol·L-1NaCl、2%PVP-30，pH 8.0）和30 μL β-巰基乙醇，漩渦混勻30 s，65℃水浴30 min。12000 r·min-1離心10 min，吸取上清液。向上清液中加入等體積氯仿∶異戊醇（體積比24∶1），漩渦混勻。12000 r·min-1離心10 min，吸取上清液。向上清液中加入等體積－20℃預(yù)冷異丙醇，輕柔混勻，-20℃靜置10 min。12000 r·min-1離心10 min，棄上清液，保留DNA 沉淀。加入700 μL 75%酒精，漂洗DNA 沉淀。12000 r·min-1離心5 min，棄上清液，保留DNA 沉淀。用75%酒精重復(fù)洗滌、沉淀DNA兩次。吹干DNA 沉淀，加入100 μL TE 溶液溶解，放－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 SDS 法

參考楊春霞等[13]的方法，并加以改進(jìn)。取0.1 g 銳尖山香圓葉片加入液氮研磨成粉末后立即加入0.05 g PVP-30 粉末，裝入2 mL 無菌EP 管中，加入1 mL 提取緩沖液（2% SDS、100 mmol·L-1Tris-HCl、50 mmol·L-1EDTA.Na2、1.5 mol·L-1NaCl）和30 μL β-巰基乙醇，混勻，65℃水浴30 min。再加入400 μL 5 mol·L-1乙酸鉀溶液（pH 4.8），混勻，冰水浴10 min。12000 r·min-1離心10 min，取上清液。向上清液中加入等體積氯仿∶異戊醇（體積比24∶1），混勻。12000 r·min-1離心10 min，取上清液。向上清液中加入等體積－20℃預(yù)冷異丙醇，輕柔混勻，－20℃靜置10 min。12000 r·min-1離心10 min，棄上清液，保留DNA 沉淀。加入700 μL 75%酒精，混勻漂洗DNA 沉淀。12000 r·min-1離心5 min，棄上清液，保留DNA 沉淀。用75%酒精重復(fù)洗滌、沉淀DNA 兩次。吹干DNA 沉淀，加入100 μL TE 溶液溶解，放－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 高鹽低pH 值法

參考許理文等[14]的方法，并加以改進(jìn)。取0.1 g 銳尖山香圓葉片，用液氮研磨成細(xì)粉后加入到2 mL 無菌EP 管中。立即加入1 mL 65℃預(yù)熱的提取緩沖液（100 mmol·L-1乙酸鈉溶液、50 mmol·L-1EDTA.Na2、500 mmol·L-1NaCl、2% PVP-30，pH 5.5）和20 μL β-巰基乙醇，漩渦混勻30 s，65℃水浴30 min。12000 r·min-1離心10 min，取上清液。向上清液中加入400 μL 2.5 mol·L-1乙酸鉀溶液（pH4.8），混勻，冰水浴10 min。12000 r·min-1離心10 min，取上清液。向上清液中加入等體積氯仿∶異戊醇（體積比24∶1），混勻。12000 r·min-1離心10 min，取上清液。向上清液中加入等體積的－20℃預(yù)冷異丙醇，輕柔顛倒混勻5 次后－20℃靜置10 min。12000 r·min-1離心10 min，棄上清液，保留DNA 沉淀。加入700 μL 75%酒精，混勻漂洗DNA 沉淀。12000 r·min-1離心5 min，棄上清液，保留DNA 沉淀。用75%酒精重復(fù)洗滌、沉淀DNA 兩次。吹干DNA 沉淀，加入100 μL TE 溶液溶解，放－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 尿素法

參考白雪嵩等[15]的方法，加以改進(jìn)。取樣品0.1 g加入液氮研磨成粉末，裝入2 mL 無菌EP 管中，立即加入1 mL 提取緩沖液（8 mol·L-1尿素、500 mmol·L-1NaCl、50 mmol·L-1Tris-HCl、20 mmol·L-1EDTA.Na2，2% PVP-40，pH 8.0）和20 μL β-巰基乙醇，混勻，65℃水浴30 min。加入400 μL 5 mol·L-1乙酸鉀溶液（pH 4.8），混勻，冰水浴10 min。向上清液中加入等體積氯仿∶異戊醇（體積比24∶1），混勻。12000 r·min-1離心10 min，取上清液。加入等體積－20℃預(yù)冷異丙醇，輕柔混勻多次，－20℃靜置10 min。12000 r·min-1離心10 min，棄上清液，保留DNA 沉淀。加入700 μL 75%酒精，混勻漂洗DNA 沉淀；12000 r·min-1離心5 min，棄上清液，保留DNA 沉淀。用75%酒精重復(fù)洗滌、沉淀DNA 兩次。吹干DNA 沉淀，加入100 μL TE 溶液溶解，放－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DNA 質(zhì)量檢測

1.4.1 DNA 濃度測定

用超微量紫外分光光度計(jì)測定4 種方法所提取基因組DNA 的OD260/280值、OD260/230值和DNA 濃度。采用Statistix 8.0 軟件分析各處理間顯著性差異（標(biāo)記字母法，LSD0.05）。

1.4.2 瓊脂糖凝膠電泳

分別吸取不同方法提取的DNA 樣品6 μL 與6×Loading Buffer 4 μL 混勻，在1%瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣，在1×TAE 緩沖液中120 V 恒壓電泳16 min 后，于凝膠成像儀上觀察并拍照記錄。

1.4.3 DNA 酶切

對4 種不同方法提取的DNA 分別采用EcoR I、Hind III 雙酶切，酶切反應(yīng)體系為：10×M Buffer 2 μL、EcoR I 1 μL、Hind III 1 μL、ddH2O 6 μL、DNA 10 μL。反應(yīng)物輕柔混勻，37℃水浴反應(yīng)2 h。1%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣、電泳檢測，于凝膠成像儀上拍照記錄。

1.4.4 ISSR-PCR 檢測

采用ISSR UBC-807 引物（引物序列：AGAGAG AGAGAGAGAGT）對4 種方法提取DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系按照2×Rapid Taq Master Mix（P222，諾唯贊）說明書配制。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s；55℃復(fù)性15 s；72℃延伸20 s；循環(huán)33 次后，72℃延伸5 min；16℃保存。在1%瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣、電泳檢測，于凝膠成像儀上拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 濃度檢測

從表1 可知，SDS 法、CTAB 法提取的銳尖山香圓DNA OD260/280值分別為1.97、1.98，都在1.9～2.0 之間且兩者無顯著性差異，表明SDS 法、CTAB 法對RNA和蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)去除得比較干凈，DNA 純度較高；高鹽低pH 值法、尿素法提取的DNA OD260/280值分別為1.58、1.69，都小于1.8，表明蛋白質(zhì)、RNA 等大分子雜質(zhì)沒有去除干凈，影響了DNA 純度。SDS 法提取的DNA OD260/230值大于2.0，CTAB 法、高鹽低pH值法和尿素法提取的DNA OD260/230皆小于1.85，說明SDS 法去除小分子、酚類物質(zhì)和鹽等雜質(zhì)的能力比CTAB 法、高鹽低pH 值法和尿素法更強(qiáng)。就DNA 濃度和DNA 產(chǎn)率而言，SDS 法所達(dá)到的值最高，其次為高鹽低pH 值法和CTAB 法，尿素法最低。

表1 4 種方法提取銳尖山香圓基因組DNA 結(jié)果Tab. 1 The results of genomic DNA extracted by four methods

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測

從圖1 可知，SDS 法、CTAB 法、高鹽低pH 值法和尿素法都能成功提取出銳尖山香圓DNA。SDS 法提取的DNA 點(diǎn)樣孔內(nèi)無顯著熒光出現(xiàn)，表明此方法已經(jīng)將大多數(shù)蛋白質(zhì)、糖類和RNA 等雜質(zhì)去除，獲得了較純的DNA；高鹽低pH 值法提取的DNA 點(diǎn)樣孔中有顯著的熒光，說明此方法去除蛋白質(zhì)、糖類和RNA 等雜質(zhì)能力較差。而其他2 種方法提取的DNA點(diǎn)樣孔內(nèi)都出現(xiàn)了一定程度的熒光，說明樣品中還存在一定量的蛋白質(zhì)、RNA 和糖類等雜質(zhì)。這與表1 中檢測結(jié)果相一致。

圖1 4 種方法提取的基因組DNA 瓊脂糖凝膠電泳Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA extracted by four methods

2.3 酶切結(jié)果分析

對SDS 法、CTAB 法、高鹽低pH 值法和尿素法這4 種方法提取的銳尖山香圓基因組DNA 分別進(jìn)行EcoR I、Hind III 雙酶切。圖2 酶切結(jié)果顯示，SDS 法提取的銳尖山香圓基因組DNA 酶切后呈彌散狀，從低于100 bp 到高于2000 bp 之間形成清晰完整的連續(xù)拖帶，條帶最寬，且點(diǎn)樣孔中無熒光，說明該方法提取的DNA 雜質(zhì)含量少，DNA 質(zhì)量最好。CTAB 法提取的DNA 經(jīng)雙酶切、電泳后，條帶呈彌散狀，有完整的連續(xù)拖帶，點(diǎn)樣空內(nèi)無熒光，但條帶寬度小于SDS 法所提取的，說明CTAB 法提取的銳尖山香圓質(zhì)量次之。高鹽低pH 值法和尿素法提取的DNA 酶切后低于750 bp 區(qū)間無顯著連續(xù)拖帶分布，在點(diǎn)樣孔處都有顯著熒光，表明這2 種方法提取的DNA 存在降解現(xiàn)象并含有蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，DNA 質(zhì)量較差。

圖2 4 種方法提取的基因組DNA 雙酶切Fig. 2 Double enzyme digestion of genomic DNA extracted by four methods

2.4 ISSR-PCR 檢測

分別以SDS 法、CTAB 法、高鹽低pH 值法和尿素法提取的山香圓基因組DNA 為模板，用UBC-708引物進(jìn)行ISSR-PCR 擴(kuò)增，電泳跑膠，結(jié)果見圖3?？芍?，4 種方法提取的DNA 經(jīng)ISSR-PCR 擴(kuò)增、電泳后分別都能在2200 bp、1500 bp 和760 bp 左右處各產(chǎn)生1 個(gè)條帶。SDS 法相對另外3 種方法的3 個(gè)條帶都更亮，CTAB 法在2200 bp 和1500 bp 處條帶相對較亮、760 bp 處條帶相對較暗，高鹽低pH 值法和尿素法在2200 bp、1500 bp 和760 bp 左右條帶相對SDS 法、CTAB 法都較暗，表明SDS 法提取效果最好，CTAB 法次之，高鹽低pH 值法和尿素法較差。

圖3 不同提取方法ISSR-PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig. 3 ISSR-PCR amplification results of different extraction methods

3 結(jié)論與討論

該研究采用的4 種方法都能提取出銳尖山香圓基因組DNA，但提取質(zhì)量存在差別。4 種方法中SDS法和CTAB 法OD260/280值都在1.9～2.0 之間，尿素法和高鹽低pH 值法OD260/280值都小于1.8，表明前兩種方法對蛋白質(zhì)和RNA 等大分子雜質(zhì)去除的較干凈，DNA 純度較高，后兩種方法所提DNA 則仍含有大分子雜質(zhì)。4 種方法中僅有SDS 法OD260/230值大于2.0，表明SDS 法去除小分子、酚類物質(zhì)和鹽等雜質(zhì)更為徹底。對DNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測也得出了相同的結(jié)果。4 種方法提取的銳尖山香圓基因組DNA經(jīng)過酶切驗(yàn)證后都能產(chǎn)生酶切條帶、ISSR-PCR 檢測也都能擴(kuò)展出條帶，但酶切和ISSR-PCR 檢測條帶存在差異，表明這4 種方法提取的DNA 雖然都可以進(jìn)行分子生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，但提取質(zhì)量有高低。綜合以上分析可知，不同方法提取銳尖山香圓基因組DNA質(zhì)量從高至低依次為：SDS 法>CTAB 法>尿素法>高鹽低pH 值法。

獲得高質(zhì)量的基因組DNA 是進(jìn)行植物遺傳多樣性、功能基因分析和遺傳育種等分子生物學(xué)研究的重要保障[16]。影響植物DNA 高質(zhì)量提取的因素有很多，主要包括酚類物質(zhì)、色素、多糖和蛋白質(zhì)等，而木本植物葉片中一般富含酚類和多糖等次生產(chǎn)物，因此提取純化植物DNA 的關(guān)鍵在于高效地除去酚類、多糖、蛋白質(zhì)和色素等物質(zhì)[17－18]。本研究中SDS 法提取的銳尖山香圓基因組DNA 濃度最高、純度最好，完全可用于分子生物學(xué)方面的試驗(yàn)。相比于楊春霞等[13]的方法，該研究的SDS 法中直接將PVP-40 粉末與植物樣本粉末立即混合，并顯著提高PVP-40 用量，使PVP 快速充分地絡(luò)合干擾DNA 純度的多酚類物質(zhì)，防止DNA 氧化褐變。在提取緩沖液中提高β-巰基乙醇用量，能防止DNA 斷裂，可以更有效地破壞蛋白質(zhì)中的肽鏈，從而降解植物蛋白質(zhì)、抑制多種酶活性。氯仿/異戊醇抽提也能有效地除去脂類、蛋白質(zhì)雜質(zhì)。提取緩沖液中高濃度的NaCl 有利于去除多糖，再加入高濃度乙酸鉀可以進(jìn)一步防止多糖污染。

該研究對銳尖山香圓葉片基因組DNA 的提取方法進(jìn)行了探索，比較了SDS 法、CTAB 法、高鹽低pH值法和尿素法提取DNA 質(zhì)量的差異。這4 種方法都能不同程度地去除蛋白質(zhì)、多糖和酚類等雜質(zhì)并成功提取出DNA，但SDS 法提取的DNA 質(zhì)量和產(chǎn)率更佳，各項(xiàng)指標(biāo)優(yōu)于其他3 種方法，為后續(xù)銳尖山香圓分子生物學(xué)研究提供參考和借鑒。