侯汪歡，毛惠

（1.西南醫(yī)科大學(xué),四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院產(chǎn)科,四川 瀘州 646000）

0 引言

隨著社會(huì)發(fā)展，在諸多社會(huì)因素的共同作用下，我國(guó)未婚女性數(shù)量逐年遞增，婚前性行為、婚前同居、未婚先孕等行為增加，導(dǎo)致我國(guó)女性遭受意外妊娠、人工流產(chǎn)甚至多次人工流產(chǎn)概率逐年上升。通過中國(guó)衛(wèi)生健康統(tǒng)計(jì)年鑒查閱2019年全國(guó)人工流產(chǎn)人數(shù)達(dá)到976 萬人不等[1]，且部分私人診所、違規(guī)診所接待的人工流產(chǎn)患者未被統(tǒng)計(jì)在內(nèi)。一項(xiàng)對(duì)全國(guó)30個(gè)省市自治區(qū)近300 家醫(yī)院近8 萬人工流產(chǎn)婦女的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，重復(fù)流產(chǎn)比例高達(dá)65.2%[2]。我國(guó)女性的健康在人流率、人流數(shù)雙高的局勢(shì)下遭受到了危害[3]。

相比手術(shù)流產(chǎn)，藥物流產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、安全性高、創(chuàng)傷小、療效顯著、易接受、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，藥物流產(chǎn)的臨床指南表明米非司酮和米索前列醇配伍使用有效率達(dá)95%[4]。流產(chǎn)會(huì)激活局部的炎性細(xì)胞，誘導(dǎo)大量炎癥因子的合成及釋放，如NO、前列腺素等炎癥介質(zhì)以及TNF-α 和 IL-6 等促炎性細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)一系列的炎癥反應(yīng)不利于流產(chǎn)后子宮復(fù)舊，導(dǎo)致陰道異常出血[5]。因此進(jìn)一步探討益母縮宮顆粒能否調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，減輕子宮內(nèi)膜炎癥反應(yīng)，降低藥物流產(chǎn)后感染的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步揭示其作用機(jī)理，為臨床治療藥物流產(chǎn)后子宮異常出血提供合理、適用的手段。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品

益母縮宮顆粒，獨(dú)立小包裝（10g/ 袋），生產(chǎn)批號(hào)：20201204，大鼠用藥劑量按照成人用藥量（30g/d）來計(jì)算。換算后益母縮宮顆粒低、中、高劑量組大鼠灌胃濃度分別對(duì)應(yīng)為：1.56g/(kg·d)、3.13g/(kg·d)、6.25g/(kg·d)。

新生化顆粒，規(guī)格9g/袋，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)：Z2016 3013，成人用量27g/d，換算后新生化顆粒灌胃濃度1.56g/(kg·d)。

米非司酮片，批號(hào)：432005041，規(guī)格25mg/片，華潤(rùn)紫竹藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，灌胃濃度：8.3mg/kg。

米索前列醇片，規(guī)格0.2mg/ 片，產(chǎn)品批號(hào)：43200304，華潤(rùn)紫竹藥業(yè)，灌胃濃度：100μg/kg。

苯巴比妥鈉，規(guī)格0.1g/瓶，生產(chǎn)批號(hào)：190503，上海上藥新亞藥業(yè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑和儀器

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑

一氧化氮測(cè)試盒 貨號(hào)：S0159O-2 南京建成

大鼠TNF-αELISA 試劑盒 貨號(hào)：MM-0180R2江蘇酶免

大鼠IL-6ELISA 試劑盒 貨號(hào)：MM-0190R2江蘇酶免

1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電子分析天平（瑞士PRECISAXB220A）、組織研磨儀器（HF-48，上海凈帆貿(mào)易有限公司）、冷凍離心機(jī)（TGL16M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)）、酶標(biāo)儀（Rayto,RT-6100）、移液槍、-80℃冰箱、4%多聚甲醛固定液、玻片、大鼠灌胃針、燒杯、玻璃棒、滴管、棉球、注射器、解剖固定板、組織剪、眼科剪、鑷子、采血管、采血針、置物架、紗布、無菌手套等。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

均來源于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào) ：SCXK（川）2018-17，選取性成熟SD 雌性大鼠48只，體重220～250g，雄性大鼠20只，體重250～280g，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心忠山動(dòng)物房，許可證號(hào) SYXK（川）2018-065。實(shí)驗(yàn)期間充分供給食物和水源，人工模擬光照（白天和黑夜各12h），動(dòng)物房溫度維持在21℃-23℃，濕度60%±20%。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 不全流產(chǎn)大鼠造模

隨機(jī)挑選出8只未合籠雌性大鼠作為空白組（D 組），剩余雌鼠參照王曉東造模法[6],按照雄鼠：雌鼠=1:2 的比例進(jìn)行合籠，合籠時(shí)間選擇每日下午18:00，次日晨08:00 檢查雌鼠陰栓或陰道涂片，查見陰栓或精子則判定為妊娠第1 天，未孕大鼠繼續(xù)合籠至判定為妊娠。妊娠大鼠于懷孕第 7天上午08:00 灌胃米非司酮（8.3mg/kg），同日下午18:00 灌胃米索前列醇(100μg/kg)，灌胃后于陰道內(nèi)置入1 大小適宜無菌棉球，若造模成功則第二天早晨于雌鼠陰道內(nèi)棉球上可見部分血跡。

2.2 動(dòng)物分組及干預(yù)措施

建模成功后的雌鼠被隨機(jī)分為5 組，分組情況為模型組（E 組）、益母縮宮顆粒低劑量組（A 組）、益母縮宮顆粒中劑量組（B 組）、益母縮宮顆粒高劑量組（C 組）、新生化顆粒組（F 組），每組各8只。其中D、E 組灌胃動(dòng)物飲用水，連續(xù)7 天，余組灌胃對(duì)應(yīng)濃度藥物，連續(xù)7 天。

2.3 標(biāo)本采集

各組大鼠予以相應(yīng)干預(yù)措施處理后，入組第8天予以10%苯巴比妥鈉行腹腔注射麻醉，麻妥后將大鼠固定于解剖板上，消毒完畢后沿腹部正中切開，迅速進(jìn)腹，找到粉紅色 Y 型子宮組織，從卵巢下端至宮頸口處完整離斷子宮，一部分置于4%多聚甲醛固定液中，一部分置于1.5mLEP 管凍存于-80℃冰箱中，對(duì)取材后的標(biāo)本做好標(biāo)注，以便檢測(cè)。

2.4 大鼠子宮組織勻漿NO、TNF-α、IL-6 的檢測(cè)方法

稱取約0.1g 子宮組織，梯度解凍，按照子宮組織（g）：0.9%氯化鈉注射液（mL）=1:9 進(jìn)行冰浴勻漿，離心機(jī)轉(zhuǎn)速3000r/min，溫度4℃，離心10min，取上清液沸水（95-100 ℃）5min 后，于3000r/min再離心5min 后取上清液，置于冰上待測(cè)。嚴(yán)格按照Elisa 試劑盒說明書對(duì)TNF-α、 IL-6 水平進(jìn)行測(cè)定，嚴(yán)格按照硝酸酶還原法試劑盒說明書檢測(cè)子宮組織勻漿中NO 含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。數(shù)據(jù)分布符合正態(tài)性且方差齊性的多組資料采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用 LSD 法進(jìn)行組間比較；腫瘤壞死因子a 數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用秩和檢驗(yàn)法（KrusKal-Wallis檢驗(yàn)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05 則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠子宮組織勻漿NO 含量

與E 組相比，B、C、F 組大鼠子宮組織勻漿中NO 含量明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）,A組大鼠子宮組織勻漿中NO 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（P＞0.05）；與F 組 相 比，A 組 大 鼠子宮組織勻漿中NO 含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），B、C 組大鼠子宮組織勻漿中NO 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2 大鼠子宮組織勻漿TNF-α 含量

與E 組相比，各組大鼠子宮組織勻漿中TNF-α的含量均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與F組相比，A、B 組子宮組織勻漿中TNF-α 的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），C 組子宮組織勻漿中TNF-α 的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠子宮組織勻漿NO 含量(±s)

表1 各組大鼠子宮組織勻漿NO 含量(±s)

注：與D 組 相 比，*P＜0.05，**P＜0.01；與E 組 相 比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與F 組相比，#P＜0.05，##P＜0.01

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表2 各組大鼠子宮組織勻漿TNF-α 含量(±s)

表2 各組大鼠子宮組織勻漿TNF-α 含量(±s)

注：與D 組 相 比，*P＜0.05，**P＜0.01；與E 組 相 比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與F 組相比，#P＜0.05，##P＜0.01

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3.3 大鼠子宮組織勻漿IL-6 水平

與E 組相比，各組大鼠子宮組織勻漿中IL-6含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與F組相比，A、B 組大鼠子宮組織勻漿中IL-6 含量未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），C 組大鼠子宮組織勻漿中IL-6 含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組大鼠子宮組織勻漿IL-6 水平(±s)

表3 各組大鼠子宮組織勻漿IL-6 水平(±s)

注：與D 組 相 比，*P＜0.05，**P＜0.01；與E 組 相 比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與F 組相比，#P＜0.05，##P＜0.01

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研究結(jié)果表明益母縮宮顆粒能降低藥物不全流產(chǎn)大鼠子宮組織勻漿中NO、TNF-α 和IL-6 的水平，與新生化顆粒組相比，益母縮宮顆粒高劑量組TNF-α 和IL-6 降低，表明其改善炎癥因子、減輕炎癥方面效果優(yōu)于新生化顆粒，其治療藥物流產(chǎn)后異常子宮出血的機(jī)制可能與減輕子宮組織炎癥反應(yīng)、防止宮腔感染有關(guān)。

4 討論

藥流后異常子宮出血與宮腔感染密切相關(guān)，長(zhǎng)期反復(fù)陰道流血容易導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、月經(jīng)紊亂、繼發(fā)不孕、貧血、免疫力低下等，在孕早期感染是導(dǎo)致墮胎相關(guān)死亡的最常見的原因[7]。其中在炎癥發(fā)展過程中起到核心作用的是TNF-α，在炎癥初起時(shí)扮演調(diào)節(jié)免疫、提高抗感染能力的免疫調(diào)節(jié)因子的角色，同時(shí)還能扮演誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)、引發(fā)局部炎癥反應(yīng)的促炎因子角色，主要通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生黏附因子產(chǎn)生作用，最終造成子宮組織的損害[8]。參與炎癥反應(yīng)的主要誘導(dǎo)者是IL-6，各組織炎癥的嚴(yán)重程度可以由該項(xiàng)指標(biāo)來反映，主要原理是因其參與了炎癥反應(yīng)毒性作用的催化和放大，從而造成了組織細(xì)胞的損害[9]。

藥物流產(chǎn)后異常子宮出血屬祖國(guó)醫(yī)學(xué)“墮胎下血、產(chǎn)后惡露不絕、胞衣殘留”等診治范疇。益母縮宮顆粒在生化湯基礎(chǔ)上加益母草、枳殼、生蒲黃，增強(qiáng)了行氣止痛、活血化瘀的療效，在前期臨床研究和動(dòng)物研究中均證實(shí)益母縮宮顆粒能夠顯著縮短陰道流血時(shí)間,促進(jìn)蛻膜絨毛組織排出,減輕炎癥,促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)[10]。本研究顯示益母縮宮顆粒能降低子宮組織勻漿NO、TNF-α、IL-6 含量，其治療藥物流產(chǎn)后異常子宮出血的機(jī)制可能與減輕子宮組織炎癥反應(yīng)、防止宮腔感染有關(guān)，其在改善炎癥因子、減輕炎癥方面效果優(yōu)于新生化顆粒，值得在臨床上推廣使用。