謝 芬,孫小春,周美燕,陳向瓊,鄭 旭

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 口腔科,海南 ?？?70102)

牙周炎是由牙周病原菌引發(fā)的牙周組織感染性疾病，是人體失牙的主要因素之一[1-2]。相關(guān)研究表明，牙周炎與2型糖尿病(T2DM)能夠相互促進(jìn)，這是由于T2DM會(huì)在一定程度改變患者口腔免疫功能及微生態(tài)情況[3-6]?；颊啐l下菌斑病原菌最為常見(jiàn)的有具核梭桿菌(Fn)、牙齦卟啉單胞菌(Pg)等，但老年T2DM合并牙周炎患者血糖水平是否能影響其齦下菌斑病原菌情況還未有確切定論[7]。本研究通過(guò)檢測(cè)老年T2DM合并牙周炎患者牙周病原菌情況，分析患者牙周病原菌感染與T2DM的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年4月-2021年9月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的61例單純性牙周炎老年患者作為單純組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者存在明顯的菌斑；(2)出現(xiàn)牙齦炎癥情況；(3)探診深度(PD)≥4 mm，附著喪失≥1 mm。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者存在全身系統(tǒng)性疾病；(2)侵襲性牙周炎；(3)參與本研究前3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)抗生素，或1年內(nèi)實(shí)施基礎(chǔ)牙周治療者。另選取同期37例T2DM合并牙周炎老年患者歸為合并組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L或糖化血紅蛋白(HbAlc)≥6.5%；(2)口服糖耐量試驗(yàn)2 h血糖≥11.1 mmol/L；(3)并符合單純組的其他納入標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有其他全身系統(tǒng)性疾??；(2)哺乳期或妊娠期婦女；(3)參與本研究前3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)抗生素或激素類藥物。兩組患者對(duì)本研究知情且自主同意參與。其中單純組男27例，女34例，年齡65-78(68.47±3.15)歲；合并組男17例，女20例，年齡66-79(68.49±3.18)歲。兩組患者的基線資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究符合并得到本院倫理委員會(huì)審批批準(zhǔn)。

1.2 方法

標(biāo)本采集：使用Gracey無(wú)菌刮治器刮取受檢者上下頜第一磨牙頰舌側(cè)齦下菌斑，將取樣點(diǎn)隔濕后去除齦上菌斑，再以刮治器刮取患者齦下菌斑，并置于PBS緩沖液中，在-80℃狀態(tài)下保存。

細(xì)菌裂解與DNA提?。簩?biāo)本在12 000 rpm下進(jìn)行離心處理，時(shí)間為2 min，棄去上清液，加入20L Proteinase K、180 μl Buffer GL、10 μl RNase A充分振蕩后，在56℃水浴中溫育10 min。加入200 μl乙醇(100%)、200 μl Buffer GB充分混勻，在12 000 rpm下進(jìn)行離心處理，時(shí)間為2 min，棄去濾液；加入500 μl Buffer WA，在12 000 rpm下進(jìn)行離心處理，時(shí)間為1 min，棄去濾液；加入700 μl Buffer WB，在12 000 rpm下進(jìn)行離心處理，時(shí)間為1 min，棄去濾液；再次加入700 μl Buffer WB，在12 000 rpm下進(jìn)行離心處理，時(shí)間為1 min，棄去濾液；12 000 rpm下再次2 min離心處理后，置于1.5 ml離心管，加入200 μl Elution Buffer，于室溫下靜置5 min，于12 000 rpm下離心處理后2 min，洗脫DNA。

引物合成：病原菌印務(wù)來(lái)自16S rRNA對(duì)菌斑總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，包括伴放線放線桿菌(Aa)、直腸彎曲桿菌(Cr)、Fn、Pg、微小消化鏈球菌(Pm)、中間普氏菌(Pi)、變黑普氏菌(Pn)、福塞氏坦氏菌(Tf)，由大連寶生物工程有限公司合成，見(jiàn)表1。

表1 齦下菌斑病原菌引物序列、退火溫度、擴(kuò)增片段

細(xì)菌16SrRNA定性檢測(cè)，多重PCR擴(kuò)增：于50 μl體系Qiagen熱啟動(dòng)PCR中加入10L標(biāo)本。所有PCR反應(yīng)重復(fù)3次。陰性對(duì)照以同體積的三蒸水代替DNA樣品。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組患者齦下菌斑病原菌檢出率對(duì)比

合并組齦下菌斑除Fn外，其余病原菌檢出率高于單純組Aa(24.32%vs.0.00%)、Cr(100.00%vs.81.97%)、Pg(100.00%vs.83.61%)、Pm(29.73%vs.4.92%)、Pi(59.46%vs.37.70%)、Pn(78.38%vs.42.62%)、Tf(94.59%vs.55.74%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組患者齦下菌斑病原菌檢出率對(duì)比[例(%)]

2.2 兩組患者齦下菌斑病原菌數(shù)量對(duì)比

合并組齦下菌斑Aa、Cr、Pg、Pm、Pi、Pn、Tf病原菌數(shù)量高于單純組(P<0.05)，兩組齦下菌斑Fn病原菌數(shù)量對(duì)比無(wú)差異(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組患者齦下菌斑病原菌數(shù)量對(duì)比

2.3 兩組患者HbAlc、FPG水平對(duì)比

合并組HbAlc、FPG水平高于單純組(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 兩組患者HbAlc、FPG水平對(duì)比

2.4 齦下菌斑病原菌數(shù)量與患者HbAlc、FPG水平的相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson分析結(jié)果顯示，Aa、Cr、Pg、Pm、Pi、Pn、Tf數(shù)量與HbAlc水平存在正相關(guān)(r=0.523、0.674、0.406、0.514、0.662、0.447、0.470，P<0.05)，Aa、Cr、Pg、Pm、Pi、Pn、Tf數(shù)量與FPG水平存在正相關(guān)(r=0.679、0.307、0.624、0.450、0.453、0.387、0.695，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 齦下菌斑病原菌數(shù)量與患者HbAlc、FPG水平的相關(guān)性分析

3 討論

牙周炎作為口腔常見(jiàn)疾病之一，患者牙周病原菌及其代謝產(chǎn)物在炎癥反應(yīng)過(guò)程中起到重大作用[8-9]。而T2DM與機(jī)體代謝紊亂存在密切聯(lián)系，且近幾年來(lái)T2DM的患病率在不斷提升，年齡偏大的牙周炎患者患病率也呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，病原菌感染、炎癥反應(yīng)是牙周炎與T2DM相同的病理基礎(chǔ)，因此可能存在雙向促進(jìn)關(guān)系[10-11]。

牙菌斑是一種細(xì)菌性生物膜，齦下菌斑病原菌在牙周炎的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重大作用，牙菌斑生物膜為一種復(fù)雜性生態(tài)群體，有著較為獨(dú)特的病原菌生理學(xué)功能及生物膜結(jié)構(gòu)[12-13]。有相關(guān)研究表明，齦下病原菌的聚集存在一定的規(guī)律，依據(jù)其聚集特點(diǎn)及患者牙周情況，口腔病原菌可按照顏色進(jìn)行分級(jí)，其中Pg、Tf等為紅色復(fù)合體，在牙周炎的發(fā)展過(guò)程中息息相關(guān)，而橙色第二復(fù)合體包括Fn牙周亞種、Pm、Pi、Pn等，也均參與牙周炎的發(fā)展[14-15]。齦下病原菌的優(yōu)勢(shì)菌主要以革蘭陰性厭氧菌，如Cr、Pg、Pi、Tf等，病原菌在患者牙周袋內(nèi)形成，最后致使牙周炎的發(fā)生[16-17]。本研究結(jié)果顯示，雖兩組齦下菌斑Fn病原菌檢出率對(duì)比無(wú)差異(P>0.05)，但其余病原菌檢出率高于單純組Aa(24.32%vs.0.00%)、Cr(100.00%vs.81.97%)、Pg(100.00%vs.83.61%)、Pm(29.73%vs.4.92%)、Pi(59.46%vs.37.70%)、Pn(78.38%vs.42.62%)、Tf(94.59%vs.55.74%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明老年T2DM合并牙周炎患者多數(shù)齦下菌斑病原菌檢出率更高，提示患者出現(xiàn)T2DM可能與牙周炎存在相互促進(jìn)作用，這是由于牙周病原菌可從損傷的牙周袋內(nèi)壁進(jìn)入機(jī)體血液循環(huán)或其他器官，進(jìn)而導(dǎo)致血管發(fā)生炎癥反應(yīng)，刺激牙周膜上的成纖維細(xì)胞分泌更多的炎癥因子，進(jìn)而通過(guò)體循環(huán)運(yùn)送至機(jī)體各處，影響患者血糖血脂的正常代謝[18-19]。

孟琳[20]等學(xué)者的研究探討牙周炎合并T2DM患者血清炎性因子、糖脂代謝的變化，結(jié)果顯示牙周炎伴T2DM患者FPG、空腹胰島素(Fins)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)水平與PD SBI水平存在正相關(guān)(r=0.533、0.574、0.649、0.628、0.594、0.614、0.633、0.671，P<0.05)。而本研究通過(guò)檢測(cè)兩組齦下菌斑病原菌數(shù)量及HbAlc、FPG水平，探討牙周病原菌與T2DM的關(guān)系，結(jié)果顯示，合并組齦下菌斑Aa、Cr、Pg、Pm、Pi、Pn、Tf病原菌數(shù)量及HbAlc、FPG水平均高于單純組(P<0.05)，再經(jīng)Pearson分析結(jié)果顯示，Aa、Cr、Pg、Pm、Pi、Pn、Tf數(shù)量與HbAlc水平存在正相關(guān)(r=0.523、0.674、0.406、0.514、0.662、0.447、0.470，P<0.05)，Aa、Cr、Pg、Pm、Pi、Pn、Tf數(shù)量與FPG水平存在正相關(guān)(r=0.679、0.307、0.624、0.450、0.453、0.387、0.695，P<0.05)，提示老年T2DM合并牙周炎患者齦下菌斑病原菌與其血糖水平存在明顯相關(guān)性，患者血糖水平越高，其病原菌越多，出現(xiàn)牙周炎的幾率就越大。這是由于T2DM為一種先天性免疫性疾病，而炎癥反應(yīng)在該病的發(fā)病機(jī)制中起著媒介作用，炎癥又是牙周炎的啟動(dòng)因子，并可通過(guò)胰島素受體活性的抑制加重牙周炎[21-22]。

綜上所述，老年T2DM合并牙周炎患者相較于單純牙周炎患者具有更高的齦下菌斑病原菌檢出率，且多數(shù)病原菌數(shù)量較高，其病原菌數(shù)量與患者血糖水平存在明顯相關(guān)性，說(shuō)明血糖水平能影響老年牙周炎患者病原菌情況，為臨床診治提供一定依據(jù)。