李 炯

(河北圣雪大成唐山制藥有限責(zé)任公司，河北 唐山 064000)

硫酸粘桿菌素E(Colistinsulfate)又名多粘菌素E(PolymyxinE)，是由多粘芽孢桿菌產(chǎn)生的一組多肽類抗生素[1-5]。臨床上多粘菌素E主要用于革蘭陰性菌感染的治療，多粘菌素E是最有發(fā)展前途的抗菌素之一[6-15]。

優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方是提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物收率的重要手段，在實際生產(chǎn)中影響多粘菌素E發(fā)酵的因素復(fù)雜多變，合理的試驗設(shè)計和優(yōu)化方法對于確定發(fā)酵培養(yǎng)基配方尤為重要。發(fā)酵過程的控制以及優(yōu)化技術(shù)是發(fā)酵工業(yè)的中游技術(shù)核心，它不僅決定著能否實現(xiàn)菌種的最大生產(chǎn)能力，而且影響著下游的處理難度[21]。

發(fā)酵水平的提高，除了依靠培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化外，參數(shù)控制也至關(guān)重要。本研究旨在對其發(fā)酵的影響因素和提高其發(fā)酵單位的方法進(jìn)行研究，優(yōu)化發(fā)酵過程工藝控制，實現(xiàn)在現(xiàn)有設(shè)備條件下發(fā)酵單位的提升，增強(qiáng)產(chǎn)品競爭力。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：XDW 25/96型恒溫生物搖床，Waters e2695-2489高效液相色譜儀型，PHS-3C型精密酸度計，752型紫外分光光度計，D-37520型高速離心機(jī)，VS-1300U型超凈工作臺，MLS-3780型全自動高壓滅菌鍋。

試劑：葡萄糖，F(xiàn)eSO4·7H2O，(NH4)2SO4，CaCO3，KH2PO4等，均為分析純。

菌種：多粘芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)JZ-03-059，為公司自選菌種，保存在甘油冷凍管中。

1.2 搖瓶發(fā)酵

活化菌液制備：取冷凍管中的菌液接種到活化培養(yǎng)基中(接種量1%)，31 ℃條件下培養(yǎng)13 h。

種子液制備：取活化菌液接種到種子培養(yǎng)基中(接種量0.2%)，31 ℃條件下培養(yǎng)15 h。

發(fā)酵：將40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基倒入250 mL三角瓶中，再加入種子液(接種量為1%～10%)，在溫度(32±0.5)℃、轉(zhuǎn)速200 r/min條件下，搖瓶培養(yǎng)70～75 h。培養(yǎng)基名稱和配方見表1。

表1 培養(yǎng)基名稱和配方Table 1 Formulation of the culture medium

1.3 7 L發(fā)酵罐發(fā)酵過程

發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方：葡萄糖35 g/L，豆粉24 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4 g/L，(NH4)2SO425.0 g/L，CaCO317.8 g/L，KH2PO40.8 g/L，消泡劑2.1 g/L。

發(fā)酵罐培養(yǎng)條件：裝液量4 L，接種量0.5%～1%，溫度(31.5±0.5)℃，罐壓0.03～0.05 MPa，通氣比1～1.45 vvm(vvm指每分鐘通氣量與罐體實際料液體積的比值)，發(fā)酵周期為70～75 h。

7 L發(fā)酵罐流加補(bǔ)料優(yōu)化發(fā)酵工藝：將葡萄糖從基礎(chǔ)料一次投入改為過程流加，其余條件和分批發(fā)酵過程相同。

1.4 物質(zhì)的提取和檢測

殘?zhí)堑臏y定：取2.5 mL的樣品，加水稀釋至50 mL，搖勻，過濾；取1 mL此混合液到試管中，加1 mL DNS試劑，搖勻，水浴5 min，冷卻后加水10 mL，搖勻，在540 nm處比色，同時用水做空白，用0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液作對照。其中DNS試劑的配制方法：稱取氫氧化鈉3.2 g，加適量水使之溶解，稱60 g酒石酸鉀鈉溶于其中，至完全溶解后加入3,5-二硝基水楊酸2 g，微熱使之溶解，定容到200 mL，搖勻。

殘氮的測定：取適量樣品的離心液至250 mL的錐形瓶中，加入15 mL的水，搖勻后加2滴甲基紅；用0.5 mol/L的硫酸將溶液調(diào)至紅色，用0.02 mol/L氫氧化鈉溶液滴定至紅色消失；加入5 mL 18%的中性甲醛，搖勻，放置5 min；加酚酞5滴，用氫氧化鈉滴定液滴定至微紅色即為終點。

效價的測定：取適量樣品，用0.05 mol/L硫酸稀釋，過濾后即可用高效液相色譜檢測。液相色譜檢測條件：150 mm×4.6 mm 的C18色譜柱；流動相為4.46 g/L硫酸鈉水溶液(磷酸調(diào)pH為2.4)∶乙腈(V/V)=78∶22；檢測波長215 nm。

樣品的效價=(工作對照品的質(zhì)量×工作對照品的效價÷工作對照品E1、E2峰的峰面積和÷50)×樣品的E1、E2峰的峰面積和×樣品的稀釋倍數(shù)。

溶氧的測定：將溶氧電極探頭沒入發(fā)酵罐中在線監(jiān)測。在發(fā)酵培養(yǎng)基中通入空氣至溶氧飽和，此時溶氧為100%，發(fā)酵過程中的溶氧為相對于飽和溶氧濃度的相對含量。

二氧化碳釋放速率計算：采用串聯(lián)式氣體分析儀(Magellan instruments, Tzndem PRO)在線記錄發(fā)酵罐排氣管道中尾氣的CO2含量，并通過公式(1)[22]計算二氧化碳釋放速率。

(1)

式中：CER——CO2釋放速率，mmol/(L·h)；Fa,i——通入空氣在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的所對應(yīng)的體積流量，m3/h；V——發(fā)酵液所占的體積，m3；φ(CO2)i——通入的空氣中CO2占總空氣的體積分?jǐn)?shù)；φ(CO2)o——排出的空氣中CO2占總排氣的體積分?jǐn)?shù)。

2 試驗結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過程控制參數(shù)

溶氧濃度、攪拌速率是有氧發(fā)酵過程的關(guān)鍵參數(shù)，這2個參數(shù)的變化直接影響產(chǎn)量和成本。多粘芽孢桿菌是好氧微生物，對溶氧有較高的需求；但其在不同生產(chǎn)階段對溶氧的需求并不相同，且差別較大。因此，依據(jù)多粘芽孢桿菌的生理特性，合理調(diào)控發(fā)酵過程各個階段的溶氧濃度，對于多粘菌素發(fā)酵效價的提升、能耗的降低來說具有重大意義[23]。在實際生產(chǎn)過程中，設(shè)備條件一定，可通過調(diào)整攪拌速率和通空氣量來增加氧傳遞系數(shù)，同時增加剪切力。因此研究菌種對溶氧的需求和對剪切力的敏感性尤為必要[24]。

2.1.1 裝液量對多粘菌素E發(fā)酵的影響

分別取10、20、30、40、50 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基置于250 mL搖瓶內(nèi)，接種，發(fā)酵48 h后，對發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行效價測定，試驗結(jié)果如圖1所示。

圖1 裝液量對效價的影響Fig. 1 Effect of loading volume on titer

從圖1可看出，效價隨裝液量的增加而增加，當(dāng)裝液量增加至40 mL時，效價達(dá)到最大值，隨后效價隨裝液量的增加而減小。在裝液量為40 mL/250 mL時，效價從最初的4.70×104U/mL上升至6.53×104U/mL。因此可確定裝液量40 mL/250 mL為多粘芽孢桿菌素E產(chǎn)生的最佳裝液量。而裝液量在一定程度上可以代表溶氧水平，因此在后續(xù)發(fā)酵過程中，應(yīng)將溶氧控制在合適的水平。

2.1.2 剪切力對多粘菌素E發(fā)酵的影響

在搖瓶發(fā)酵中，添加玻璃珠數(shù)越多，對菌體的剪切力越大?？梢酝ㄟ^在搖瓶中加入玻璃珠的方式，模擬發(fā)酵罐中由于機(jī)械攪拌帶來的剪切力對發(fā)酵過程的影響。

通過在搖瓶中加入6 mm的不同數(shù)量的玻璃珠(0、15、45、77顆)，產(chǎn)生不同剪切力進(jìn)行試驗，結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯觯S著玻璃珠數(shù)的增加(即剪切力的增大)，效價逐漸降低；當(dāng)達(dá)到45顆玻璃珠時，效價下降94%。在多粘菌素E發(fā)酵過程中，菌體對剪切力很敏感。

圖2 剪切力對效價的影響Fig. 2 Effect of the number of glass beads on titer

2.2 7 L玻璃罐分批發(fā)酵過程研究

多粘芽孢桿菌JZ-03-043凍存菌液經(jīng)種瓶培養(yǎng)后，接入7 L發(fā)酵罐，在通氣比1∶1 vvm的條件下，分別在200、300、450、530、700、1 000 rpm起始轉(zhuǎn)速下，測定發(fā)酵過程中的溶氧、效價，并觀察菌體形態(tài)。根據(jù)多尺度過程優(yōu)化原理[25-26]，采用串聯(lián)式氣體分析儀進(jìn)行尾氣分析，確定發(fā)酵過程的臨界氧濃度，并通過7 L罐分批發(fā)酵加以驗證。

2.2.1 攪拌轉(zhuǎn)速對效價和相對溶氧的影響

在7 L發(fā)酵罐間歇發(fā)酵過程中(28 h)，調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速，研究轉(zhuǎn)速對效價和相對溶氧的影響，結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯?，隨著攪拌轉(zhuǎn)速的提高，相對溶氧逐漸提高，效價則呈現(xiàn)先增后減的趨勢；攪拌轉(zhuǎn)速為530 rpm時，效價達(dá)18.8×104U/mL，相對溶氧在23%左右，基本滿足多粘芽孢桿菌生長需要；繼續(xù)增大攪拌轉(zhuǎn)速，效價下降，此時剪切力的抑制作用成為主導(dǎo)，高于提高溶氧產(chǎn)生的促進(jìn)作用。為確保攪拌剪切力處于菌體生長可承受的范圍內(nèi)，確定攪拌轉(zhuǎn)速以530 rpm為宜。

圖3 攪拌轉(zhuǎn)速對效價和溶氧的影響Fig. 3 Effect of stirring speed on titer and dissolved oxygen

2.2.2 發(fā)酵周期對相對溶氧、CER、效價的影響

發(fā)酵周期對相對溶氧、CER、效價的影響如圖4所示。可以看出，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，相對溶氧逐漸降低，CER、效價逐漸升高，說明這時菌體在大量生長，是菌體的快速生長期，并開始合成多粘菌素E；溶氧低于20%后繼續(xù)下降，同時CER也在下降，即出現(xiàn)順峰現(xiàn)象；而后溶氧緩慢上升，CER曲線也開始上升。根據(jù)多尺度過程優(yōu)化理論和供氧需氧平衡，確定臨界相對溶氧濃度以20%為宜。

圖4 發(fā)酵周期對溶氧、CER、效價的影響Fig. 4 Effect of the fermentation cycle on dissolved oxygen, CER and titer

為了保持相對溶氧在臨界氧濃度以上，通過控制攪拌轉(zhuǎn)速來控制發(fā)酵過程的相對溶氧水平。當(dāng)全程控制相對溶氧在20%以上時，發(fā)酵周期對相對溶氧、CER、效價的影響如圖5所示?？梢钥闯觯谌苎醯陀?0%時，增加轉(zhuǎn)速，沒有出現(xiàn)圖4中的“順峰”現(xiàn)象，CER曲線逐漸上升，發(fā)酵單位明顯增高。結(jié)果顯示增加攪拌轉(zhuǎn)速沒有對菌體生長和多粘菌素發(fā)酵產(chǎn)生明顯影響，即當(dāng)菌體大量生長后，菌體對剪切力的敏感程度大大降低。

圖5 發(fā)酵周期對相對溶氧、CER、效價的影響(相對溶氧20%以上)Fig. 5 Effect of the fermentation cycle on dissolved oxygen,CER and titer(dissolved oxygen is above 20%)

2.2.3 發(fā)酵過程中殘?zhí)呛蜌埖?/p>

發(fā)酵過程中殘?zhí)呛蜌埖€如圖6所示?？梢钥闯觯S著糖耗增加，效價增長幅度也在增加；但當(dāng)殘?zhí)堑陀?.0 g/100 mL時，效價漲幅明顯減慢。此外，整個發(fā)酵過程中氨氮基本處于430～450 mg/100 mL范圍內(nèi)。

圖6 發(fā)酵過程中殘?zhí)恰埖托rFig. 6 Residual sugar, residual nitrogen and titer during fermentation

2.3 7 L發(fā)酵罐流加補(bǔ)料優(yōu)化發(fā)酵工藝

在7 L玻璃罐、分批式發(fā)酵基礎(chǔ)上進(jìn)行補(bǔ)料工藝改進(jìn)，并選擇適當(dāng)?shù)难a(bǔ)料策略及補(bǔ)料時機(jī)以提高產(chǎn)品效價。通過研究確定攪拌轉(zhuǎn)速、溶氧控制水平和補(bǔ)料控制指標(biāo)等參數(shù)，為進(jìn)行放大生產(chǎn)積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

根據(jù)2個最大化理論(曲線面積下菌體濃度最大和曲線面積下發(fā)酵體積最大)，在保證供氧與需氧平衡、營養(yǎng)物質(zhì)的消耗與供給平衡、菌體比生長速率與稀釋率平衡的基礎(chǔ)上，應(yīng)用補(bǔ)料工藝能夠有效提升發(fā)酵水平。補(bǔ)料帶來的稀釋作用既能解除底物、產(chǎn)物抑制以及產(chǎn)物分解阻遏效應(yīng)；也能避免間歇發(fā)酵時，因一次性補(bǔ)加量過大使得細(xì)胞生長迅速而引起的不利影響[27]。流加補(bǔ)料發(fā)酵還能延長微生物處于穩(wěn)定期的時間，有利于產(chǎn)物的積累。結(jié)合多尺度過程優(yōu)化原理與方法，通過對發(fā)酵尾氣進(jìn)行分析來優(yōu)化補(bǔ)料過程[28]。

由于多粘菌素E補(bǔ)料發(fā)酵主要是將葡萄糖從基礎(chǔ)料一次投入改為過程流加，因此需要控制過程中的殘?zhí)撬讲趴扇〉煤玫男Ч?。補(bǔ)料發(fā)酵過程中殘?zhí)撬脚c發(fā)酵效價的關(guān)系如圖7所示?？梢钥闯?，殘?zhí)强刂圃?.5 g/100 mL以下時，隨著殘?zhí)强刂扑教岣?，發(fā)酵單位、效價漲幅均提高；而殘?zhí)强刂圃?.5 g/100 mL以上時，隨著殘?zhí)强刂扑教岣?，發(fā)酵單位、效價漲幅則逐漸降低；殘?zhí)强刂圃?.1 g/100 mL時，發(fā)酵單位、效價漲幅均為最低；當(dāng)殘?zhí)强刂圃?.5 g/100 mL時，發(fā)酵效價漲幅達(dá)到了37.5×104U/mL，為最高。所以，殘?zhí)强刂圃?.5 g/100 mL為宜。

圖7 補(bǔ)料發(fā)酵過程中殘?zhí)强刂扑脚c效價的關(guān)系Fig. 7 The relationship between residual sugar levels and titer during filling fermentation

3 結(jié)論

粘菌素E的發(fā)酵不需要太高的溶氧，但溶氧過低時影響發(fā)酵效價，且對剪切力較為敏感。在7 L發(fā)酵罐、相對溶氧高于20%、殘?zhí)窃?.5 g/100 mL條件下發(fā)酵，效價最高，達(dá)到37.5×104U/mL。本研究實現(xiàn)了粘菌素E的高產(chǎn)，并對微生物發(fā)酵工藝的改良具有指導(dǎo)意義。