楊 晨

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，浙江 杭州 310000）

斑馬魚由于體積小，身體幾乎是透明的，性成熟快，易繁殖等優(yōu)勢，越來越多地應(yīng)用于基因組學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、功能組學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、毒理學(xué)研究等，成為科研工作者的重要模式生物選擇[1-3]。目前有關(guān)斑馬魚的研究主要集中在成年斑馬的魚鰓、端腦、中腦、腸道、心臟、動脈球組織和肝等組織結(jié)構(gòu)[4-8]，而關(guān)于斑馬魚胚胎眼睛組織結(jié)構(gòu)的研究還鮮見報(bào)道。斑馬魚的眼睛在形態(tài)發(fā)育、解剖學(xué)結(jié)構(gòu)及功能學(xué)等方面與人類存在著很大的相似性，并具有易于繁殖、生長發(fā)育較快、眼睛較大、易于觀察等優(yōu)勢，因此，斑馬魚成了研究人類眼睛發(fā)育和眼睛疾病的一種理想模式生物[9]。斑馬魚胚胎眼睛作為理想的眼病動物模型，對了解眼睛疾病的發(fā)病機(jī)制和研發(fā)治療藥物具有重要的參考價值。本實(shí)驗(yàn)制作了斑馬魚胚胎眼睛石蠟組織切片，并且采集光鏡圖譜進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)比較分析，旨在為斑馬魚胚胎的形態(tài)學(xué)及相關(guān)研究提供技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對象

本文分享的案例實(shí)驗(yàn)中所用為野生型斑馬魚（Danio rerio）AB 品系，保持14h/10h 光暗周期循環(huán)條件，雌雄魚交配產(chǎn)生的受精卵在魚水（0.33g/L 海鹽）（30%Dan ieau buffer），28.5℃恒溫箱培養(yǎng)，繼續(xù)飼養(yǎng)至受孕后120 h（hour post-fertilization，120hpf）。

1.1.2 試劑與器材

甲醛（分析純，國藥），無水乙醇（分析純，國藥），二甲苯（AR，國藥），石蠟（60-62℃（滬試），國藥），蘇木素染色液（蘇木素2.5g，純乙醇25mL,鉀明礬50g，蒸餾水500mL，氧化汞1.25g，冰醋酸20 mL），伊紅染色液（伊紅Y0.25g，蒸餾水100mL，冰醋酸50μL），鹽酸乙醇分化液（70%乙醇100mL 內(nèi)加入1mL 濃鹽酸混勻即可）；真空脫水機(jī)（ASP 200S型，徠卡），石蠟包埋機(jī)（Leica EG 1150，徠卡），石蠟切片機(jī)（RM 2235 型，徠卡），Leica 自動封片機(jī)（CV 5030 型，徠卡），體式顯微鏡（Nikon SMZ18），自制玻璃彎勾（此工具為玻璃電極吹制而成，具有很細(xì)的彎勾），正置熒光顯微鏡（Leica DM 4000）。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片的制作流程

固定和脫水：將收集到的斑馬魚胚胎在4%甲醛溶液中室溫固定24h。固定完成后，將斑馬魚胚胎小心取出，用擦鏡紙包裹好放入包埋盒內(nèi)，自來水沖洗，放在脫水機(jī)內(nèi)進(jìn)行脫水、透明、浸蠟，程序依次為：70%乙醇，1h →85%乙醇，2h →95%乙醇，2h →95%乙醇，2h →無水乙醇Ⅰ，4h →無水乙醇Ⅱ，4h →二甲苯Ⅰ，30min →二甲苯Ⅱ，30min →二甲苯Ⅲ，1h →石蠟Ⅰ、62℃，1h →石蠟Ⅱ、62℃，3h →石蠟Ⅲ、62℃，4h。

蠟塊包埋：將樣本取出放入熱蠟中，取不銹鋼小底模具置于熱臺上，借助體式顯微鏡進(jìn)行觀察，將斑馬魚頭部沖下進(jìn)行包埋，使用自制玻璃彎勾不斷調(diào)整斑馬魚方向，直至其頭部與模具底部垂直，輕輕將模具轉(zhuǎn)移至冷臺，等待石蠟冷卻，包埋完成。

切片：將包埋好的蠟塊固定在切片機(jī)上，切片厚度設(shè)置為3μm，修掉多余的石蠟，借助體式顯微鏡觀察，調(diào)整樣本固定角度。切片結(jié)束后，將切片放到60℃烘箱內(nèi)過夜烤片。

圖1 正常120 hpf 斑馬魚胚胎圖（A：比例尺示500μm；B：比例尺示100μm）

表1 石蠟切片的脫蠟、染色、脫水和透明過程

1.2.2 斑馬魚胚胎眼睛石蠟切片的HE 染色步驟

石蠟切片依次經(jīng)過脫蠟、水化、HE 染色、脫水、透明等步驟完成染色，具體如下：

脫蠟：切片60℃干烤過夜后，進(jìn)入二甲苯進(jìn)行脫蠟，二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各10min；然后進(jìn)行水化：無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各1min，蒸餾水3min；蘇木素-伊紅染色過程如下：蘇木素染液染色5min，自來水藍(lán)化5min，鹽酸酒精分化液分化5s，流水沖洗10min，蒸餾水3min，伊紅染液染色2min →水洗。

脫水和透明：75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ梯度脫水1min；隨后二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各1min。最后用全自動封片機(jī)常規(guī)封片，并使用正置顯微鏡觀察和采集切片圖像。

2 結(jié)果

2.1 石蠟切片的質(zhì)量

圖2 顯示：石蠟切片完整，薄厚均勻一致，沒有褶皺和刀痕，沒有裂痕和破損；清晰顯示了組織的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)。

圖2 正常120hpf 斑馬魚胚胎眼睛切片HE 染色圖（比例尺：50μm）

2.2 切片的染色情況和染色結(jié)果分析

通過不斷調(diào)整，我們制作出結(jié)構(gòu)清晰的眼睛HE 切片（圖3）。圖中標(biāo)注的結(jié)構(gòu)依次為：晶狀體（Lens），視神經(jīng)（optic nerve，ON），視網(wǎng)膜色素層（retinal pigment epithelia，RPE），外核細(xì)胞層（outer nuclear layer，ONL），內(nèi)核細(xì)胞層（inner nuclear layer，INL），內(nèi)網(wǎng)層（inner plexiform layer，IPL)，背部邊緣區(qū)（dorsal marginal zone，dMZ），腹部邊緣區(qū)（ventral marginal zone，vMZ）以及視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層（ganglion cell layer，GCL）。

圖3 受孕后120h 斑馬魚胚胎眼睛切片HE 染色圖（比例尺：50μm）

染色后細(xì)胞核質(zhì)分明，染色對比度好，透明潔凈等要求，能夠保持細(xì)胞間的正常相互關(guān)系，清晰顯示組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，真實(shí)地展示組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。

3 討論

斑馬魚胚胎體型小，身體透明度高，脫水處理后體積更小，包埋難度大，需要借助體式顯微鏡進(jìn)行放大后才能有效地確立滿意的包埋方向，完成胚胎包埋。由于組織體積的特殊性和眼睛切片要求的高難度，樣本數(shù)量需要準(zhǔn)備多一點(diǎn)，包埋和切片工作還要求技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)，更需要耐心。另外，包埋過程中，對溫度的要求很高，在調(diào)整好包埋方向之前，需要將樣本一直放置在熱臺上，保持62℃，防止石蠟遇冷凝固。稱手的彎頭玻璃勾有個很細(xì)的尖頭，很適合用來調(diào)整胚胎的包埋方向，當(dāng)然大家也可以嘗試其他有尖頭的工具。至于修片，當(dāng)修出組織后，及時調(diào)整切片厚度，避免組織過多地被修掉。

斑馬魚胚胎眼睛切片的制作好壞與質(zhì)量，直接關(guān)系到后續(xù)的HE 染色以及免疫熒光等實(shí)驗(yàn)效果。染色需要通過在鏡下觀察染色效果進(jìn)行調(diào)整，以保證染色質(zhì)量。對于脫水后體長只有幾毫米的斑馬魚胚胎，正常斑馬魚胚胎眼睛最大直徑只有180 微米，切片難度可想而知[10]。

我們通過不斷測試，摸索出一套實(shí)用的切片和染色方法，希望能夠?yàn)閺氖掳唏R魚胚胎眼睛石蠟切片的研究者提供參考。