張福壽，王鶴鳴，王 利

(商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 商丘 476100)

仔豬輪狀病毒性腹瀉是由豬輪狀病毒引起的仔豬感染[1]，是仔豬常見的一種傳染病.感染仔豬常出現(xiàn)急性胃腸炎癥狀，主要表現(xiàn)為厭食、嘔吐、腹瀉、脫水等.仔豬發(fā)病后往往呈現(xiàn)出混合交叉感染的特點(diǎn).該病對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的威脅與危害，引起了人們的高度重視.目前，關(guān)于仔豬輪狀病毒性腹瀉的治療尚無特殊藥物，主要采取對癥治療及疫苗預(yù)防方法[2].在預(yù)防和治療時(shí)，疫苗的保護(hù)率不高，有時(shí)還有副作用，對癥治療往往不能有效控制仔豬腹瀉.有關(guān)研究表明，佩蘭有抗炎、抑菌作用，對輪狀病毒性腸炎、腹瀉有較好的治療和保護(hù)作用[3].本文通過對仔豬進(jìn)行人工感染豬輪狀病毒，模擬豬輪狀病毒仔豬腹瀉，使用佩蘭揮發(fā)油進(jìn)行治療試驗(yàn)，以期獲得仔豬輪狀病毒性腹瀉的中醫(yī)藥治療方案.

1 材料

1.1 中藥佩蘭

中藥佩蘭自安徽亳州中藥市場采購，為地上莖桿，含部分葉.佩蘭揮發(fā)油由商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥物分析實(shí)訓(xùn)室制備.

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

28日齡三元雜交斷奶仔豬(杜洛克×長白×大約克夏)40頭，已去勢，購買于商丘市梁園區(qū)富有養(yǎng)豬場.

1.3 試驗(yàn)毒株

豬輪狀病毒，由商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)訓(xùn)室提供.該病毒系從某豬場發(fā)生腹瀉的豬群糞便中,用MA_104細(xì)胞培養(yǎng)分離而得.

1.4 試劑與耗材

乙醚、生理鹽水、蒸餾水、硫酸鈉、目篩、燒瓶、注射器、喂藥器、解剖器材等.

1.5 儀器

高速中藥粉碎機(jī)、分析天平、揮發(fā)油提取器、恒溫鼓風(fēng)干燥箱、恒溫水浴鍋、磁力攪拌器、電子天平等.

2 方法

2.1 佩蘭揮發(fā)油的制備

選取自然干燥的佩蘭植株并粉碎，過10目篩后，稱取佩蘭粉末100 g，采用水蒸氣蒸餾提取法，經(jīng)乙醚萃取，無水硫酸鈉干燥后得到揮發(fā)油[4].

2.2 動(dòng)物分組

將40 頭仔豬，隨機(jī)分為4個(gè)處理組，每組10 頭仔豬.4個(gè)處理組分別為豬輪狀病毒對照組、佩蘭揮發(fā)油低劑量組、中劑量組、高劑量組.動(dòng)物的分組處理情況，如表1所示.

表1 試驗(yàn)動(dòng)物的分組與處理

將分組后的仔豬單籠飼養(yǎng)，按常規(guī)方法進(jìn)行飼養(yǎng)管理.所有飼喂飼料均不添加任何抗生素，4日后(即32日齡時(shí))向基礎(chǔ)飼糧中添加佩蘭揮發(fā)油.仔豬基礎(chǔ)飼糧配方組成及營養(yǎng)水平，分別如表 2、表3所示.

表2 基礎(chǔ)日糧組成

表3 基礎(chǔ)日糧營養(yǎng)水平

據(jù)孫紹美[5]、趙靜[6]等研究可知，佩蘭干品、鮮品揮發(fā)油對小鼠具有抗炎及增強(qiáng)免疫力的作用，其最佳的劑量為0.5 mg / kg，同時(shí)，根據(jù)《動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量比值表》 中提供的轉(zhuǎn)換方法，轉(zhuǎn)換后豬的佩蘭揮發(fā)油最佳劑量應(yīng)為50 mg/kg.因此，特將實(shí)驗(yàn)中的佩蘭揮發(fā)油劑量設(shè)定為高、中、低三個(gè)組，分別為100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg，以便更好地研究其對仔豬腹瀉的影響效果.按照三個(gè)劑量標(biāo)準(zhǔn)將佩蘭揮發(fā)油以拌料的形式添加到飼料中.對低劑量組、中劑量組和高劑量組仔豬連續(xù)飼喂含有相應(yīng)劑量的佩蘭揮發(fā)油.三周后，于仔豬53日齡時(shí)對病毒對照組和藥物組的每頭仔豬經(jīng)口灌服1.0×106TCID50/mL的輪狀病毒液4 mL，輪狀病毒對照組繼續(xù)飼喂不含佩蘭揮發(fā)油的基礎(chǔ)飼糧，低劑量組、中劑量組和高劑量組繼續(xù)飼喂添加有相應(yīng)劑量佩蘭揮發(fā)油的基礎(chǔ)飼糧.觀察豬輪狀病毒對照組仔豬，當(dāng)出現(xiàn)連續(xù)腹瀉情況時(shí)，則認(rèn)為豬輪狀病毒成功誘導(dǎo)仔豬腹瀉.

2.3 腹瀉評分標(biāo)準(zhǔn)與計(jì)算

仔豬灌服輪狀病毒后，記錄灌服后天數(shù)(Days post infection，dpi)及相應(yīng)的腹瀉情況，根據(jù)腹瀉情況給出并記錄評分.根據(jù)仔豬糞便的性狀進(jìn)行腹瀉評分，評分及其依據(jù)如下：糞便正常為無腹瀉表現(xiàn)，記為0分；糞便為面糊膏狀為輕度腹瀉表現(xiàn)，記為1分；糞便為半流體狀為中度腹瀉表現(xiàn)，記為2分；糞便為流水型為嚴(yán)重腹瀉表現(xiàn)，記為3分[7].當(dāng)評分≥2分時(shí)，判定仔豬發(fā)生了腹瀉.仔豬腹瀉情況用腹瀉指數(shù)(Diarrhea Index，DI)來表示.計(jì)算方法如下：

2.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2016軟件進(jìn)行整理、SPSS22.0進(jìn)行處理，結(jié)果使用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間比較使用t檢驗(yàn),p< 0.05 表示差異顯著，p< 0.01 表示差異極顯著.

3 結(jié)果與分析

3.1 仔豬輪狀病毒腹瀉模型的建立

在仔豬灌服輪狀病毒后的第2天、第3天和第4天記錄腹瀉仔豬數(shù)，分別為7頭 、9頭和10頭，這說明豬輪狀病毒成功誘導(dǎo)了仔豬腹瀉.仔豬輪狀病毒感染后，除出現(xiàn)腹瀉、嘔吐癥狀外，還出現(xiàn)精神萎靡不振、厭食等癥狀，對其進(jìn)行解剖還發(fā)現(xiàn)小腸呈點(diǎn)狀出血等病理變化.

3.2 佩蘭揮發(fā)油對豬輪狀病毒感染仔豬腹瀉的影響

仔豬攻毒后的腹瀉情況，如表4所示.佩蘭揮發(fā)油低劑量組在攻毒后第2天、第3天、第4天出現(xiàn)腹瀉的仔豬數(shù)分別是3頭、7頭、7頭，佩蘭揮發(fā)油中劑量組在攻毒后第2天、第3天、第4天出現(xiàn)腹瀉的仔豬數(shù)分別為3頭、5頭、3頭，佩蘭揮發(fā)油高劑量組在攻毒后第2天、第3天、第4天出現(xiàn)腹瀉的仔豬數(shù)分別為1頭、1頭、1頭.

表4 仔豬感染豬輪狀病毒后的腹瀉情況

仔豬攻毒后，從表5可以看出，佩蘭揮發(fā)油低、中、高劑量組與病毒感染對照組相比均呈現(xiàn)出差異顯著的情況，這說明佩蘭揮發(fā)油對人工感染豬輪狀病毒仔豬腹瀉有較好的療效.佩蘭揮發(fā)油低、中、高劑量組組間相比也呈現(xiàn)出差異顯著的情況，這說明隨著佩蘭揮發(fā)油劑量的增加，對仔豬輪狀病毒腹瀉的療效呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢.佩蘭揮發(fā)油低、中、高劑量組療效組間相比，以高劑量組療效最好.

表5 不同處理對仔豬腹瀉指數(shù)的影響

使用佩蘭揮發(fā)油對仔豬感染豬輪狀病毒后的腹瀉統(tǒng)計(jì)情況，如圖1所示.圖1中的折線表明，隨著佩蘭揮發(fā)油劑量的增加，仔豬腹瀉情況明顯減少.

圖1 使用佩蘭揮發(fā)油對仔豬感染豬輪狀病毒后的腹瀉統(tǒng)計(jì)情況

4 討論

斷奶仔豬由于缺少相應(yīng)的抗體，感染輪狀病毒后很容易導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生.王純剛[8]、湯俊[9]等人利用輪狀病毒培養(yǎng)液對仔豬進(jìn)行口服攻毒，仔豬在攻毒后均成功誘導(dǎo)腹瀉.本試驗(yàn)成功建立了仔豬輪狀病毒腹瀉模型，并在此基礎(chǔ)上開展腹瀉指數(shù)的研究.結(jié)果表明，佩蘭揮發(fā)油對感染豬輪狀病毒的仔豬腹瀉起到了較好的保護(hù)作用，這與中藥佩蘭所具有的化濕和中、醒脾開胃的功效密切相關(guān).中醫(yī)經(jīng)典里有“濕勝則濡瀉”“泄瀉之本，無不由脾胃”“脾胃失健運(yùn)則泄瀉隨之”的論述，這說明腹瀉與體內(nèi)過濕及脾胃失調(diào)相關(guān).所以，佩蘭揮發(fā)油對感染豬輪狀病毒的仔豬腹瀉有著較好療效，這正是佩蘭化濕和中，醒脾開胃的具體應(yīng)用.現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，佩蘭還具有較明顯的抗炎、抗病毒作用。佩蘭能夠?qū)啝畈《疽鸬哪c道炎癥起到有效的抑制作用.總之，佩蘭揮發(fā)油對感染輪狀病毒仔豬腹瀉的治療是從中醫(yī)藥的角度進(jìn)行的探索，希望為感染輪狀病毒的仔豬腹瀉的治療提供一些理論依據(jù).