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        信陽紅紅茶的酚類成分及抗氧化能力分析

        2022-07-26 09:56:08馬健徐成成任小盈馬冰凇馬存強(qiáng)周斌星
        食品研究與開發(fā) 2022年14期
        關(guān)鍵詞:信陽酚類兒茶素

        馬健,徐成成 ,任小盈,馬冰凇,4,馬存強(qiáng),周斌星

        (1.信陽農(nóng)林學(xué)院,河南 信陽 464000;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)院,云南 昆明 650201;3.聊城高級(jí)財(cái)經(jīng)職業(yè)學(xué)校,山東 聊城 252000;4.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095)

        紅茶是以適宜的茶樹鮮葉 [Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]為原料,經(jīng)萎凋、揉捻(切)、發(fā)酵、干燥等一系列工藝加工而成的全發(fā)酵茶葉類型,占茶葉總產(chǎn)量的78%左右[1]。我國紅茶按照加工方法分為小種紅茶、工夫紅茶和紅碎茶等不同品類。祁紅、滇紅、寧紅、宜紅均是我國著名的工夫紅茶。信陽地處東經(jīng)114.06°,北緯32.125°,屬亞熱帶向暖溫帶過渡區(qū),為我國最北的茶葉產(chǎn)區(qū)之一,主要采摘春季和夏季茶樹鮮葉進(jìn)行信陽毛尖等烘青綠茶的生產(chǎn)。自2010年始,信陽茶企嘗試以信陽群體種夏、秋季茶樹鮮葉為原料,參照《紅茶第2部分:工夫紅茶》[2]進(jìn)行“信陽紅”紅茶的生產(chǎn)。信陽紅紅茶因其具有外形條索緊細(xì)、色澤棕潤多金毫、內(nèi)質(zhì)湯色紅亮、香氣甜香持久、滋味醇厚甘爽、葉底嫩勻紅亮的品質(zhì)特征[3-4],廣受國內(nèi)外消費(fèi)者的歡迎。

        茶多酚(tea polyphenols)占茶樹鮮葉干物質(zhì)重30%左右[5],主要包括兒茶素(catechins)、黃酮醇類(flavonols)、黃酮類(flavonoids)、花青素類(anthocyanins)和酚酸類(phenolic acids)等[6]。由于加工工藝不同,綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶、紅茶和黑茶六大類型茶葉中酚類成分分布存在顯著差異[7-9]。在紅茶加工中茶多酚在多酚氧化酶作用下氧化聚合形成茶黃素、茶紅素和茶褐素等茶色素,并受到發(fā)酵程度和鮮葉內(nèi)含成分等因素的影響[10]。Guo等[11]和Zhang等[12]研究顯示紅茶中酚酸、黃酮類、兒茶素等酚類成分與抗氧化、降血糖、降血脂等生物學(xué)活性存在一定相關(guān)性。目前關(guān)于信陽紅紅茶品質(zhì)成分與生物學(xué)活性的相關(guān)研究相對(duì)較少。至今尚不明確信陽紅紅茶等工夫紅茶中酚類成分分布及其對(duì)體外抗氧化能力的影響。

        本文采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)等方法對(duì)9個(gè)信陽紅紅茶茶樣中的酚類化合物、嘌呤堿、游離氨基酸總量等品質(zhì)成分進(jìn)行測(cè)定,并分別進(jìn)行鐵離子還原抗氧化能力(ferric ion reducing antioxidant power,F(xiàn)RAP)、DPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、羥基自由基清除能力(hydroxyl radical scavenging ability,HSA)和超氧陰離子自由基清除能力(superoxide anion radical scavenging ability,SSA)等體外抗氧化能力的測(cè)定,通過多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法探究信陽紅紅茶中酚類成分分布及其對(duì)抗氧化能力的影響。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        信陽市浉河區(qū)天云山茶場以當(dāng)?shù)厝后w種同一規(guī)格茶樹鮮葉加工生產(chǎn)的信陽紅紅茶樣共9個(gè),編號(hào)分別為XYH-1~XYH-9,-20℃下密封保存。(+)-兒茶素(catechin,C)、(+)-沒食子兒茶素(gallocatechin,GC)、(-)-表兒茶素(epicatechin,EC)、(-)-表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)、(-)-兒茶素沒食子酸酯(catechin galllate,CG)、(-)-表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)、(-)-沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate,GCG)和(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)、沒食子酸、鞣花酸、水解單寧(1,4,6-三-O-沒食子?;?β-D-葡萄糖,1,4,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose) 標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%):上海源葉生物科技有限公司;槲皮素、山奈酚、楊梅素、蘆丁、花旗松素、木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%):成都曼斯特生物科技有限公司;咖啡堿、可可堿、茶標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪[(2,4,6-tri(2-pyridyl)-1,3,5-S-triazine,TPTZ)]、1,1-二苯基-2-苦基肼 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-甲酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid,trolox)、2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽[(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt,ABTS)]:美國 Sigma-Aldrich公司;甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純):美國Thermo Fisher公司;羥自由基清除能力檢測(cè)試劑盒、超氧陰離子自由基清除能力檢測(cè)試劑盒:蘇州格銳思生物科技有限公司。

        Heraeus Fresco17高速離心機(jī):美國Thermo Fisher公司;JXFSTPRP-24研磨儀:上海凈信科技科技有限公司;TU-1901紫外-可見分光光度計(jì):北京普析技術(shù)科技有限公司;Multiskan FC型酶標(biāo)儀:美國Thermo Scientific公司;1200型HPLC儀:美國Agilent公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 主要品質(zhì)成分分析

        參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》進(jìn)行茶葉中水分的測(cè)定。采用福林酚比色法,以沒食子酸為參照測(cè)定茶葉中的茶多酚含量[13-14]。采用蒽酮試劑在620 nm波長下進(jìn)行茶葉中可溶性糖總量的測(cè)定[14-15]。游離氨基酸總量測(cè)定采用茚三酮比色法[16]??傸S酮含量以蘆丁為參照,采用三氯化鋁比色法進(jìn)行測(cè)定[17-18]。茶葉中茶黃素、茶紅素和茶褐素等3種茶色素含量采用紫外-可見分光光度計(jì)在380 nm波長下進(jìn)行系統(tǒng)分析[19]。

        1.2.2 茶湯浸提

        茶樣經(jīng)研磨儀研磨,40目篩網(wǎng)過篩后,-20℃保存?zhèn)溆谩7Q取1.0g茶葉研磨樣品,加入40mL甲醇和4mL鹽酸于圓底燒瓶85℃回流浸提90 min,冷卻過濾后,用甲醇定容至50 mL,0.45 μm尼龍濾膜過濾后用于HPLC 檢測(cè)[20]。

        1.2.3 酚類化合物和嘌呤堿的HPLC檢測(cè)

        采用Agilent1200型HPLC儀連接Poroshell 120 EC-C18色譜柱(100×4.6 mm,2.7 μm)和 C18保護(hù)柱(10×4.6 mm,5 μm),對(duì)9個(gè)紅茶樣中的8種兒茶素、6種黃酮類、2種酚酸、水解單寧、3種嘌呤堿等活性成分含量進(jìn)行定量檢測(cè)[20-21]。流動(dòng)相A為0.261%磷酸、5%乙腈,流動(dòng)相B為80%甲醇;洗脫梯度程序:0 min,B相10%;10 min,B相線性增加至 45%;22 min,B 相線性增加至65%;25.9 min,B相線性增加至100%;29 min,B相保持100%;30 min,B相線性減少至10%;36 min,B相保持為10%。流速為0.8 mL/min。柱溫為30℃;0~20 min檢測(cè)波長為280 nm;20 min~36 min檢測(cè)波長為360 nm;進(jìn)樣體積為 2 μL。

        1.2.4 體外抗氧化能力測(cè)定

        1.2.4.1 鐵離子還原能力

        0.05g信陽紅紅茶樣與1mL80%乙醇混合,于60℃,200 W~300 W條件下超聲提取30 min。12 000 r/min離心10 min后,取上清液。以抗氧化劑trolox為參照,采用微板法在590 nm波長下的進(jìn)行FRAP檢測(cè),計(jì)算公式如下。

        式中:X1為 trolox 物質(zhì)的量,nmol;Y1為 OD590;V為提取液體積,1mL;V1為反應(yīng)體系中樣品體積,0.005mL;W為茶樣干重,g;D為稀釋倍數(shù)。

        1.2.4.2 DPPH自由基清除能力

        0.05 g信陽紅紅茶樣與1 mL 80%甲醇提取液混合,進(jìn)行冰浴勻漿。12 000 r/min離心10 min,取上清液。以抗氧化劑trolox為參照,采用微板法在517 nm波長下進(jìn)行DPPH自由基清除能力的檢測(cè),計(jì)算公式如下。

        式中:X2為 trolox 的濃度,μg/mL;Y2為 DPPH 自由基清除率,%;V為提取液體積,1mL;V1為反應(yīng)體系中樣品體積,0.150 mL;W為茶樣干重,g;D為稀釋倍數(shù)。

        1.2.4.3 ABTS+自由基清除能力

        0.05 g信陽紅紅茶樣與1 mL 80%甲醇提取液混合,進(jìn)行冰浴勻漿。12 000 r/min離心10 min后,取上清液。以抗氧化劑trolox為參照,采用微板法在734 nm波長下進(jìn)行ABTS+自由基清除能力的檢測(cè),計(jì)算公式如下。

        式中:X3為 trolox的濃度,μg/mL;Y3為 ABTS+自由基清除率,%;V為提取液體積,1 mL;V1為反應(yīng)體系中樣品體積,0.010 mL;W為茶樣干重,g;D為稀釋倍數(shù)。

        1.2.4.4 羥基自由基清除能力

        取0.1 g茶樣與1 mL蒸餾水混合,進(jìn)行冰浴勻漿。12 000 r/min離心10 min后,取上清液。采用微板法在510 nm下進(jìn)行羥基自由基清除能力的檢測(cè)。

        1.2.4.5 超氧陰離子自由基清除能力

        取0.1 g茶樣與1 mL提取液混合,進(jìn)行冰浴勻漿。12 000 r/min離心10 min后,采用微板法在570 nm波長下測(cè)定信陽紅紅茶上清液的超氧陰離子自由基清除能力。

        1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

        每個(gè)茶樣進(jìn)行3次測(cè)定。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

        2 結(jié)果分析

        2.1 信陽紅紅茶品質(zhì)成分的單因素方差分析

        20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和9個(gè)信陽紅紅茶的HPLC色譜圖如圖1所示。

        圖1 20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和9個(gè)信陽紅紅茶樣的高效液相色譜Fig.1 HPLC profiles of 20 standards and 9 Xinyanghong black tea samples

        由圖1可知,9個(gè)信陽紅紅茶中均能檢出7種兒茶素(C、EC、EGC、EGCG、EGC、GCG 和 CG)、6 種黃酮類(蘆丁、楊梅素、花旗松素、槲皮素、木犀草素和山奈酚)、2種酚酸(沒食子酸和鞣花酸)和2種嘌呤堿(咖啡堿和可可堿)。所有信陽紅茶樣中均未檢出GC,部分樣品中未能檢出茶堿。這與兩者在茶葉中含量偏低有關(guān)[22]。紅茶萎凋和酶促發(fā)酵過程中兒茶素含量呈顯著降低趨勢(shì)[22-24],因而GC在信陽紅紅茶中未能檢出,其他兒茶素也明顯低于綠茶等未發(fā)酵茶葉類型。

        9個(gè)信陽紅紅茶中的兒茶素、黃酮類、酚酸、嘌呤堿、茶色素等品質(zhì)成分含量如表1所示。

        表1 9個(gè)信陽紅紅茶中品質(zhì)成分含量及其差異Table 1 Content and differences of quality components in 9 Xinyanghong black tea samples

        續(xù)表1 9個(gè)信陽紅紅茶中品質(zhì)成分含量及其差異Continue table 1 Content and differences of quality components in 9 Xinyanghong black tea samples

        兒茶素總量為 C、EC、EGC、ECG、GCG、EGCG 和CG,由表1可知,7種兒茶素含量的總和;酯型兒茶素含量為ECG、GCG、EGCG和CG等4種酯型兒茶素含量的總和;非酯型兒茶素含量為C、EC和EGC3種非酯型兒茶素含量的總和。9個(gè)信陽紅紅茶中部分茶樣之間的茶多酚、3種茶色素(茶黃素、茶紅素和茶褐素)、7種兒茶素、沒食子酸、3種黃酮類化合物(花旗松素、槲皮素和山奈酚)、可可堿和水解單寧等品質(zhì)成分存在極顯著性(P<0.001)差異;而鞣花酸、蘆丁、山奈酚等酚類成分存在顯著性(P<0.01)差異。另外,游離氨基酸、可溶性糖、楊梅素、山奈酚和咖啡堿等成分含量保持穩(wěn)定,無顯著性(P>0.01)差異。盡管本研究信陽紅茶采用統(tǒng)一規(guī)格的秋季茶樹鮮葉加工而成,而發(fā)酵程度造成了紅茶中茶多酚、茶色素、兒茶素以及沒食子酸等酚類成分上的差異[25]。相對(duì)而言,蘆丁、花旗松素、山奈酚等黃酮類化合物和鞣花酸等酚類成分受發(fā)酵程度的影響較小。

        2.2 信陽紅紅茶的酚類成分以及嘌呤堿等品質(zhì)成分含量

        酚類物質(zhì)是茶葉中主要呈味物質(zhì)和功效成分。產(chǎn)地、茶樹品種和加工工藝等因素均影響紅茶的兒茶素、黃酮類和酚酸等酚類成分,有助于紅茶的產(chǎn)地識(shí)別和溯源。不同產(chǎn)地工夫紅茶中的EGCG、蘆丁、奎寧酸、茶黃素等代謝物存在顯著差異[26]。Yu等[27]研究發(fā)現(xiàn)春季不同加工時(shí)期內(nèi)工夫紅茶中品質(zhì)成分的變化規(guī)律。秋季茶樹鮮葉中兒茶素含量是春茶的1.3倍,特別是EGCG、ECG等酯型兒茶素等,這一定程度上增強(qiáng)了綠茶的苦味和收斂性[28]。相對(duì)而言,秋季茶樹鮮葉更適用于紅茶的加工生產(chǎn)[29]。較春季茶樹鮮葉加工而成的工夫紅茶,信陽紅紅茶中保留較多的茶多酚、兒茶素、黃酮類、酚酸等酚類成分。信陽紅紅茶中不同品質(zhì)成分的平均含量及范圍,如表2所示。

        表2 信陽紅紅茶中不同品質(zhì)成分的平均含量及范圍Table 2 Average content and ranges of various quality components in Xinyanghong black tea samples

        續(xù)表2 信陽紅紅茶中不同品質(zhì)成分的平均含量及范圍Continue table 2 Average content and ranges of various quality components in Xinyanghong black tea samples

        在信陽紅紅茶的兒茶素類中,ECG平均含量最高,一般為(11.95±3.20)mg/g;其次為 EGCG 和 EC 平均含量分別為(9.30±1.68)mg/g和(7.55±1.60)mg/g。EGC 含量為(6.09±3.12)mg/g。在 95%置信范圍內(nèi),茶多酚含量為56.34 mg/g~63.22 mg/g;總黃酮含量為26.70 mg/g~29.07 mg/g;總兒茶素含量為37.08 mg/g~43.71 mg/g,并以酯型兒茶素為主,含量為22.56 mg/g~26.34 mg/g;沒食子酸為紅茶中的主要酚酸類化合物,其含量在4.59 mg/g~5.01 mg/g;蘆丁、花旗松素、木犀草素和楊梅素為信陽紅紅茶中的主要黃酮類成分,其含量分別為 1.39 mg/g~1.79 mg/g、0.59 mg/g~0.74 mg/g、0.53 mg/g~0.75 mg/g 和 0.36 mg/g~0.44 mg/g;咖啡堿為主要的嘌呤堿類物質(zhì),不同紅茶茶樣之間無顯著(P>0.01),含量為 37.89 mg/g~39.87 mg/g。

        2.3 信陽紅紅茶體外抗氧化能力的單因素方差分析

        本文采用微板法分別檢測(cè)分析了9個(gè)信陽紅紅茶的FRAP、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、HSA和SSA等體外抗氧化能力,結(jié)果見圖2。

        圖2 9個(gè)信陽紅紅茶茶樣的抗氧化能力Fig.2 Antioxidant capacity of 9 Xinyanghong black tea samples

        圖2顯示部分信陽紅紅茶之間的FRAP、DPPH自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力存在顯著性(P<0.01)差異,這可能主要與紅茶的酚類成分分布有關(guān)。而ABTS+自由基清除能力和羥基自由基清除能力無顯著性差異。綠茶和紅茶為世界范圍內(nèi)主要的消費(fèi)茶葉類型,與綠茶相比,紅茶的體外抗氧化能力較低,而體外抗氧化能力較高,這與綠茶中豐富的酚類成分以及小腸對(duì)酚類化合物的吸收率較低有關(guān)[30-31]。信陽紅紅茶的體外抗氧化能力符合這一規(guī)律。信陽紅紅茶的FRAP、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、羥基自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率分別為(919.73±138.27)μmol trolox/g、(421.38±9.15)mg trolox/g、(223.70±9.99)mg trolox/g、(57.71±2.23)%和(36.00±3.25)%,表現(xiàn)出一定的體外抗氧化能力。信陽紅紅茶的ABTS+自由基清除能力、羥基自由基清除能力相對(duì)穩(wěn)定,受茶樹鮮葉質(zhì)量和加工工藝等因素的影響較小。在95%置信范圍內(nèi),ABTS+自由基清除能力和羥基自由基清除能力分別為219.75 mg/g~227.66 mg/g和56.82%~58.59%。

        2.4 酚類成分與抗氧化能力的相關(guān)性分析

        本文通過SPSS軟件采用雙變量相關(guān)性分析探究了信陽紅紅茶中茶多酚、總黃酮、游離氨基酸、EGCG、ECG、沒食子酸等成分含量與FRAP、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、羥基自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力等抗氧化能力的相關(guān)性,Person相關(guān)性系數(shù)詳情見表3。

        表3 信陽紅紅茶中品質(zhì)成分與抗氧化能力的Person相關(guān)性系數(shù)Table 3 Person's correlation coefficient of quality component with antioxidant ability of Xinyanghong black tea

        如表3所示,F(xiàn)RAP、DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力之間存在顯著(P<0.05)或高顯著(P<0.01)相關(guān)性,羥基自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力之間及其與FRAP、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力之間均不存在顯著(P>0.05)正相關(guān)性。酚類成分,如 EC、CG、EGCG、沒食子酸、楊梅素等,以及茶黃素、游離氨基酸、可溶性糖與FRAP、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力存在顯著(P<0.05)或高顯著(P<0.01)正相關(guān)性;相反,茶紅素、茶褐素以及花旗松素與FRAP、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力存在顯著(P<0.05)負(fù)相關(guān)性。而嘌呤堿和其他黃酮類化合物與抗氧化能力相關(guān)性不大??偟膩碚f,信陽紅紅茶的體外抗氧化能力主要受到酚類成分和茶黃素、茶紅素等茶色素的影響。兒茶素類和沒食子酸是信陽紅紅茶中的主要抗氧化成分,均與FRAP、DPPH自由基清除能力或ABTS+自由基清除能力有顯著(P<0.05)或高顯著(P<0.01)正相關(guān)性,Person相關(guān)性系數(shù)最高分別為0.769、0.861、0.834和 0.759。特別是 EGCG (r=0.853,0.674和0.861)、EC(r=0.834,0.655 和 0.786)與 FRAP、ABTS+自由基清除能力和DPPH自由基清除能力等抗氧化能力存在高顯著(P<0.01)正相關(guān)性。ECG在一定程度上能提高信陽紅紅茶的DPPH自由基清除能力。蘆丁、楊梅素等黃酮類化合物含量的相對(duì)穩(wěn)定對(duì)信陽紅紅茶的體外抗氧化能力的影響有限。信陽紅紅茶中茶多酚、游離氨基酸、可溶性糖以及兒茶素、黃酮類化合物、嘌呤堿均與羥基自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力無顯著(P>0.05)相關(guān)性,影響紅茶中抗氧化能力的活性成分值得進(jìn)一步研究。

        3 討論與結(jié)論

        信陽紅紅茶中共檢出 C、EC、EGC、CG、ECG、GCG和EGCG 7種兒茶素,蘆丁、楊梅素、花旗松素、槲皮素、木犀草素和山奈酚6種黃酮類化合物,和沒食子酸、鞣花酸等酚類成分,以及咖啡堿、可可堿、茶堿等嘌呤堿。確定ECG為主要的兒茶素類型,其平均含量為(11.95±3.20)mg/g;蘆丁為主要的黃酮類化合物,其含量為1.39 mg/g~1.79 mg/g;沒食子酸的含量為4.59 mg/g~5.01 mg/g。

        單因素方差分析顯示部分信陽紅紅茶茶樣之間茶多酚、3種茶色素(茶黃素、茶紅素和茶褐素)7種兒茶素、沒食子酸、3種黃酮類(即:花旗松素、槲皮素和山奈酚)、可可堿和水解單寧含量存在極顯著性(P<0.001)差異,以及FRAP、DPPH自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力存在顯著性(P<0.01)差異。在95%置信度區(qū)間,F(xiàn)RAP、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、羥基自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率分別為(919.73±138.27)μmol trolox/g、(421.38±9.15)mg trolox/g、(223.70±9.99)mg trolox/g、(57.71±2.23)%和(36.00±3.25)%。雙變量相關(guān)性分析顯示了兒茶素、沒食子酸等酚類成分以及茶黃素為信陽紅紅茶中的主要抗氧化成分,與FRAP、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力均存在顯著(P<0.05)或高顯著(P<0.01)正相關(guān)性。確定 EGCG、EC、ECG等兒茶素為影響紅茶體外抗氧化能力的主要抗氧化活性成分。

        本文采用HPLC等方法初步探明了信陽紅紅茶中的酚類成分構(gòu)成以及抗氧化能力差異,并通過雙變量相關(guān)性分析揭示了酚類成分與抗氧化能力的相關(guān)性,為工夫紅茶的分類比較研究提供了科學(xué)依據(jù)。

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