高凡，王學東，羅小絨，羅崇義，彭憬

（首都師范大學資源環(huán)境與旅游學院，北京 100048）

鉬（Mo）是植物、動物和微生物必需的微量元素之一[1]。Mo可以促進植物體內磷的吸收和運輸，同時參與氮代謝，在轉運碳水化合物的過程中也發(fā)揮著重要作用[2]。作為全世界鉬礦資源最為豐富的國家，我國探明儲量的鉬礦區(qū)已高達200 多個，其中大中型鉬礦床多，分布較為廣泛[3]。但是，隨著鉬礦的加速開采，一些地方土壤出現(xiàn)了Mo 的累積[4]。此外，現(xiàn)代的工業(yè)活動，如不銹鋼、鑄鐵、超合金制造，冶金加工，煤炭石油燃燒，磷酸鹽肥料的使用和磷酸鹽洗滌劑的排放等也使大量Mo 排放于土壤環(huán)境中[5]。土壤中過度積累的Mo 不僅破壞生態(tài)系統(tǒng)，而且通過食物鏈直接或間接地危害人體健康，導致人神經異常、智力發(fā)育遲緩、骨骼生長抑制等[6]。因此，加強對土壤Mo 污染風險管控對于保護生態(tài)系統(tǒng)安全具有重要意義。

Mo在土壤中的遷移累積及風險與其形態(tài)密切相關。Mo 在土壤中的形態(tài)可分為水溶態(tài)鉬（溶解于水中的Mo）、有機態(tài)鉬（存在于有機物質中的Mo）、難溶態(tài)鉬（被原生礦物和鐵鋁氧化物固定的Mo）、代換態(tài)鉬（以MoO2-4和HMoO-4形式被土壤膠體吸附的Mo）4種類型[7-8]。在一定條件下，這4 種形態(tài)的Mo 可以相互轉化，并且轉化過程較為迅速。而隨著pH 值的變化，土壤溶液中Mo 的形態(tài)往往會發(fā)生變化：當pH>4時，主要以MoO2-4為主[9]；當2.5≤pH≤4 時，以HMoO-4、Mo（OH）6和HMo2O-7為主；當pH<2.5時，主要以非離子化的H2MoO4形式存在[10]。土壤中的Mo 對生物的毒性在很大程度上取決于土壤特性及其在土壤中存在形態(tài)[11]。

國外較早地開展了Mo 的風險評價研究，如歐盟利用歐洲土壤開展了Mo對無脊椎動物、植物、微生物的毒性試驗并獲得相應的毒性閾值，意大利、荷蘭、法國等國家針對Mo也規(guī)定了本國的土壤環(huán)境質量標準值。而我國針對Mo 的毒理學研究數(shù)據(jù)還較少[12]，《土壤環(huán)境質量 農用地土壤污染風險管控標準（試行）》（GB 15618—2018）中也沒有涉及Mo 的標準。因此，開展土壤Mo的生態(tài)風險評價研究具有重要意義。

我國土壤類型繁雜多樣，各地區(qū)的土壤性質差異較大，因此污染物在進入土壤之后的遷移轉化和生物有效性會因土壤差異而發(fā)生變化[13]?；诖耍狙芯扛鶕?jù)我國土壤pH 值和土壤有機質含量等分布規(guī)律，選取了9 個不同地區(qū)的理化性質差異較大的具有代表性的土壤樣品，以大麥作為供試植物，通過外源添加鉬酸鹽（Mo6+）的方式，研究土壤Mo 對植物的毒性閾值及土壤主控因子，為豐富土壤重金屬元素的毒理學數(shù)據(jù)庫，以及開展我國土壤Mo 生態(tài)風險評價及建立相關基準提供參考。

1 材料與方法

1.1 土壤采樣和處理

在我國土壤理化性質差異較大的9 個地區(qū)采集土壤樣品，土壤的基本理化性質如表1 所示，其中土壤pH 值變化范圍為5.31～8.90，有機碳含量（OC）變化范圍為0.6%～2.5%，陽離子交換量（CEC）變化范圍為6.36～19.30 cmol·kg-1。土壤樣品取自0～20 cm 耕層，經25 ℃風干，過2 mm尼龍篩后儲存。

表1 供試土壤的基本理化性質Table 1 Basic physical and chemical properties of the test soils

根據(jù)9 個地區(qū)土壤的理化性質差異，通過預實驗確定Mo 的添加量，其中廊坊、廣州土壤添加Mo 的含量為0、50、100、200、400、800、1 600、3 200 mg·kg-1；祁陽、嘉興、杭州、石家莊、楊凌、鄭州、德州土壤添加Mo的含量為0、100、200、400、800、1 600、3 200、6 400 mg·kg-1。通過噴灑不同含量的二水合鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）溶液將Mo 添加到土壤中，整個過程充分拌勻以確保其均勻分布。每個Mo添加處理設置3 個重復。土壤保持100%最大田間持水量平衡2 d后，風干、粉碎，過2 mm尼龍篩后備用。

1.2 土壤理化性質測定

主要測定的土壤理化性質包括pH 值、電導率（EC）、黏粒含量（Clay）、OC、CEC、土壤Mo 的背景值以及鐵、鋁、錳氧化物含量（Feox、Alox、Mnox）。其中，pH值使用pH 計測定；EC 使用微電極儀測定；Clay 通過沉降法獲得；OC 通過高溫燃燒法測定的總碳減去Pressure-Calcimeter 法測定的無機碳獲得；CEC 通過非緩沖硫脲銀法測定；土壤Mo的背景值使用ICP-MS測定；Feox、Alox、Mnox使用電感耦合等離子體質譜儀測定[14]。

1.3 植物毒性測試

植物毒性測試試驗參照國際標準組織ISO-11269-1標準方法[15]，以大麥根伸長為評價終點，該方法不僅簡單易測，而且廣泛應用于歐洲和我國土壤中Cu、Zn和Ni等重金屬的毒性研究。稱取120 g土樣裝入聚氯乙烯（PVC）材質的圓柱形培養(yǎng)杯（高12 cm，直徑4.2 cm），然后放入人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)條件：白天持續(xù)時間14 h，光照條件為25 000 lx·m-2，溫度為20 ℃，濕度為70%；夜間持續(xù)時間10 h，光照條件為45 W 的鎢燈，溫度為16 ℃，濕度為70%。在整個培養(yǎng)期，通過添加蒸餾水使土壤保持60%最大田間持水量。土壤培養(yǎng)7 d 后，用雙氧水消毒過的大麥種子放置于帶有濾紙的培養(yǎng)皿中，添加蒸餾水至沒過種子，待培育2 d 胚根根長2 mm 后，以胚根向下的方式將種子播種在離土表1 cm的土壤中。種子培養(yǎng)5 d后，取出大麥，測量其根長。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Mo濃度與大麥根伸長的劑量效應關系采用澳大利亞聯(lián)邦科學與工業(yè)研究組織（CSIRO）研發(fā)的邏輯斯蒂克分布模型（Log-logistic distribution）擬合[16]，公式如下：

式中：Y是大麥相對根伸長，%；X是lg（土壤總Mo 的含量），土壤總Mo為土壤Mo背景值和外源添加Mo之和；Y0、b是擬合參數(shù)；M是lgEC10、lgEC50，其中EC10和EC50表示抑制大麥根伸長10%和50%時土壤總Mo含量。通過該公式可以得到EC10、EC50和相應95%的置信區(qū)間。

采用SPSS 26.0 檢測所有數(shù)據(jù)是否滿足線性回歸，是否滿足正態(tài)分布，最后進行Pearson 相關性分析和線性回歸分析；采用Origin Pro 8.5 繪制劑量-效應曲線和模型驗證效果圖。

2 結果與討論

2.1 土壤Mo 對大麥根伸長的毒性閾值和劑量-效應曲線

土壤Mo 對大麥根伸長的毒性閾值和劑量-效應曲線如表2 和圖1 所示。由圖1 可知，對于所有類型土壤，隨著Mo濃度升高，大麥相對根伸長變短，其中，廣州土壤（pH=7.27）的Mo 對大麥毒性最大，EC10值為262.64 mg·kg-1，EC50值為851.10 mg·kg-1；石家莊土壤（pH=8.19）的Mo 對大麥毒性最小，EC10值為3 301.70 mg·kg-1，EC50值為5 142.62 mg·kg-1。整體來看，9 個地區(qū)EC10的最值相差11.57 倍，而EC50的最值相差僅5.04倍。

圖1 Mo對大麥根伸長的劑量-效應曲線Figure 1 Dose-response curves of Mo concentrations for barley root elongation

表2 Mo對大麥根伸長的毒性閾值（mg·kg-1）Table 2 Toxicity thresholds measured by barley roots elongation for Mo（mg·kg-1）

針對本研究選取的9 個地區(qū)土壤，以往研究報道了Cu、Ni、Co、Cr 4 種元素的大麥毒性[17-20]，對比結果表明，Mo 的EC10的最值變化大于Cu（5.64 倍）、Cr（6.28 倍），小于Ni（41.11 倍）和Co（105.49 倍）；Mo 的EC50的最值變化大于Cu（6.02 倍）、Cr（4.17 倍），小于Ni（13.62 倍）和Co（36.30 倍）。這表明土壤理化性質對Mo 的毒性有較大影響，因此，探究影響Mo 對大麥毒性的主要土壤理化性質并且基于此建立相關預測模型較為重要。

2.2 土壤Mo對大麥根伸長的影響因子

基于歐洲土壤的研究[21]結果表明，Clay 是影響土壤Mo 對大麥毒害作用最重要的因子，基于Clay、pH和CEC 等土壤因子建立的預測模型可以較為準確地預測Mo對大麥的毒性閾值。國內針對Cu[17]和Zn[22]對大麥毒性的研究發(fā)現(xiàn)，基于pH、CEC 和OC 等土壤因子建立的預測模型可以較為準確地預測其對大麥的毒性閾值；此外，針對Cr[20]對大麥毒性的研究發(fā)現(xiàn)，pH、Alox和Feox等土壤理化性質均能影響其對大麥的毒害作用。綜上所述，土壤pH、OC、Clay、CEC、Feox、Alox和Mnox均可能影響重金屬元素的毒害作用?；诖?，本研究測定了上述土壤理化性質，并且利用SPSS 26.0 分析了9 個地區(qū)土壤的不同理化性質與EC10、EC50的Pearson相關關系，結果如表3所示。

通常P<0.05作為顯著性差異的判定標準，但由于統(tǒng)計學中的顯著性受抽樣誤差的影響，實際上P<0.1時即可認為變量在90%的置信水平上具有顯著相關性。由表3 可知，土壤CEC 是影響EC10和EC50的主要因子，二者在0.1 水平（P<0.1）上均呈顯著的正相關；pH 值和Mnox與EC 值的相關系數(shù)較高；而OC、Clay 和Alox等其他土壤因子與EC值的相關系數(shù)較低。

表3 土壤理化性質與毒性閾值的Pearson相關系數(shù)Table 3 Pearson correlation coefficient between soil physical and chemical properties and toxicity thresholds

大量研究表明，土壤中重金屬的生物有效性受土壤理化性質的影響顯著。其中，土壤CEC 是重要的影響因素之一[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，CEC 是預測我國土壤中Mo對大麥毒性閾值的最重要的因子，這與COR?NELIS 等[25]和KRIS 等[26]研究結果相似，該兩項研究利用歐洲土壤分別研究了Mo對土壤無脊椎動物（蚯蚓）和土壤微生物的毒性，結果發(fā)現(xiàn)土壤CEC 與蚯蚓以及土壤微生物毒性均具有顯著的相關性。但利用我國土壤進行的Cu[27]、Zn[22]和Ni[28]對大麥毒性研究結果卻發(fā)現(xiàn)，這3 種元素的毒性閾值主要受土壤pH 值的影響，這與Mo 的研究結果不同?？赡苁且驗镃u、Zn和Ni 在土壤中分別以二價陽離子的形式存在，而Mo主要以MoO2-4陰離子的形式存在于土壤中。CEC是用來衡量土壤可交換陽離子的能力的指標，研究表明，土壤中黏土含量、有機物含量和土壤pH 值是影響CEC 的重要因素[29-31]，而黏土和有機物均有鉬酸鹽的結合位點[32]，多因素的共同作用導致CEC含量較高的土壤中Mo 對植物的生物利用度和毒性降低。另外，本研究表明，當預測模型引入土壤因子Mnox時，對Mo的毒害閾值預測能力增強，這可能是因為土壤中的Mnox表面有較多的活性基團，如OH-、OH2+、OH3+等基團，對很多有機和無機陰離子有較強的吸附作用[33]，所以向土壤中加入鉬酸鹽時，MoO2-4可以擴散到Mnox的孔隙中，優(yōu)先與多配位基的配合物結合，從而降低了土壤中Mo對植物的毒性。

2.3 土壤Mo對大麥毒性閾值的預測模型

為了量化表征土壤因子與Mo的毒性閾值之間的關系，通過一元和多元線性回歸分析，擬合基于土壤因子的Mo 對大麥毒性閾值的預測模型，如表4 所示。結果表明當只考慮CEC 對EC10、EC50值的影響時（方程1、方程4），可以分別解釋36.6%、34.0%的變異；當將pH 值作為第2 個土壤因子納入模型時（方程2、方程5），預測能力顯著提高，可以分別解釋66.8%、68.1%的變異（P<0.05）；當模型中納入第3 個土壤因子Mnox含量時（方程3、方程6），模型變異系數(shù)提高至82.2%、88.5%（P<0.05）。但是，當模型中納入第4 個甚至更多的土壤因子時，預測能力并沒有得到改善。因次，本研究將包含CEC、pH 值和Mnox含量3 個土壤因子的預測模型（方程3、方程6）作為風險評價的最終結果（P<0.05）。

表4 基于土壤因子的Mo毒性閾值的預測模型Table 4 Prediction models of Mo toxicity threshold based on soil factors

使用基于土壤因子的Mo 毒性閾值預測模型（方程3、方程6）可以得到9 個地區(qū)土壤EC10、EC50的預測值。將預測值與實測值（對數(shù)轉化）進行作差比較（圖2），結果表明，兩者的誤差均小于0.5 個數(shù)量級，誤差較小，表明該模型可以較為準確地預測我國典型土壤Mo對大麥的毒性。

圖2 毒性閾值的預測值和實測值的關系Figure 2 The relationships between measured and predicted toxicity thresholds

為了進一步驗證預測模型的準確性，本研究比較基于歐洲土壤研究得到的Mo 對大麥的毒性閾值[21]（表5）與模型的預測數(shù)據(jù)。該研究表明，與EC10值相比，EC50值具有較小的置信區(qū)間，并且受實驗誤差的影響較小，所以本研究只驗證了與土壤理化性質相關性更好的EC50值。使用基于土壤因子對Mo毒性閾值的預測模型（方程6）可以得到歐洲9 個地區(qū)土壤EC50的預測值，與實測值（對數(shù)轉化）進行作差比較（圖3a）。結果表明，兩者的誤差有1/3小于0.5個數(shù)量級，2/3 大于0.5 個數(shù)量級，誤差較大，說明基于我國土壤建立的Mo對大麥的毒性閾值的預測模型不適用于歐洲土壤。這是因為我國土壤的CEC 在6.36～19.30cmol·kg-1之間，最大值和最小值相差約2 倍，而歐洲土壤的CEC在4.1～41.7 cmol·kg-1之間，最大值和最小值相差約9 倍，歐洲土壤的CEC 范圍遠超我國土壤，不符合模型的應用條件。

圖3 EC50的預測值和實測值的關系Figure 3 The relationships between measured and predicted EC50 values

表5 歐洲土壤中Mo對大麥根伸長的EC50值（mg·kg-1）[21]Table 5 EC50 values measured by barley roots elongation for Mo in European soils（mg·kg-1）[21]

為了建立適用土壤范圍更為廣泛的閾值預測模型，對我國和歐洲共18 個地區(qū)土壤的理化性質和毒性閾值進行相關性分析，結果發(fā)現(xiàn)土壤中影響EC50值的主要因子仍是CEC（P<0.01），并且當模型引入pH值和Mnox含量兩個土壤因子時，模型變異系數(shù)由75.1%提升至97.7%（P<0.01）。使用重新得到的預測模 型（lgEC50=1.466lgCEC+0.134pH+0.285lgMnox+0.299）可以得到18個地區(qū)土壤EC50的預測值，將其與實測值（對數(shù)轉化）進行比較，結果如圖3b所示。由圖可知，18個土壤EC50的預測值與實測值誤差均小于0.5個數(shù)量級，誤差較小，說明我國和歐洲均可運用該模型來預測土壤Mo的植物毒性閾值。

3 結論

（1）我國9 個地區(qū)不同理化性質的土壤中Mo 的大麥毒性閾值差異顯著，EC10和EC50的最大值與最小值分別相差11.57倍和5.04倍。

（2）土壤陽離子交換量（CEC）是影響我國土壤Mo 毒性閾值最重要的因子，基于CEC、pH 值和錳氧化物含量3 個土壤因子，建立了我國9 個地區(qū)土壤中Mo 對大麥毒性閾值的預測模型，預測值與實測值的誤差均小于0.5 個數(shù)量級，但該模型對歐洲土壤的預測結果較差。

（3）對我國和歐洲18 個地區(qū)土壤的理化性質和毒性閾值進行相關性分析，建立了適用范圍更廣泛的預測模型，可較為準確地預測我國和歐洲土壤中Mo 對大麥的毒性閾值。