金季也，吳甘霖，黨菲

（1.安慶師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，安徽 安慶 246133；2.安慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 安慶 246133；3.中國科學(xué)院南京土壤研究所土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點實驗室，南京 210008）

隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，人工金屬納米材料不可避免地釋放到土壤中，其生態(tài)及健康風(fēng)險引起廣泛關(guān)注。然而，近年來越來越多的證據(jù)表明，環(huán)境中存在大量天然成因的金屬納米顆粒[1]。例如，水環(huán)境中溶解性有機質(zhì)在光照下通過產(chǎn)生羥基自由基將金、銀等離子還原成單質(zhì)納米顆粒[2-6]；土壤固相有機物表面的酚類基團在自然光照射下通過與氧氣的單電子傳遞產(chǎn)生超氧自由基，將銀離子還原為單質(zhì)納米銀[7]。此外，微生物胞外聚合物的羧基、羥基等官能團在光誘導(dǎo)下能將銀離子還原生成單質(zhì)納米銀[8]。可見，除了人工納米材料的輸入，自然界還存在著天然生成的金屬納米顆粒。這些納米顆粒的成因、地球化學(xué)功能和環(huán)境意義也受到了高度關(guān)注[9]。

植物作為生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是納米顆粒進入食物鏈的第一步。因此，研究植物與納米顆粒的相互作用意義重大。有研究基于植物體內(nèi)觀察到的金屬納米顆粒，得出金屬納米顆?？梢员恢参镆灶w粒形式直接吸收的結(jié)論[10]。BAO 等[11]將擬南芥（Arabi?dopsis thaliana）暴露于10 nm 單質(zhì)納米銀后，通過透射電子顯微鏡（TEM）和單顆粒電感耦合等離子體質(zhì)譜（spICP-MS）觀察到了根部和芽中的單質(zhì)納米銀，表明金屬納米顆?？杀恢参镏苯游蘸娃D(zhuǎn)運。DAN等[12]使用spICP-MS 發(fā)現(xiàn)番茄（Solanum lycopersicumL.）可在不改變顆粒性質(zhì)的情況下，直接吸收40 nm的單質(zhì)納米金。但是，越來越多的證據(jù)表明植物不僅能直接吸收金屬納米顆粒，還是金屬納米顆粒的“生物工廠”。例如，HAVERKAMP 等[13]用TEM 發(fā)現(xiàn)甘藍（Brassica juncea）可將銀離子還原生成粒徑為2～35 nm 的單質(zhì)納米銀，而且納米銀的產(chǎn)量和粒徑分布受初始銀離子還原電位影響[14]。LECLERC 等[15]用TEM、暗場顯微鏡和高光譜成像技術(shù)證明萊茵衣藻（Chlamydomonas reiinhardtii）可將銀離子還原為2～11 nm 的單質(zhì)納米銀；LI 等[16]將大豆（Glycine max）與水稻（Oryza sativaL.）兩種植物的葉面和根部分別暴露于銀離子后，用spICP-MS 在葉片中檢測到粒徑為30～40 nm 的納米銀。因此，植物體內(nèi)的金屬納米顆粒可能源于植物直接吸收的金屬納米顆粒，也可能是植物吸收金屬離子后的還原產(chǎn)物[15-17]。這些研究拓展了金屬納米顆粒與植物相互作用的認知，也為制備金屬納米顆粒提供了新的思路。

尤為重要的是，與傳統(tǒng)化學(xué)方法相比，植物合成法具有溫和、與生物兼容性高等優(yōu)勢[18-20]。這些優(yōu)點使得植物合成的金屬納米顆粒在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生物醫(yī)藥、環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域被更廣泛應(yīng)用。相較于制備方法的表觀描述，目前人們對植物合成金屬納米顆粒的反應(yīng)過程的認知仍然有限。本文介紹了植物介導(dǎo)金屬納米顆粒合成的研究進展，重點介紹了植物體內(nèi)金屬納米顆粒的表征及反應(yīng)過程，并在此基礎(chǔ)上展望了植物合成金屬納米顆粒的應(yīng)用。

1 植物介導(dǎo)金屬納米顆粒的合成

表1 列出了不同植物介導(dǎo)金屬納米顆粒合成的研究。目前大多研究聚焦于金、銀等氧化還原電位較低的金屬，并且通常使用生物量小、生長周期短的草本/禾本植物。一方面，不同植物產(chǎn)生的納米顆粒的尺寸和形狀不同，如紫花苜蓿（Medicago sativa）可介導(dǎo)2～4 nm 十二面體納米銀的生成[22]，而大豆（Glycine max）可促使36～49 nm 納米銀生成[16]；另一方面，即便是同一植物，其不同部位也可產(chǎn)生不同粒徑的納米顆粒，如沙漠葳（Chilopsis Linearis）介導(dǎo)生成納米金的實驗中，根部的納米金粒徑為2.9～6.0 nm，莖中納米金粒徑為9.2～17.2 nm，葉片中納米金粒徑為3.7～9.4 nm[28]。這些結(jié)果表明，不同植物不同部位介導(dǎo)納米顆粒異向生長的物質(zhì)并不相同。

表1 不同植物介導(dǎo)的金屬納米顆粒合成Table 1 The formation of metallic nanoparticles within different plants

2 植物體內(nèi)金屬納米顆粒的鑒別與表征

植物體內(nèi)金屬納米顆粒的鑒別、表征和定量分析是研究其地球化學(xué)功能和環(huán)境意義的重要環(huán)節(jié)[9]。由于植物體內(nèi)金屬含量比較低（通常只有mg·kg-1水平，甚至更低），且其納米顆粒反應(yīng)活性高，易與植物基體結(jié)合，在復(fù)雜植物基體中追蹤納米顆粒是十分困難的。因此，研究者往往采用多種分析方法相結(jié)合的方式鑒別和表征植物體內(nèi)的金屬納米顆粒。

電子顯微技術(shù)是常見的生物體內(nèi)金屬納米顆粒的分析技術(shù)，如透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）。研究人員在電鏡下可直觀地觀察到顆粒的尺寸、形狀、團聚等信息。通過統(tǒng)計大量納米顆粒的尺寸，即可得到顆粒的尺寸分布。此外，結(jié)合X射線衍射儀（XRD）、能量色散X 射線光譜儀（EDX）或選區(qū)電子衍射儀（SAED），可得到顆粒的元素組成和物相結(jié)構(gòu)。NORUZI 等[30]通過月季（Rosa hybrida）花瓣提取物合成10 nm納米金時，使用XRD觀察到產(chǎn)物具有高純度和面心立方結(jié)構(gòu)；SATHISHKUMAR 等[31]以八角茴香（Illicium verum）為原料合成納米金，通過TEM-EDX 等證實了三角形和六邊形金納米晶的存在；GUO 等[32]在杜仲（Eucommia ulmoides）樹皮水提物合成納米金的實驗中，通過高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）、EDX 和XRD 證實合成了具有面立方晶體結(jié)構(gòu)的球形單質(zhì)納米金。然而，電鏡技術(shù)制樣復(fù)雜、僅能提供樣本的局部信息，且觀測樣品需要一定的濃度，這些因素限制了電鏡技術(shù)在植物體內(nèi)納米顆粒表征上的應(yīng)用。

暗場高光譜成像（DF-HSI）可對植物細胞中的金屬納米顆粒進行元素確認和成像[15，33-34]。它無需制備復(fù)雜樣品，避免了常見成像技術(shù)樣品制備中（如標(biāo)記、染色等）可能造成的偽影；但是該方法檢出限較高，所獲得的二維圖像可能與細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)混淆。納米計算機斷層掃描（nano-CT）是在自然狀態(tài)下觀察完整細胞內(nèi)部三維納米結(jié)構(gòu)的理想技術(shù)之一[35]。它能從二維X 射線圖像堆棧中對細胞內(nèi)部物質(zhì)、器官等體積進行三維重建，可以獲得高對比度和高分辨率的三維圖像[36]；但是nano-CT 檢出限較高，且需結(jié)合其他技術(shù)（如X 射線熒光）進行元素分析。AVELLAN 等[33]使用DF-HIS 檢測到了擬南芥（Arabidopsis thaliana）根部細胞上約12 nm 的納米金，并使用nano-CT 對納米金進行定位成像，證實根冠上的細胞和脫離根部的邊界細胞都可以吸收納米金。

單顆粒電感耦合等離子體質(zhì)譜（spICP-MS）是一種新興的分析植物樣本中納米顆粒的技術(shù)。研究人員通常使用提取劑（如離析酶R-10[11-12]）將植物體內(nèi)的金屬納米顆粒分離出來（該過程中金屬納米顆粒不會溶出或團聚），經(jīng)稀釋后利用spICP-MS定量分析金屬納米顆粒的尺寸分布和顆粒濃度。目前，該技術(shù)已被成功應(yīng)用于植物中納米銀[16]、納米金[12]等金屬納米顆粒的定量表征。spICP-MS 表征的植物體內(nèi)金屬納米顆粒的尺寸與電鏡技術(shù)分析的結(jié)果一致[11，16]。與電鏡技術(shù)相比，spICP-MS 可測定環(huán)境濃度的植物樣品，且能同時對植物中金屬納米顆粒的尺寸分布和顆粒濃度進行定量分析[12，16，37]。因此，spICP-MS 具有廣闊的應(yīng)用前景。然而與電鏡技術(shù)相似，spICP-MS 不能分析植物體內(nèi)金屬納米顆粒的全部化學(xué)形態(tài)，需要結(jié)合其他手段才能獲得更完整的信息。

隨著同步輻射（SR）技術(shù)的日益完善，SR-X 射線熒光圖譜（SR-XFM）和原位X射線吸收光譜（XAS）也被用于表征植物體內(nèi)金屬納米顆粒的化學(xué)形態(tài)[23，38-40]。WANG 等[41]將黃瓜（Cucumis sativus）與小麥（Triticum aestivumL.）暴露于10 mg·L-1銀的納米硫化銀（Ag2S-NPs），通過XAS 發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)的銀大多以Ag2S形式存在；同時用X射線熒光顯微鏡（XFM）發(fā)現(xiàn)黃瓜葉脈和組織間銀濃度較高，而小麥葉片中銀的分布較為均勻。然而，由于檢出限高，且同步輻射裝置難以普及，SR技術(shù)的廣泛使用仍具有挑戰(zhàn)性。

3 植物介導(dǎo)金屬納米顆粒合成的過程

目前學(xué)者對植物介導(dǎo)金屬納米顆粒合成的過程尚不完全清楚。大多數(shù)研究基于植物提取液實驗，即利用植物組織勻漿液在一定環(huán)境條件下與金屬離子反應(yīng)的實驗方法制備金屬納米顆粒。該方法具有條件易于控制、操作簡便等優(yōu)點。但是該方法忽視了植物組織之間的關(guān)聯(lián)性及植物的整體性，無法從個體水平全面揭示反應(yīng)的內(nèi)在機制。

表2 總結(jié)了不同植物提取物合成金屬納米顆粒的研究，大部分研究集中在銀、金、鉑和鈀等貴金屬?；诒? 所列研究，本文總結(jié)了植物合成金屬納米顆粒的主要過程（圖1）。

圖1 植物體內(nèi)合成金屬納米顆粒的過程示意圖Figure 1 Formation of metallic nanoparticles within plants

表2 不同植物提取物合成金屬納米顆粒Table 2 Formation of metallic nanoparticles in different plant extracts

3.1 有機酸

UMADEVI 等[45]發(fā)現(xiàn)新鮮番茄（Solanum lycopersi?cum）的提取液可將銀離子還原成10 nm 球形單質(zhì)納米銀。植物提取物的傅立葉變換紅外吸收光譜（FT?IR）結(jié)果表明，蘋果酸和檸檬酸是植物合成納米銀的驅(qū)動力。由于銀納米顆粒表面吸附了檸檬酸根和蘋果酸根，其表面帶有負電荷，生成的顆粒較為穩(wěn)定。同時，UMADEVI 等[48]使用紅外光譜發(fā)現(xiàn)胡蘿卜（D.carota）提取物合成的20 nm球形單質(zhì)納米銀表面存在維生素C，可介導(dǎo)特定形狀與尺寸的單質(zhì)納米銀的生成，說明維生素C可以作為還原劑和（或）封端劑。

3.2 還原性糖類

還原性糖類具有羥基、半縮醛和其他官能團，在金屬納米顆粒的還原和穩(wěn)定中具有重要作用[63]。有研究發(fā)現(xiàn)納米顆粒的生成伴隨著還原糖含量的下降，證明這些糖類參與了納米顆粒合成。鄭炳云等[64]利用側(cè)柏（Cacumen platycladi）葉水提取液還原氯金酸溶液制備單質(zhì)納米金，發(fā)現(xiàn)提取液中還原糖類的含量降幅高達56.7%，證明了還原性糖類對納米金的生成具有重要作用。SONG 等[65]在利用稻殼（Oryza sativaL.）提取物合成納米銀的前后，對稻殼提取物中代謝物進行定量分析，發(fā)現(xiàn)左旋葡聚糖、葡萄糖、6-磷酸海藻糖和6-磷酸葡萄糖這幾種物質(zhì)參與合成后含量幾乎降低至0，說明糖及其衍生物很可能充當(dāng)了還原劑。BEATTIE 等[14]在芥菜（Brassica juncea）提取物還原生成納米金和納米銀的研究中發(fā)現(xiàn)，納米顆粒最多的位置是葉綠體，即高還原糖（葡萄糖和果糖）含量的區(qū)域。

3.3 蛋白質(zhì)、氨基酸及多肽

XIE 等[66]在室溫條件下使用單細胞綠藻小球藻（Chlorella vulgaris）提取物合成了厚度為9～20 nm 的片狀單質(zhì)納米金，發(fā)現(xiàn)藻提取物的FTIR 光譜具有蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ譜帶的特征吸收峰，X 射線光電子能譜（XPS）分析表明吸附在單質(zhì)納米金上的主要生物分子是蛋白質(zhì)；通過透析原始藻提取物并測試不同分子量組分的還原能力，發(fā)現(xiàn)大于12 kDa 的高分子量組分促進了單質(zhì)納米金生成，而小于12 kDa 的低分子量組分卻不能合成單質(zhì)納米金；通過反相高效液相色譜（RP-HPLC）將高分子量組分進一步分離為8 個組分，發(fā)現(xiàn)部分組分可生成單質(zhì)納米金（產(chǎn)率約50%）；用RP-HPLC 對該組分再次細分后發(fā)現(xiàn)，其能引導(dǎo)近90%單質(zhì)納米金生成的組分，并基于此純化得到分子量約為28 kDa 的蛋白（金形狀導(dǎo)向蛋白，GSP）。通過對比研究不含GSP 藻類提取物，研究者最終證明GSP 是負責(zé)單質(zhì)納米金合成和形狀控制的主要蛋白質(zhì)。同樣地，該團隊分離出的藻蛋白（aP）[67]，可合成球形[平均直徑為（44±6）nm]、棒狀[平均厚度為（20±4）nm]和三角形的單質(zhì)納米銀。通過對aP 進行化學(xué)修飾發(fā)現(xiàn)，藻蛋白中酪氨酸（Tyr）殘基中的羥基驅(qū)動納米銀的生成，而天冬氨酸（Asp）殘基中的羧基及（或）谷氨酸（Glu）殘基中的羧基驅(qū)動銀納米晶向納米板的異向生長。

MASUM等[42]將余甘子（Phyllanthus emblicaLinn.）的果實簡單提取后合成平均粒徑為39 nm 的球形單質(zhì)納米銀。FTIR 分析的結(jié)果證實余甘子提取物中羥基、胺基與酰胺Ⅰ對單質(zhì)納米銀的生成具有重要作用。JAGTAP 等[50]使用菠蘿蜜（Artocarpus heterophyl?lusLam.）種子粉末的水溶液與硝酸銀溶液合成了平均粒徑為3～25 nm的不規(guī)則單質(zhì)納米銀，F(xiàn)TIR光譜結(jié)果表明氨基酸和酰胺Ⅰ在合成過程中發(fā)揮了重要作用。TAN 等[68]研究了20種天然α-氨基酸合成納米金的能力，根據(jù)淡黃色氯金酸溶液轉(zhuǎn)變?yōu)榈t色納米金溶液所需時間進行排序，發(fā)現(xiàn)色氨酸（Trp）是最快的還原劑；通過不同氨基酸排列結(jié)合的方式，研究者發(fā)現(xiàn)氨基酸殘基的種類、數(shù)量及多肽本身空間結(jié)構(gòu)會共同影響多肽的還原能力，而不是簡單地等同于各氨基酸還原能力之和。

3.4 自由基

自由基在植物生理活動中扮演著重要角色。植物中自由基主要包括超氧陰離子自由基（O-2·）、羥基自由基（·OH）、氫過氧自由基（HOO·）、脂質(zhì)過氧自由基（ROO·）、烷氧基（RO·）和半醌自由基[69]等。過氧化氫（H2O2）及單線態(tài)氧（1O2）雖不是自由基，但它們對某些物質(zhì)的反應(yīng)活性高于基態(tài)氧，在植物體內(nèi)起到類似于自由基的作用，故研究人員通常將其納入自由基范疇[70]。植物體內(nèi)自由基來源于自發(fā)的光氧化過程、嘌呤的分解代謝、哈伯·韋斯反應(yīng)、芬頓反應(yīng)、脂質(zhì)過氧化作用、過氧化氫或水的光解[70-71]。目前關(guān)于植物體內(nèi)自由基對金屬納米顆粒生成的影響尚未見報道。

已有證據(jù)表明在天然環(huán)境中各種途徑產(chǎn)生的自由基可誘導(dǎo)金屬納米顆粒的生成。例如，水環(huán)境中溶解性有機質(zhì)中酚基在光照下產(chǎn)生羥基自由基等，將金、銀等離子還原成單質(zhì)納米顆粒[2-6]。在自然光照條件下，土壤固相有機物表面酚類基團可通過與氧氣的單電子傳遞產(chǎn)生超氧自由基，將銀離子還原為單質(zhì)納米銀[7]。據(jù)此推測，自由基在植物體內(nèi)金屬納米顆粒的生成過程中可能發(fā)揮重要作用。然而，自由基猝滅速度非?？?，為了準(zhǔn)確捕捉自由基，需要對植物進行預(yù)處理；而預(yù)處理會使植物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，與自由基相關(guān)的活性物質(zhì)也會發(fā)生變化，進而影響對其反應(yīng)過程的探究。因此，亟需在該方向上深入開展更多研究。

4 植物合成金屬納米顆粒的應(yīng)用

相比傳統(tǒng)的化學(xué)合成法，植物合成的金屬納米顆粒具有生物兼容性。SATHISHKUMAR 等[31]對比研究了八角茴香（Illicium verum）提取物合成的納米金及檸檬酸鈉和硼氫化鈉還原法合成的納米金對人體肺泡上皮細胞（A549）的毒性，發(fā)現(xiàn)暴露于植物合成納米金的細胞活性為80.2%，顯著高于暴露于化學(xué)合成的納米金（65.7%和72.3%），這可能是由于提取物中多酚化合物在納米表面形成了保護涂層。NADAGOUDA 等[72]研究發(fā)現(xiàn)，與硼氫化鈉合成的納米零價鐵相比，茶葉提取物（紅茶粉，印度Tata公司半成品）合成的納米零價鐵對角質(zhì)形成細胞（HaCaT）的細胞增殖、線粒體功能及細胞膜完整性均沒有明顯抑制作用。

生物兼容性使得植物合成的金屬納米顆粒具有環(huán)境友好性，可被應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境修復(fù)等諸多領(lǐng)域[73-74]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面，長春花（Catharan?thus）[75]、巨型牛角瓜（Calotropis giganteanL.）[76]、三葉茄（Solanum trilobatumL.）[77]等植物提取物合成的納米二氧化鈦（TiO2-NPs）能有效殺滅各種寄生蟲的幼蟲，保護農(nóng)作物和動物。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，羊角草（Pan?cratium parvum）合成的納米金具有抗氧化和抗炎活性，并具有抑制乙酰膽堿酯酶（AChE）的作用，可輔助治療阿爾茨海默氏病[78]；黃楊（Salacia chinensisL.）提取物合成的納米銀可抑制肝癌（Hep G2）、肺癌（L-132）、胰腺癌（MIA-Pa-Ca-2）、乳腺癌（MDA-MB-231）、口腔癌（KB 細胞）、前列腺癌（PC-3）、宮頸癌（HeLa）等細胞生長，其半抑制濃度分別為6.310、4.002、5.228、8.452、14.370、7.460 μg·mL-1和6.550 μg·mL-1，展現(xiàn)了強大的抗癌活性，且對人的成纖維細胞和血紅細胞無毒性，有望用于癌癥治療[79]。HOAG等[80]用茶（Camellia sinensis）提取物合成的納米零價鐵有效催化了溴百里酚藍（BTB）的降解，鐵濃度和過氧化氫濃度均為0.33 mmol·L-1時，BTB 氧化的初始速率常數(shù)可達到0.144 7，可作為氧化劑用于水污染[81]或土壤污染治理[82]。

5 展望

關(guān)于植物介導(dǎo)金屬納米顆粒合成的研究還處于起步階段，尚有很多問題需要深入研究，歸結(jié)起來主要有以下幾方面需要加強：

（1）目前仍缺乏對植物體內(nèi)金屬納米顆粒合成過程及機理的認識。多數(shù)研究表明植物提取物中某些生物大分子，如蛋白質(zhì)、還原性糖類參與了金屬納米顆粒的合成。但植物體內(nèi)的生化過程極其復(fù)雜，這些生物大分子并不能完全揭示合成的全部過程，應(yīng)用代謝、蛋白及基因等組學(xué)有望進一步全面揭示金屬納米顆粒合成的過程及機制，尤其是自由基在植物體內(nèi)金屬納米顆粒合成中的作用研究仍是空白，亟需深入開展。

（2）植物體內(nèi)金屬納米顆粒的環(huán)境濃度表征是一項重要的技術(shù)挑戰(zhàn)。目前較為常見的表征方法是單顆粒電感耦合等離子體質(zhì)譜（spICP-MS）和電鏡技術(shù)，但是這些單一方法都存在不足。只有通過多種方法手段的綜合應(yīng)用才能更為客觀地表征植物體內(nèi)的金屬納米顆粒。

（3）目前仍缺乏用于評估植物合成金屬納米顆粒毒性的標(biāo)準(zhǔn)研究方法和體系。大多研究采用表觀指標(biāo)（如細胞存活率）進行評價，這些指標(biāo)是否具有代表性仍不清楚。同時，此類評估研究大多在實驗室細胞培養(yǎng)液中進行，很少考慮環(huán)境因素及生物體（如蛋白冠）的影響。由于納米顆粒的性質(zhì)受環(huán)境介質(zhì)和生物環(huán)境的影響會發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)化，進而影響其生物有效性及毒性，因此需要加強對這些納米顆粒環(huán)境轉(zhuǎn)化及生物轉(zhuǎn)化的研究。同時，現(xiàn)有研究往往是高劑量短期暴露試驗，缺乏低劑量長期暴露試驗。上述問題不僅限制了納米顆粒與植物相互作用的理論探索，還制約了金屬納米顆粒的大規(guī)模應(yīng)用，因而亟需開展系統(tǒng)性研究。