張琪，徐軻，欒慶剛，彭躍，李建立，張莉，張明

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康系，北京 100191；2.山東得益乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心，山東 淄博 265200；3.北京市門頭溝區(qū)醫(yī)院，北京 102300；4.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048）

0 引言

益生菌是一類能夠經(jīng)過消化系統(tǒng)改善人體健康作用的微生物，可以通過定殖于人體的腸道、生殖系統(tǒng)改善人體內(nèi)的微生態(tài)平衡，對人體健康具有重要意義，直接或間接影響到人體免疫、癌癥、糖尿病、過敏、肥胖、情緒等[1-2]。雙歧桿菌是健康人腸道內(nèi)的一種重要的益生菌，具有改善腸道微生態(tài)環(huán)境、潤腸通便、免疫調(diào)節(jié)等功能[3-5]。酸奶是益生菌的優(yōu)質(zhì)載體，也是益生菌產(chǎn)品應(yīng)用的主要形式[6]，益生菌酸奶市場的龐大與高增速反應(yīng)了消費者的需求，也對益生菌的功能開發(fā)提出了更高的要求。

雙歧桿菌改善腸道健康功能研究已有較多研究。王曉成等人[7]發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌對小鼠腸道形態(tài)的發(fā)育有重要作用。其對便秘的緩解作用也有較多發(fā)現(xiàn)，Ohkusa等[8]發(fā)現(xiàn)便秘人群的腸道菌群與健康人群不同。Halloran等[9]發(fā)現(xiàn)補充雙歧桿菌能夠改變腸道的微生態(tài)環(huán)境。Miller等[10]通過給便秘的成人補充雙歧桿菌，每周可增加排便0.83次，有效縮短了腸道運轉(zhuǎn)時間。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌在緩解便秘過程中改變了腸道短鏈脂肪酸的含量，推測乙酸和丁酸含量對緩解便秘有關(guān)鍵作用。然而，并非所有的雙歧桿菌都具有潤腸通便的作用，通過菌種的篩選優(yōu)化和實際功能效果驗證才能最終確定[12]。

本研究使用了一株篩選自廣西巴馬地區(qū)長壽老人的乳雙歧桿菌IU-100（也稱動物雙歧桿菌乳酸亞種IU-100，IU-100），通過動物試驗和人群試驗，探究IU-100菌株對便秘小鼠和人群的通便作用，以期為其在乳制品中更好的應(yīng)用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis）IU-100，分離自廣西巴馬地區(qū)長壽老人腸道菌群，保藏編號CGMCC No.12693。

SPF級Balb/C雄性小鼠，6到8周齡，體重18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

活性炭粉，天津市華東試劑廠；阿拉伯樹膠，上海生工生物工程公司；復(fù)方地芬諾酯，常州康普藥業(yè)有限公司；生牛乳，山東得益乳業(yè)股份有限公司；白砂糖（食品級）、濃縮乳清蛋白，上海泛亞乳品有限公司；瓊脂、果膠及淀粉河南萬邦實業(yè)有限公司。

CP124S電子天平，賽多利斯儀器有限公司；APV2000均質(zhì)機，上海史恒儀器設(shè)備有限公司；EUROSTAR攪拌器，德國IKA公司；GNP-9080恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；BCD-195QM電冰箱，青島海爾股份有限公司。

IU-100發(fā)酵乳：生牛乳升溫至60℃，加入混合均勻的白砂糖、瓊脂、濃縮乳清蛋白、淀粉化料，均質(zhì)殺菌完畢，降溫至43℃；接種發(fā)酵劑和IU-100乳雙歧桿菌，攪拌混合均勻，在溫度43℃下，靜置發(fā)酵至滴定酸度大于70°T，得發(fā)酵乳；將制得的發(fā)酵乳破乳后冷卻至4℃，灌裝后轉(zhuǎn)入溫度為4℃的環(huán)境中進行冷藏后熟8 h，即得IU-100的發(fā)酵乳。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物設(shè)計

(1)分組及處理。SPF級Balb/C小鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為IU-100菌株高、中、低劑量組、BB-12陽性對照組、模型對照組和空白組。

空白組和模型組小鼠灌胃質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的脫脂乳0.1 mL/(kg·d)(以體質(zhì)量計)；IU-100低、中、高劑量組小鼠分別灌胃1×106、1×108、1×1010CFU/mL的菌懸液0.1 mL/(kg·d)(以體質(zhì)量計)；陽性對照組灌胃1×1010CFU/mL BB-12，每天一次，試驗期間自由進食。

(2)首粒排黑便時間、糞便粒數(shù)、糞便重量及糞便含水率測定。給受試樣品7 d后，各組小鼠禁食不禁水16 h。模型對照組、陽性對照組及3個劑量組小鼠灌胃復(fù)方地芬諾酯（10 mg/kg），空白對照組灌胃蒸餾水。灌胃復(fù)方地芬諾酯0.5 h后，空白對照組和模型對照組小鼠用墨汁（含5%活性炭粉、10%阿拉伯樹膠）灌胃，處理組給予含受試樣品的墨汁，動物均單籠飼養(yǎng)，正常飲水進食。從灌墨汁開始，記錄每只動物首粒排黑便時間、5 h內(nèi)排黑便粒數(shù)、重量，同時測定糞便含水率。

(3)小腸推進試驗。給受試樣品15 d后，各組小鼠禁食不禁水16 h。模型對照組和處理組灌胃復(fù)方地芬諾酯（5 mg/kg），空白對照組灌胃蒸餾水。灌胃復(fù)方地芬諾酯0.5 h后，處理組分別給予含受試樣品的墨汁，對照組給墨汁灌胃。25 min后脫頸椎處死小鼠，打開腹腔分離腸系膜，剪取上端自幽門、下端至回盲部的腸管，置于托盤上，輕輕將小腸拉成直線，測量腸管長度為“小腸總長度”，從幽門至墨汁前沿為“墨汁推進長度”，按下式計算墨汁推進率：

1.2.2 人群實驗設(shè)計

(1)便秘人群納入和排除標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～65歲，至少符合羅馬Ⅳ便秘的診斷標(biāo)準(zhǔn)中的兩項，如25%的排便為硬便、排便時有肛門直腸梗阻感、排便不完全感、需要輔助促進排便以及每周排便少于3次，且持續(xù)3個月時，則診斷為便秘[13]。

排除標(biāo)準(zhǔn)：器質(zhì)性疾病、藥物、精神心理因素引起的便秘,試驗前兩周服用促胃腸動力藥和微生態(tài)制劑。

(2)受試者干預(yù)和評價方法。招募50名便秘志愿者，經(jīng)過7 d排空期后，進行28 d飲用期，分別在排空期結(jié)束和飲用期結(jié)束進行臨床癥狀評分，包括每周排便次數(shù)、糞便性狀布里斯托分?jǐn)?shù)[14]、及排便狀況積分[15]。在整個實驗過程中，受試者不可飲用任何發(fā)酵食品（包括泡菜、酸菜、腐乳、豆豉、酸奶、奶酪、活性發(fā)酵乳飲料等）和其他益生菌產(chǎn)品。按下式計算癥狀評分改善率：

顯效：各項癥狀明顯減輕，癥狀評分改善率≥50%；有效：各項癥狀有所減輕，癥狀評分改善率25%～49%；無效：各項癥狀無明顯變化，癥狀評分改善率。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。動物實驗不同處理方法之間均值比較采用單因素方差分析進行差異顯著性檢驗，受試者的社會人口學(xué)特征，使用描述性統(tǒng)計(百分比、平均值和標(biāo)準(zhǔn)差)。干預(yù)前后分別采用曼-惠特尼(Mann-Whitney)檢驗進行組內(nèi)比較，所有的統(tǒng)計分析都采用統(tǒng)計軟件SPSS17.0版，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 IU-100對小鼠糞便重量、首次排黑便時間及糞便顆粒影響

小鼠經(jīng)口灌胃IU-100菌株，7 d后測定便秘模型小鼠糞便重量、首次排黑便時間、糞便顆粒數(shù)目的影響，如圖1所示。與空白對照組相比，模型組動物糞便重量和糞便顆粒顯著降低（P＜0.01），首次排黑便時間顯著增加，說明便秘小鼠模型成立。與模型組相比，不同劑量IU-100均增加小鼠排便顆粒和糞便重量，縮短便秘小鼠首次排便時間，尤其是中劑量組樣品，首次排黑便時間與模型組有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），且作用效果優(yōu)于陽性對照菌株。

圖1 乳雙歧桿菌IU-100對小鼠糞便重量（a）、首次排黑便時間（b）及糞便顆粒（c）影響

2.2 IU-100對小鼠糞便含水量影響

實驗小鼠經(jīng)口灌胃IU-100菌株，連續(xù)7 d后測定所有分組小鼠糞便含水量，結(jié)果如圖2所示。與空白對照組相比，模型組動物糞便含水量降低，與模型組相比，中劑量IU-100顯著提高小鼠糞便含水量（P＜0.05）。

圖2 乳雙歧桿菌IU-100對小鼠糞便含水量影響

2.3 IU-100對小鼠腸道墨汁推進率影響

實驗動物灌胃IU-100活菌15 d后，做小腸推進試驗，各組小鼠腸道墨汁推進率如圖3所示。結(jié)果表明，模型組墨汁推進率顯著低于空白組（P＜0.01），小鼠便秘模型成立。IU-100菌株干預(yù)15 d，各劑量組小鼠墨汁推進率均顯著高于模型組，其中低、高劑量組達到極顯著水平，與空白對照接近。IU-100各組與陽性對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。研究結(jié)果表明，IU-100菌株能顯著增進便秘小鼠小腸蠕動，促進腸內(nèi)容物的推進，對便秘小鼠具有潤腸通便功能。

圖3 乳雙歧桿菌IU-100對小鼠腸道墨汁推進率影響

2.4 便秘受試者基本情況統(tǒng)計

招募50名志愿者，期間由于流感、服藥等因素退出5人，完成試驗45人，受試者年齡、體重、性別等信息如表1所示。

表1 受試者飲用前基本情況

2.5 IU-100對便秘受試者的影響

IU-100發(fā)酵酸奶對便秘受試者癥狀的影響如表2所示，飲用IU-100發(fā)酵酸奶28 d后，受試者排便次數(shù)、糞便性狀和排便狀況積分得到顯著改善，有效率分別達到91.1%，88.9%和97.8%，表明IU-100發(fā)酵酸奶具有潤腸通便的作用。

表2 便秘受試者癥狀積分比較

便秘是一種常見的胃腸道疾病，不僅影響人們身心健康，而且給工作和生活帶來困擾[16]。滲透性瀉劑是目前治療便秘的主要方法，這一方式有藥物依賴性，長時間服用會導(dǎo)致胃腸道功能受損，給患者帶來不利影響[17]。與相關(guān)藥物相比，研究發(fā)現(xiàn)益生菌對改善便秘相關(guān)癥狀有有益影響，如乳雙歧桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌等益生菌可通過其對腸道微生物群及其代謝產(chǎn)物、中樞和腸道神經(jīng)系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)的影響，幫助促進腸道運動和改善便秘癥狀[18-19]。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)乳雙歧桿菌IU-100發(fā)酵乳可顯著增加便秘小鼠糞便含水量，縮短首次排黑便時間，促進小腸墨汁推進率。人群實驗結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)IU-100可顯著改善便秘人群的排便次數(shù)、糞便性狀及排便狀況積分。以上結(jié)果表明IU-100具有潤腸通便的功效，為進一步研發(fā)及工業(yè)化應(yīng)用IU-100產(chǎn)品提供了理論基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

本研究分別利用便秘動物和人群評價了IU-100緩解便秘的作用，結(jié)果表明，IU-100能顯著改善便秘小鼠首次排黑便時間、增加排黑便粒數(shù)和重量，顯著提高便秘小鼠小腸墨汁推進率，同時，IU-100發(fā)酵酸奶可顯著改善便秘人群的排便次數(shù)、糞便性狀和排便狀況積分，具有潤腸通便作用。