鄧立康， 劉佳昕， 劉曉峰， 吳又多， 程 馳， 薛 闖*

(1.國投生物能源(鐵嶺)有限公司，遼寧 鐵嶺 112700；2.大連理工大學 生物工程學院，遼寧 大連 116024)

化石燃料的持續(xù)使用引起了空氣中CO2濃度持續(xù)增加等一系列的環(huán)境問題，嚴重危害到全球的氣候。因此，尋找和開發(fā)綠色、清潔、低碳、環(huán)保的可再生能源迫在眉睫。習近平主席在第七十五屆聯(lián)合國大會一般性辯論上提出，中國“力爭于2030年前實現(xiàn)碳達峰，努力爭取2060年前實現(xiàn)碳中和”的目標，對能源轉(zhuǎn)型提出了迫切的要求。以生物乙醇、丁醇和己醇為代表的液體生物燃料，作為可再生能源及重要的生物基化學品，具有廣泛的應用前景。到目前為止，生物乙醇是全球交通運輸中使用最廣泛的生物燃料。丁醇是繼燃料乙醇之后又一個備受矚目的可再生生物燃料，其與汽油熱值相近(丁醇 29.2 MJ/L，汽油32 MJ/L)[1]，使其成為潛在的優(yōu)良的生物替代能源之一；丁醇在食品領(lǐng)域被廣泛用作溶劑，是有機合成的重要前體；己醇是一種高附加值中鏈醇，因其具有高能量密度、低水溶性和低揮發(fā)性等特點可與汽油混合作為燃料使用，近些年也越來越受到研究人員的廣泛關(guān)注，在醫(yī)藥化工領(lǐng)域，己醇也是許多產(chǎn)品的重要前體原料[2]。生物煉制是近年來生產(chǎn)大宗化工產(chǎn)品的首選綠色可持續(xù)工藝。利用生物法生產(chǎn)乙醇、丁醇、己醇等生物基醇類化學品，其反應條件溫和可控，有害副產(chǎn)物遠低于化學合成[3]，有助于推動能源轉(zhuǎn)型和碳中和目標實現(xiàn)。合成氣是一種供化學合成用的原料氣，以CO2、CO和H2為主要組分。其原料來源廣泛，既可由化石燃料煤或焦炭等固體燃料氣化產(chǎn)生，也可由農(nóng)林廢棄物等生物質(zhì)通過氣化產(chǎn)生。以農(nóng)林廢棄物等生物質(zhì)為原料生產(chǎn)合成氣進行醇類發(fā)酵的一般過程：首先將農(nóng)林廢棄物氣化轉(zhuǎn)化為以CO2、CO和H2為主要組分的合成氣，再通過化學催化和微生物發(fā)酵將合成氣轉(zhuǎn)化為燃料乙醇等液體燃料以及其他生物基醇類化合物和精細化學品等。相較于傳統(tǒng)的生物煉制工藝，以農(nóng)林生物質(zhì)、市政廢棄物為初始原料的合成氣進行乙醇發(fā)酵不僅可以避開與糧食供應的競爭，而且還有效避開纖維原料酸、酶水解的技術(shù)障礙，并且克服了傳統(tǒng)生物轉(zhuǎn)化過程中木質(zhì)素不能被有效利用的缺陷，避免了糖酵解途徑中CO2的釋放，有效提高了碳原子的利用率，降低了原料成本，減少了發(fā)酵過程的CO2排放。與化學催化合成法相比，合成氣發(fā)酵具有反應條件溫和，產(chǎn)物得率高，副產(chǎn)物少，對CO和H2比例要求不嚴格，以及對硫化物耐受性高等優(yōu)點[4]。此外，氣化過程可將原料中所有組分轉(zhuǎn)化為以CO2、CO和H2為主要組分的合成氣，可消除原料之間的化學差異性，一些有毒或難降解的有機物也可通過氣化、發(fā)酵等過程，轉(zhuǎn)化為乙醇和其他有用化學品[4]。目前雖然基于合成氣轉(zhuǎn)化的生物基醇類化學品已實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)，但是其產(chǎn)物濃度及生產(chǎn)強度不高，設備及生產(chǎn)過程成本較高，市場占有率還很低[5]。本文針對利用合成氣生產(chǎn)生物基醇類化學品的研究現(xiàn)狀，從代謝途徑、菌株改造、發(fā)酵過程、合成氣成分氣液傳質(zhì)幾方面入手，討論了合成氣利用及醇類產(chǎn)物合成的研究現(xiàn)狀，并探討了存在的問題及未來的研究方向。

1 Wood-Ljungdahl途徑與產(chǎn)乙酸菌的能量節(jié)約機制

1.1 產(chǎn)乙酸菌的Wood-Ljungdahl途徑

產(chǎn)乙酸菌(Acetogen)，即可以通過Wood-Ljungdahl途徑(也稱為還原性乙酰輔酶A途徑，Reductive Acetyl-CoA Pathway)作為主要能量代謝機制，利用CO2合成乙酰輔酶A的嚴格厭氧菌[6]。在Wood-Ljungdahl途徑中，細胞利用還原力(H2, NAD(P)H, FdH2)將CO2還原成乙酰輔酶A(圖1)。Wood-Ljungdahl途徑可以分為甲基分支(Methyl Branch，也稱為Eastern Branch)和羰基分支(Carbonyl Branch，也稱為Western Branch)。在甲基分支中，CO2首先在甲酸脫氫酶(Formate Dehydrogenase, FDH)的作用下轉(zhuǎn)化為甲酸，然后在甲酰四氫呋喃合酶(Formyl-THF Synthase, FTHFS)、甲酰四氫呋喃環(huán)化水解酶(Formyl-THF Cyclohydrolase, FTC)、亞甲基四氫呋喃脫氫酶(Methylene-THF Dehydrogenase, MTDH)、亞甲基四氫呋喃還原酶(Methylene-THF Reductase, MTHFR)和轉(zhuǎn)甲基酶(Methyltransferase, MTF)的依次作用下，生成甲基-鈷鐵硫蛋白(Methyl-CoFeSP)。在羰基分支中，CO2在一氧化碳脫氫酶(CO Dehydrogenase, CODH)的作用下轉(zhuǎn)化為CO。甲基分支的產(chǎn)物甲基-鈷鐵硫蛋白與羰基分支的產(chǎn)物CO(或來自于合成氣的CO)在一氧化碳脫氫酶/乙酰輔酶A合酶(Acetyl-CoA synthase, ACS)復合體(CODH/ACS)的催化下，生成乙酰輔酶A[7]。乙酰輔酶A可以在磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(Phosphotransacetylase, PTA)以及乙酸激酶(Acetate Kinase, ACK)的催化下進一步生成乙酸，或在醛/醇脫氫酶(Aldehyde/Alcohol Dehydrogenase, AdhE2)的作用下生成乙醇。乙酸也可以在醛:鐵氧還蛋白氧化還原酶(Aldehyde:ferredoxin Oxidoreductase, AOR)及醇脫氫酶(ADH)或AdhE2的催化下轉(zhuǎn)化為乙醇。乙酰輔酶A進行碳鏈延長可生成丁酰輔酶A、己酰輔酶A，繼而生成丁酸、丁醇、己酸、己醇等。合成醇類生物基化學品常用的產(chǎn)乙酸菌包括可以合成乙醇的楊氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、自產(chǎn)乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)以及可以合成乙醇、丁醇、己醇的食一氧化碳梭菌(Clostridiumcarboxidivorans)、克魯維梭菌(Clostridiumkluyveri)、ClostridiumragsdaleiP11等。

圖1 Wood-Ljungdahl途徑及其下游的乙醇、丁醇合成途徑Fig.1 The Wood-Ljungdahl pathway and ethanol and butanol synthesis pathwaysFDH: formate dehydrogenase(甲酸脫氫酶); FTHFS: formyl-THF synthase(甲酰四氫呋喃合酶); FTC: formyl-THF cyclohydrolase(甲酰四氫呋喃環(huán)水解酶); MTDH: methylene-THF dehydrogenase(亞甲基四氫呋喃脫氫酶); MTHFR: methylene-THF reductase(亞甲基四氫呋喃還原酶); MTF: methyltransferase(轉(zhuǎn)甲基酶); CODH: CO dehydrogenase(一氧化碳脫氫酶); ACS: acetyl-CoA synthase(乙酰輔酶A合酶); PTA: phosphotransacetylase(磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶); ACK: acetate kinase(乙酸激酶); PTB: phosphotransbutyrylase(磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶); BUK: butyrate kinase(丁酸激酶); AdhE2: aldehyde/alcohol dehydrogenase(醛/醇脫氫酶); AOR: aldehyde:ferredoxin oxidoreductase(醛:鐵氧還蛋白氧化還原酶); ADH: alcohol dehydrogenase(醇脫氫酶); HBD: hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase(羥基丁酰輔酶A脫氫酶); CRT: crotonase(烯酰水合酶); BCD: butyryl-CoA dehydrogenase(丁酰輔酶A脫氫酶)

1.2 產(chǎn)乙酸菌的能量節(jié)約機制

在Wood-Ljungdahl途徑的甲基分支中，每還原1 mol CO2，需要消耗1 mol ATP。在乙酰輔酶A或丁酰輔酶A合成乙酸或丁酸的過程中，每生成1 mol乙酸或丁酸，可以生成1 mol ATP；乙酰輔酶A或丁酰輔酶A生成乙醇或丁醇的過程中沒有ATP生成。因此，若產(chǎn)乙酸菌只能通過底物磷酸化合成ATP，則每固定CO2生成1 mol乙酸，ATP凈產(chǎn)量為0；每生成1 mol乙醇，ATP凈產(chǎn)量為-1 mol。為了保證細胞在生成醇類產(chǎn)物時能夠產(chǎn)生足量的ATP，產(chǎn)乙酸菌進化出了特別的能量節(jié)約機制，一方面利用基于黃素的電子歧化(Flavin-based Electron Bifurcation, FBEB)，將電子傳遞過程中的放熱與吸熱氧化還原反應偶聯(lián)[8]；另一方面將放熱反應(在產(chǎn)乙酸菌中通常是電子傳遞反應)與質(zhì)子的跨膜傳遞偶聯(lián)，并利用跨膜質(zhì)子(H+)或鈉離子(Na+)濃度梯度產(chǎn)生ATP[9]。研究發(fā)現(xiàn)，綜合考慮到產(chǎn)乙酸菌通過底物磷酸化、電子歧化及跨膜質(zhì)子或梯度產(chǎn)生的ATP，在野生型自產(chǎn)乙醇梭菌中，生成1 mol乙酸的凈ATP產(chǎn)量為1 mol，生成1分子乙醇的凈ATP產(chǎn)量為0.5 mol(乙醇由乙酰輔酶A在AdhE2催化下生成)或1.2 mol(乙醇由乙酰輔酶A在PTA、ACK、AOR、ADH的依次催化下生成)[10]。目前只有少數(shù)產(chǎn)乙酸菌的能量節(jié)約機制被深入研究，主要包括楊氏梭菌、醋酸桿菌(Acetobacteriumwoodii)、熱醋酸莫氏菌(Moorellathermoacetica)、自產(chǎn)乙醇梭菌等[9]。產(chǎn)乙酸菌的能量節(jié)約機制可以根據(jù)形成跨膜濃度梯度的離子(H+或Na+)及跨膜離子轉(zhuǎn)移蛋白(Rnf復合物或Ech復合物)分為幾類：Rnf復合物驅(qū)動質(zhì)子形成跨膜濃度梯度，Rnf復合物驅(qū)動鈉離子形成跨膜濃度梯度，以及Ech復合物驅(qū)動質(zhì)子形成跨膜濃度梯度。利用Ech復合物驅(qū)動跨膜鈉離子濃度梯度的產(chǎn)乙酸菌尚未發(fā)現(xiàn)[9]。質(zhì)子或鈉離子形成濃度梯度后，可以由細胞膜上的ATP酶(ATPase)生成ATP。楊氏梭菌可以利用Rnf復合物形成跨膜質(zhì)子濃度梯度[11]。另外，推測楊氏梭菌中的氫酶(HydABC)或氫酶-甲酸脫氫酶復合物具有電子歧化功能；其MTDH的輔因子為NADH，MTHFR的輔因子仍不能確定[9]。醋酸桿菌則是利用Rnf復合物驅(qū)動跨膜鈉離子濃度梯度的形成[12]，其氫酶具有電子歧化功能，可利用1 mol H2還原0.5 mol NAD+及0.5 mol 鐵氧還蛋白(Fd)[13]，它的MTDH及MTHFR的輔因子均為NADH[9]。熱醋酸莫氏菌利用Ech復合物驅(qū)動跨膜質(zhì)子濃度梯度形成，除了具有電子歧化能力的氫酶外，推測其MTHFR也具有電子歧化能力，而其MTDH消耗的輔因子為NADPH[9,14]。另外，楊氏梭菌與熱醋酸莫氏菌中都發(fā)現(xiàn)了電子歧化型轉(zhuǎn)氫酶(Electron-bifurcating transhydrogenase, Nfn)，可利用1 mol NADH及1 mol 還原型鐵氧還蛋白(FdH2)提供的還原力還原2 mol NADP+[9]。盡管產(chǎn)乙酸菌進化出了多種多樣的能量節(jié)約機制以適應在合成氣中的生長，自養(yǎng)生長條件下，供能不足依然是限制細胞生長代謝的重要因素，而醇類產(chǎn)物能量密度較高，與利用合成氣生產(chǎn)有機酸相比，生產(chǎn)醇類產(chǎn)物難度較大，需要對發(fā)酵菌株及過程進行深入的研究。

2 產(chǎn)乙酸菌的遺傳操作工具及代謝改造

2.1 產(chǎn)乙酸菌的遺傳操作工具

產(chǎn)乙酸菌大部分為革蘭陽性菌，細胞壁較厚，且具有復雜的限制修飾系統(tǒng)，限制了外源DNA的導入效率；另一方面，常用的遺傳操作技術(shù)如CRISPR/Cas、Red/ET等在產(chǎn)乙酸菌中缺乏深入研究。由于產(chǎn)乙酸菌的遺傳轉(zhuǎn)化效率較低、代謝改造工具較匱乏，而開發(fā)產(chǎn)乙酸菌的基因操作工具是對其進行代謝改造的先決條件。2013年，Leang等[15]探究了楊氏梭菌中可用的復制子，優(yōu)化了將質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化法導入楊氏梭菌的條件，并通過雙交換同源重組(Double-crossover Homologous Recombination)刪除了fliA基因(CLJU_c10410，推測為與菌毛形成相關(guān)的σ因子)。2016年，Molitor等[16]進一步優(yōu)化了楊氏梭菌電轉(zhuǎn)化的條件，探究了帶有不同復制子(pBP1、pCB102、pWV01ts、pIM13/pIMP1)的質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化法導入楊氏梭菌的效率差別，并構(gòu)建了可以在楊氏梭菌中使用的溫敏型質(zhì)粒。該研究還證明了商用的基于黃素單核苷酸的熒光蛋白(Flavin Mononucleotide-based Fluorescent Proteins, FbFPs)可以在楊氏梭菌中作為熒光報告系統(tǒng)。

近年來，CRISPR/Cas9、位點特異性重組等基因編輯工具也成功應用于產(chǎn)乙酸菌。在楊氏梭菌中分別利用啟動子Pthl和PAaraE啟動Cas9蛋白和sgRNA的表達，利用CRISPR/Cas9介導pta、adhE1、ctf(編碼脂酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶Acyl-CoA Transferase)和pyrE(編碼乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶Orotate Phosphoribosyltransferase)基因刪除的效率分別達到了100%、>75%、100% 和 >50%[17]。在自產(chǎn)乙醇梭菌中，Cas9蛋白的不受控表達嚴重降低了轉(zhuǎn)化效率。因此，Nagaraju 等[18]通過篩選和構(gòu)建四環(huán)素誘導型啟動子文庫，選用合適的誘導型啟動子調(diào)控Cas9蛋白的表達，實現(xiàn)了該菌利用CRISPR/Cas9介導基因刪除的效率>50%。Huang等[19]在楊氏梭菌中構(gòu)建了基于噬菌體絲氨酸重組酶的位點特異性重組系統(tǒng)，可以將來自丙酮丁醇梭菌的長達8.5 kb的產(chǎn)丁酸途徑一次性整合到楊氏梭菌染色體上，實現(xiàn)了大片段DNA的快速整合。在楊氏梭菌中利用四環(huán)素阻遏啟動子(Tetracycline Repressor Promoter)tetR-Ptet調(diào)控dCas9的表達，可以實現(xiàn)CRISPRi介導的pta及aor2基因表達強度的降低[20]。類似地，F(xiàn)ackler等[21]在自產(chǎn)乙醇梭菌中利用四環(huán)素誘導型啟動子(IPL-12)啟動dCas9的表達，成功將CRISPRi系統(tǒng)應用于自產(chǎn)乙醇梭菌，并利用該系統(tǒng)分別降低了2,3丁二醇及異丙醇合成途徑基因的表達強度，證明了該系統(tǒng)調(diào)控基因表達的效果。除常用的電轉(zhuǎn)化法外，研究人員還嘗試通過接合法將質(zhì)粒導入楊氏梭菌中，并通過誘導來自角蠅(Haematobiairritans)的轉(zhuǎn)移酶Himar1的表達，促進同源重組。研究人員優(yōu)化了接合條件，包括接合培養(yǎng)基、菌液用量、具有不同甲基化能力的質(zhì)粒供體菌、質(zhì)粒的復制蛋白等。作為概念證明，研究人員利用木糖誘導型啟動子表達Himar1轉(zhuǎn)移酶，將來自丙酮丁醇梭菌的丙酮合成途徑導入楊氏梭菌中[22]。

2.2 產(chǎn)乙酸菌的代謝工程改造

一些研究嘗試通過改造產(chǎn)乙酸菌Wood-Ljungdahl途徑及溶劑合成途徑的相關(guān)基因提高其合成醇類產(chǎn)物的能力。野生的楊氏梭菌只能生產(chǎn)乙醇，無法生產(chǎn)丁醇。在楊氏梭菌中表達來自丙酮丁醇梭菌中的丁醇合成途徑后，在合成氣發(fā)酵中丁醇濃度最高達到0.15 g/L，但發(fā)酵后期丁醇被轉(zhuǎn)化為丁酸，發(fā)酵末期時丁醇質(zhì)量濃度降低到了<0.015 g/L[11]。通過在自產(chǎn)乙醇梭菌中刪除3個編碼CODH的基因(acsA、cooS1、cooS2)，研究人員發(fā)現(xiàn)cooS1和cooS2對于自養(yǎng)生長不是必需的。當菌株在含有H2和CO2的環(huán)境下生長時，刪除cooS1的菌株甚至表現(xiàn)出比野生菌更短的延滯期和更高的生長速率[23]。同一個課題組[24]在自產(chǎn)乙醇梭菌中刪除了2個編碼AOR的基因，以及2個編碼AdhE2的基因,比較了改造菌株在CO、H2和CO2或果糖作為底物時細胞生長及產(chǎn)物形成的情況，證明了AOR對于自養(yǎng)條件下細胞生長的必要性，并發(fā)現(xiàn)敲除adhE可以將乙醇濃度提高180%，將副產(chǎn)物乙酸降低38%。另一項研究在食一氧化碳梭菌中過表達編碼AOR、AdhE2和鐵氧還蛋白:NAD+還原酶(Ferredoxin:NAD+Oxidoreductase, FNR)的基因。在合成氣發(fā)酵中，與野生型相比，過表達adhE2的菌株乙醇濃度提高約50%，而同時過表達adhE2和fnr的菌株丁醇與乙醇濃度分別提高約18%和22%，證明了通過過表達同源和異源基因在兩種不同途徑中增加醇產(chǎn)量的潛力[25]。除了直接改造產(chǎn)乙酸菌外，研究人員還嘗試了將Wood-Ljungdahl導入產(chǎn)溶劑梭菌中。在丙酮丁醇梭菌中表達來自于楊氏梭菌的和食一氧化碳梭菌的Wood-Ljungdahl途徑后，發(fā)現(xiàn)改造菌株可以進行Wood-Ljungdahl途徑甲基分支和羰基分支的全部反應；進一步在該菌株中表達CODH/ACS復合體后,發(fā)現(xiàn)改造菌表現(xiàn)出了CODH和ACS的活性。但由于ACS或Wood-Ljungdahl途徑中其他蛋白的表達量較低，改造菌無法在發(fā)酵中將CO2轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A[26-27]。

相比于利用糖基及纖維素類底物生產(chǎn)生物基醇類化學品，目前改造產(chǎn)乙酸菌、提高其利用合成氣生產(chǎn)生物基醇類化學品的研究仍需深入。開發(fā)更多高效的遺傳操作手段，解析其代謝關(guān)鍵酶(如AOR、AdhE2、CODH、FDH等)在自養(yǎng)條件下的表達強度及協(xié)同作用，深入探究產(chǎn)乙酸菌能量節(jié)約及電子傳遞的機制，對于構(gòu)建利用合成氣高效合成生物基醇類化學品具有重要的意義。

3 利用合成氣生產(chǎn)生物基醇的過程工程調(diào)控

3.1 溫度

大部分產(chǎn)乙酸菌的最適生長溫度均為37 ℃，然而，研究普遍發(fā)現(xiàn)，37 ℃并不是最適合產(chǎn)乙酸菌合成生物基醇類的溫度。在食一氧化碳梭菌的最適生長溫度37 ℃培養(yǎng)該菌時，菌株在對數(shù)期的快速生長會造成大量有機酸的快速積累，其中，乙酸的大量積累可能會引起醇類產(chǎn)物合成減少。類似的現(xiàn)象在產(chǎn)溶劑梭菌中也經(jīng)常出現(xiàn)，被稱為“酸崩潰”(Acid Crash)。而在25 ℃時培養(yǎng)食一氧化碳梭菌可以避免酸崩潰，可顯著提高醇類產(chǎn)物的濃度。在37 ℃時，菌株利用合成氣生產(chǎn)了0.07 g/L乙醇及微量丁醇、己醇，而在25 ℃時產(chǎn)生了1.48 g/L乙醇，1.07 g/L丁醇，以及0.84 g/L 己醇[28]。另一項研究發(fā)現(xiàn)低溫(25 ℃)促進食一氧化碳梭菌產(chǎn)物的碳鏈延長[29]。Shen等[30-31]在連續(xù)兩項研究中考察了溫度對食一氧化碳梭菌生物基醇產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基成分的優(yōu)化沒有顯著提高長鏈醇的合成，然而兩段溫度培養(yǎng)方法(37 ℃培養(yǎng)48 h后，25 ℃培養(yǎng)120 h)對于醇類產(chǎn)物，尤其是長鏈醇(己醇和丁醇)的合成有顯著提高，且減少了細胞絮凝。最終醇類產(chǎn)物濃度為6.97 g/L，其中丁醇濃度為1.67 g/L，己醇濃度為1.33 g/L，而在發(fā)酵溫度為37 ℃時，丁醇和己醇濃度分別為0.45 g/L和0.02 g/L。

多項研究均表明盡管較低的培養(yǎng)溫度(25～33 ℃)會降低細胞生長速率，但更有利于醇類產(chǎn)物的合成。醇類產(chǎn)物普遍對細胞具有毒害作用，通過增加細胞膜流動性，引起細胞成分的泄露，常見的醇類產(chǎn)物，對細胞的毒害作用從強到弱排序為己醇>丁醇>乙醇[32]。低溫下細胞膜流動性降低，細胞對醇類及有機酸的耐受性增強，且相比于短鏈醇(乙醇)，低溫發(fā)酵對于丁醇及己醇的合成更為有利。低溫對于長鏈醇合成的優(yōu)勢也與細胞的基因表達水平有關(guān)。37 ℃時，Wood-Ljungdahl途徑基因的表達較高，促進合成氣的利用和細胞生長；但25 ℃提高了?；s合反應(Acyl-condensation Reaction)相關(guān)基因的表達，更多的碳原子流向C4、C6產(chǎn)物[31]。

3.2 pH

與溫度對發(fā)酵的影響類似，最適合產(chǎn)乙酸菌生長的pH通常不是最適合產(chǎn)醇的pH。對于食一氧化碳梭菌，較高的培養(yǎng)pH(6.2)有利于細胞生長，但在此條件下細胞只合成有機酸，沒有醇類產(chǎn)物生成[33]。另一項研究[34]對比了5.75及4.75兩種發(fā)酵pH，發(fā)現(xiàn)最大的細胞生長速率可以在較高的pH(5.75)條件下獲得(0.072 vs. 0.005 7/h)，最大的醇類比生產(chǎn)速率可以在較低的pH(4.75)時獲得，然而，低pH條件下的醇類濃度卻低于高pH下的醇類產(chǎn)物濃度。該研究結(jié)果說明，低pH時單位細胞合成醇類產(chǎn)物的能力較強，但持續(xù)的低pH培養(yǎng)不利于積累細胞量，導致最終的醇類產(chǎn)物濃度及生產(chǎn)強度較低。

多項研究采取了多階段pH控制的方式，利用較高的pH促進細胞生長，利用較低的pH促進醇類產(chǎn)物的合成。例如，Richter等[35]采用兩階段pH控制法進行楊氏梭菌的合成氣發(fā)酵，首先在 1 L 的攪拌釜反應器中將pH控制在5.5左右，該條件有利于菌株生長及乙酸合成；然后在4 L的鼓泡式反應器中進行乙醇生產(chǎn)，該鼓泡式反應器控制較低的pH (4.5～4.7)，并帶有氣體循環(huán)裝置及細胞循環(huán)模塊，在保留細胞量的同時，提高氣液接觸面及氣體的停留時間，該研究最終獲得了20.7 g/L 乙醇，生產(chǎn)強度達到0.37 g/(L·h)。另一項研究將自產(chǎn)乙醇梭菌發(fā)酵在高pH(5.75)與低pH(4.75)之間循環(huán)變化[36]，獲得了7.14 g/L乙醇和1.621 g/L 2,3-丁二醇。類似地，將兩個攪拌釜反應器串聯(lián)，pH分別維持在6(促進細胞生長、產(chǎn)酸)及5(促進產(chǎn)溶劑)進行食一氧化碳梭菌的合成氣發(fā)酵，最終獲得了1.5 g/L醇類產(chǎn)物[37]。利用含有克魯維梭菌、ClostridiumragsdaleiP11等產(chǎn)乙酸菌的混合菌群進行合成氣發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)pH是碳鏈延長的關(guān)鍵因素，己醇只在培養(yǎng)pH 4.5～5之間才能被合成。在pH 4.8時，C6產(chǎn)物(0.8 g/L)及醇類產(chǎn)物(乙醇1.7 g/L、丁醇1.1 g/L、己醇0.6 g/L)達到最大[38]。

3.3 金屬離子

在利用合成氣生產(chǎn)生物基化學品的過程中，合成氣是唯一的碳源及能量來源，而固定合成氣的Wood-Ljungdahl途徑中的多種金屬酶的活性受到金屬離子(如Fe2+、WO2-、Ni2+等)的顯著影響，因此，金屬離子的成分及濃度對利用合成氣生產(chǎn)醇類生物基化學品有顯著影響。Saxena等[39]發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中去除鎳后，細胞無法生長。與ATCC (American Type Culture Collection) 1754標準培養(yǎng)基相比，優(yōu)化鎳濃度后的培養(yǎng)基使菌株的生長速率從0.34/d提高到0.49/d，CODH活性及氫化酶(Hydrogenase, H2ase)的特定活性從38.45和0.35 U/mg分別提高到48.5和1.66 U/mg蛋白。在培養(yǎng)基中去除WO4-則使乙醇濃度從35.7 mmol/L降低到1.14 mmol/L，使FDH的活性從45.4 U/mg降低到8.79 U/mg蛋白；相反，采用10倍于ATCC 1754標準培養(yǎng)基的WO4-濃度時，乙醇濃度提高到了72.29 mmol/L。在培養(yǎng)基中添加10倍濃度的Zn2+，可以使乙醇濃度顯著提高到187.80 mmol/L，然而CODH, FDH, H2ase和ADH的活性沒有受到明顯的影響。培養(yǎng)基中去除Fe2+顯著降低了CODH、FDH、H2ase和ADH的活性，并使乙醇濃度從35.7 mmol/L降低到6.3 mmol/L。另一項研究利用響應面設計法，系統(tǒng)探究了多種金屬離子對于食一氧化碳梭菌合成醇類產(chǎn)物的影響，并確定最優(yōu)的金屬離子濃度(相對于ATCC 1754標準培養(yǎng)基)：5倍的Ni2+、Co2+、SeO4-、WO4-；3.48倍的Cu2+；0.55倍的MoO4-；0.5倍的Zn2+與(NH4)2SO4·FeSO4·6H2O；以及額外添加44.32 μmol/L的FeCl3·6H2O。該研究發(fā)現(xiàn)，對于醇類產(chǎn)物的濃度，MoO4-表現(xiàn)出最明顯的負面影響，猜測原因是鉬可以在含鎢蛋白的活性位點中取代鎢并抑制蛋白獲取鎢，降低含鎢蛋白的活性。Wood-Ljungdahl途徑中的關(guān)鍵蛋白FDH，以及有機酸重吸收的關(guān)鍵蛋白AOR中具有含鎢的活性位點，造成了鉬元素對于醇類產(chǎn)物濃度的負面影響[30]。其他研究也發(fā)現(xiàn)鎳和鐵對于食一氧化碳梭菌在合成氣中的生長是必需的，而僅僅55 μg/L的鉬就足以對Wood-Ljungdahl途徑、丁醇合成及有機酸重吸收途徑產(chǎn)生抑制作用[40]。

3.4 有機氮源

有機氮源是影響利用合成氣生產(chǎn)生物基醇類化學品的重要因素。Park等[41]探究了幾種培養(yǎng)基成分(酵母提取物、微量元素溶液、微生物溶液，以及Na2S·9H2O)對自產(chǎn)乙醇梭菌細胞生長的影響，發(fā)現(xiàn)酵母提取物是影響最大的成分。將酵母提取物的質(zhì)量濃度從0.5 g/L提高到5 g/L，可以使細胞生長提高2.3倍。Abubackar等[42]通過二水平完全要因?qū)嶒?Two-level Full Factorial Design)發(fā)現(xiàn)，對于自產(chǎn)乙醇梭菌利用CO的發(fā)酵，將pH從5.75降低到4.75，并將酵母提取物質(zhì)量濃度從1.6 g/L降低到0.6 g/L，可以使乙醇產(chǎn)量提高200%。基于ATCC 2713培養(yǎng)基成分，優(yōu)化可得最適于食一氧化碳梭菌細胞生長的培養(yǎng)基成分，含有胰蛋白胨14 g/L ，酵母提取物9 g/L， L-精氨酸1.4 g/L，以及一種最適于該菌合成醇類產(chǎn)物的培養(yǎng)基，含有胰蛋白胨12 g/L，來自明膠的蛋白胨12 g/L，酵母提取物7 g/L，L-精氨酸1.4 g/L，葡萄糖1 g/L。在72 h的合成氣發(fā)酵中，采用最適合醇類產(chǎn)物合成的培養(yǎng)基，獲得了2.28 g/L乙醇及0.74 g/L丁醇[43]。使用來自生物質(zhì)的廉價有機氮源，可以在不顯著影響細胞生長的同時降低培養(yǎng)基的成本。采用0.5 g/L玉米浸出液(Corn Steep Liquor)，麥芽提取物(Malt Extract)及蔬菜提取物分別作為自產(chǎn)乙醇梭菌合成氣發(fā)酵的氮源，細胞的OD600值分別為1.44、1.37、1.71，乙醇質(zhì)量濃度分別為2.24、3.37、3.76 g/L[44]。采用玉米漿(Corn Syrup)或乳清粉(Whey Powder)代替微量元素及酵母提取物培養(yǎng)楊氏梭菌，發(fā)現(xiàn)使用30 g/L乳清粉時乙醇質(zhì)量濃度最大，達到2.5 g/L[45]。

3.5 硝酸鹽

3.6 其他培養(yǎng)基成分

由于產(chǎn)乙酸菌中的AOR蛋白可以在CO或H2的存在下將有機酸轉(zhuǎn)化為相應的醇，在反應體系中添加乙酸可以提高相應醇類產(chǎn)物的產(chǎn)量。在不同的乙酸濃度下，食一氧化碳梭菌中差異表達的基因主要包括顯著下調(diào)的pta和顯著上調(diào)的aor、COdh和adh。其中pta是乙酸合成途徑的關(guān)鍵基因，而aor、COdh與adh則在乙酸轉(zhuǎn)化為乙醇過程中起到重要的作用[48]。

Kim等[49]嘗試在發(fā)酵體系中加入不同的納米粒，發(fā)現(xiàn)0.3%(質(zhì)量分數(shù))的二氧化硅納米粒在促進氣液傳遞方面表現(xiàn)出最好的效果，使溶解的CO、CO2和H2濃度分別提高了272.9%、200.2%和156.1%，使細胞量提高了34.5%，丁醇濃度提高166.1%。

4 合成氣成分及氣液傳質(zhì)效率

由于合成氣是發(fā)酵中唯一的碳源，合成氣與液體的傳質(zhì)速率以及合成氣的組成對于發(fā)酵有著極其重要的影響。然而，不同研究中經(jīng)常使用不同組成及來源的合成氣，并在發(fā)酵中采用不同的氣體壓力，以及傳質(zhì)系數(shù)迥異的發(fā)酵設備，導致不同研究間的產(chǎn)物濃度難以進行橫向比較。從代謝途徑上來說，1 mol CO可以比1 mol H2提供更多的還原型鐵氧還蛋白，有助于還原性產(chǎn)物的合成；但是實際發(fā)酵中，由于不同微生物CODH及H2ase的活性不同，有些菌株在H2含量較高的合成氣中反而醇類產(chǎn)物產(chǎn)量更高。例如，Valgepea等[50]，將合成氣中H2/CO比例從0.4提高到3，自產(chǎn)乙醇梭菌發(fā)酵的乙醇通量從25%提高到61%，乙酸通量從27%降低到15%。Jack等[51]探究了H2/CO比例從0.5到2.0范圍內(nèi)楊氏梭菌發(fā)酵產(chǎn)物的變化，發(fā)現(xiàn)H2/CO比例為2.0時乙酸產(chǎn)量最高，為2.11 g/L；H2/CO比例為0.5時，乙醇產(chǎn)量最高，為0.35 g/L。另一項研究[52]發(fā)現(xiàn)，楊氏梭菌在pH為6.0、氣壓為0.1 MPa時進行發(fā)酵，在氣體組成為H2/CO2時，主要產(chǎn)物為乙酸；而當采用CO氣體時，可以合成乙醇，CODH和AOR在CO利用和乙醇合成中起到重要作用。總之，合成氣成分對于發(fā)酵產(chǎn)物有重要的影響，然而在不同的培養(yǎng)基、不同的氣壓等發(fā)酵條件下，難以斷言合成氣中各組分對于產(chǎn)物的影響。

在實際生產(chǎn)中，合成氣的成分通常是確定的，因此實際生產(chǎn)中更關(guān)鍵的問題是通過優(yōu)化發(fā)酵裝置，提高體積傳質(zhì)系數(shù)(Volumetric Mass Transfer Coefficient, kLa)及氣液傳質(zhì)效率。Xu等[53]提出可以使用氣體采樣袋作為自產(chǎn)乙醇梭菌合成氣發(fā)酵的培養(yǎng)裝置。氣體采樣袋可以在維持密閉的同時提高氣液接觸面積、提高傳質(zhì)效果，是一種廉價、操作簡便的氣體培養(yǎng)裝置。Shen等[54]設計了單片生物膜反應器(Monolithic Biofilm Reactor, MBR)，由于MBR通道中形成了彈狀流模式(Slug Flow Pattern)，MBR的體積傳質(zhì)系數(shù)kLa高于作為對照的鼓泡式反應器(Bubble Column Reactor, BCR)。在合成氣流速為300 mL/min，液體流速為500 mL/min，稀釋速率為 0.48/d的條件下，MBR中的食一氧化碳梭菌合成了4.89 g/L乙醇，比BCR反應器高52.8%。Shen等[55]進一步開發(fā)了中空纖維膜反應器(Hollow Fiber Membrane Reactor, HFM Reactor)，在此反應器中體積傳質(zhì)系數(shù)進一步提升至1 096.2/h，高于大部分已報道的反應器設計。在HFM反應器中進行食一氧化碳梭菌的合成氣發(fā)酵，乙醇質(zhì)量濃度可達23.93 g/L，是目前文獻報道的最高濃度。由此可見，提高反應器的傳質(zhì)系數(shù)、優(yōu)化反應器設計，對于提高醇類產(chǎn)物的濃度具有重要意義。

5 展 望

利用合成氣生產(chǎn)乙醇、丁醇、己醇等醇類生物基化學品，對于推動能源綠色低碳轉(zhuǎn)型、促進“碳中和”目標的實現(xiàn)具有重要意義。近年來，在產(chǎn)乙酸菌遺傳轉(zhuǎn)化工具的開發(fā)方面取得了大量進展，也有一些研究嘗試了對產(chǎn)乙酸菌進行代謝工程改造。然而，產(chǎn)乙酸菌中的基因編輯效率仍不夠高，大部分研究只進行了產(chǎn)乙酸菌中的單基因或雙基因敲除，所研究的菌株與基因較為零散，菌株生產(chǎn)能力不能滿足工業(yè)化要求。為了深入解析產(chǎn)乙酸菌中利用合成氣生產(chǎn)醇類產(chǎn)物的關(guān)鍵基因、構(gòu)建高效利用合成氣生產(chǎn)醇類生物基化學品的菌株，需要提高產(chǎn)乙酸菌的基因編輯效率，開發(fā)高通量基因編輯手段，利用多組學技術(shù)解析產(chǎn)乙酸菌CO2利用、能量節(jié)約、產(chǎn)物合成等相關(guān)途徑的調(diào)控機制。另外，可以嘗試在模式菌株(如丙酮丁醇梭菌、大腸埃希菌等)中構(gòu)建合成氣利用途徑，表達Wood-Ljungdahl途徑及能量節(jié)約相關(guān)基因(如Rnf復合物基因、電子歧化型轉(zhuǎn)氫酶基因等)，優(yōu)化各基因表達強度及輔因子平衡，使模式菌株具備利用合成氣的能力。

發(fā)酵條件及反應器的優(yōu)化對于提高醇類生物基化學品的濃度、生產(chǎn)強度與產(chǎn)物選擇性十分有效。某些調(diào)控手段(如加入大量有機氮源、采用較高的氣體壓力等)在工業(yè)應用中難以實現(xiàn)。未來的過程調(diào)控研究應集中于實現(xiàn)低成本、低能耗、較低氣壓下醇類產(chǎn)物的高效合成。一方面，優(yōu)化溫度、pH及反應器設計是相對而言簡單有效、廉價且低能耗的調(diào)控方案；此外，應嘗試利用廉價培養(yǎng)基成分代替高價成分，降低發(fā)酵成本，促進該過程的工業(yè)化。