鄧廷山, 宋麗莉, 孫 宇, 周茂超, 王 翠, 武國干*, 唐雪明*
(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海 201306;2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所,上海 201106;3.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室,上海 201106)
苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)自2000年首次由Lavermicocca等[1]報道具有抑菌作用后,其所具有的優(yōu)良抑菌性能,尤其是對致病菌與食物腐敗菌的抑菌作用逐漸被發(fā)現(xiàn)和開發(fā)。PLA除了具有廣譜抑菌特性,其安全性和穩(wěn)定性也相較于目前廣泛使用的化學(xué)防腐劑更加優(yōu)良[2-3]。許多微生物可自身代謝產(chǎn)生PLA,而由于多數(shù)乳酸菌為GRAS微生物,以其為出發(fā)菌代謝產(chǎn)PLA在食品行業(yè)中無疑具有更好的發(fā)展前景[4]。天然的乳酸菌產(chǎn)PLA的量較低,通常不超過100 mg/L,這成為限制其廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵因素[4]。國內(nèi)外對于PLA代謝機制的研究較少,主要集中于高產(chǎn)菌株的篩選及培養(yǎng)基的優(yōu)化[5-6],目前普遍認(rèn)為PLA的代謝合成主要有兩步:第一步通過芳香族氨基轉(zhuǎn)移酶(Aromatic amino acid transferase,ArAT)的催化將苯丙氨酸(Phe)轉(zhuǎn)化為苯丙酮酸(PPA), 第二步由PPA經(jīng)過乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)的催化轉(zhuǎn)化為PLA。該結(jié)論的得出來源于兩步反應(yīng)中的關(guān)鍵酶在體外進行的酶學(xué)研究,雖然ArAT與LDH在大腸埃希菌中進行的全細(xì)胞催化反應(yīng)獲得了極高的PLA的產(chǎn)量[7-8],但乳酸菌自身代謝產(chǎn)生PLA的量遠(yuǎn)不及此,其體內(nèi)的代謝機制亟待進一步研究。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)作為近年來的研究熱點,在醫(yī)學(xué)、檢測、基因功能及代謝等多個領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用,在不斷的研究和探索過程中逐漸開發(fā)和研究出多種Cas9蛋白的變體,以適用于不同類型的研究[9-10]。Song等[11]開發(fā)的質(zhì)粒pLCNICK含有Cas9D10A,能夠很好地運用于乳酸菌的基因編輯操作,并且該質(zhì)粒具有較高的敲除效率,相對于傳統(tǒng)同源重組的基因敲除方法具有快速高效的特點。本研究運用該基因編輯系統(tǒng),對一株干酪乳桿菌的arat基因進行體內(nèi)敲除,研究該基因的缺失對菌株產(chǎn)PLA及其代謝途徑的影響,為乳酸菌的PLA合成代謝提供理論依據(jù),為后續(xù)代謝途徑調(diào)控的研究提供新的思路及方法。
1.1.1 供試菌株及質(zhì)粒 干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei) 1.8727、大腸埃希菌DH10B菌株由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所保藏,乳酸菌基因編輯質(zhì)粒pLCNICK由上海理工大學(xué)惠贈。
1.1.2 培養(yǎng)基 ①MRS固體及液體培養(yǎng)基(OXOID)。②MMRS復(fù)蘇培養(yǎng)基(mmol/L):MRS加終濃度蔗糖 500,MgCl220,CaCl22。③LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨 10,酵母提取物 5, NaCl 10,固體培養(yǎng)基額外加入20 瓊脂粉。必要時加入抗生素,其中MRS中紅霉素終濃度為10 μg/mL,LB培養(yǎng)基中卡那霉素終濃度為50 μg/mL。
1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備ExTaq(TaKaRa),XbaⅠ、ApaⅠ快切酶(Thermo),色譜級苯乳酸、苯丙氨酸、甲醇(Aladdin),三氟乙酸(MACKLIN)。細(xì)菌基因組抽提試劑盒(天根生物科技有限公司),ClonExpress MultiS一步克隆試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司),質(zhì)粒小量抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司),引物合成及測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。電轉(zhuǎn)化儀(GenePulser Xcell,BIO-RAD);PCR儀(T100TM Thermal Cycler,BIO-RAD);凝膠成像系統(tǒng)(Gel DocTM EZ Imager,BIO-RAD);電泳儀(DYY-6C,北京市六一儀器廠);電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9272,太倉市華利達實驗設(shè)備有限公司);恒溫?fù)u床(ZWY-240,上海智城分析儀器制造有限公司);離心機(MicroCL17,BIO-RAD);超凈工作臺(SW-CJ-IFD,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);高效液相色譜儀(Agilent 1290 Infinity Ⅱ,美國安捷倫);色譜柱(XBridge C18,美國Waters);2 mm電轉(zhuǎn)化杯(BIO-RAD)。
1.2.1arat基因序列比對及引物設(shè)計 對NCBI數(shù)據(jù)庫中3株已上傳的干酪乳桿菌芳香族轉(zhuǎn)氨酶基因arat進行比對分析,發(fā)現(xiàn)Lactobacilluscasei12A、Lactobacilluscasei52W、LactobacilluscaseiBL23三株菌的序列同源性為99%,以此為基礎(chǔ)進行L.casei1.8727菌株arat基因的引物設(shè)計(表1)。
表1 引物列表
1.2.2arat-pLCNICK重組載體構(gòu)建 提取L.casei1.8727基因組,并以該基因組為模板,使用3KF/3KR引物擴增包含arat基因及上下游各1 kb大小的目的片段,將該片段命名為3K片段。隨后以該片段為模板,5′arat-FHa/3′arat-FHa;5′arat-RHa/3′arat-RHa引物分別擴增上游同源臂arat-FHa和下游同源臂arat-RHa。以pLCNICK為模板,以5′sgRNA/3′arat-sg引物擴增出靶向arat基因的sgRNA。以arat-RHa及sgRNA為模板,以AOlapF/2.1R為引物,利用Overlap PCR分別擴增出插入片段的下游部分,命名為RHa-sgRNA,純化后再以其與arat-FHa進行一次Overlap PCR,以2.1F/2.1R為引物,最后擴增出插入片段,命名為arat-sg,該片段兩段各含20 bp與pLCNINK質(zhì)粒同源片段,用于一步克隆(圖1A)。將pLCNICK轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽性克隆接種至含卡那霉素的5 mL LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng),按1%接種量接種至20 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12~16 h,抽提質(zhì)粒后用XbaⅠ和ApaⅠ進行雙酶切,膠回收載體片段。按照一步克隆試劑盒說明書配置反應(yīng)體系,將arat-sg片段與線性化pLCNICK載體進行連接轉(zhuǎn)化,涂布于含卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基進行篩選,抽提質(zhì)粒進行PCR驗證及測序驗證,構(gòu)建得到的基因敲除質(zhì)粒命名為arat-pLCNICK(圖1B)。
圖1 插入片段與基因編輯質(zhì)粒的示意圖 Fig.1 Schematic of insert fragment and gene editing plasmidA:插入片段arat-sg; B:arat-pLCNICK質(zhì)粒圖 A:Insert fragment arat-sg; B:plasmid map of arat-pLCNICK
1.2.3arat-pLCNICK電轉(zhuǎn)化L.casei1.8727 制備L.casei1.8727感受態(tài)細(xì)胞[11],將5 μgarat-pLCNICK質(zhì)粒與感受態(tài)細(xì)胞混合后轉(zhuǎn)移到冰上預(yù)冷的2 mm電轉(zhuǎn)化杯中,于冰上放置5 min。使用電轉(zhuǎn)化儀,在2 000 V,400 Ω,25 μF條件下進行電擊。立即加入1 mL MMRS,轉(zhuǎn)入2 mL離心管中,于37 ℃靜置2~3 h,然后涂布于紅霉素抗性的MRS固體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)2或3 d直至長出單菌落。
1.2.4L.casei1.8727Δarat敲除菌株的篩選鑒定 挑取單菌落接種于5 mL 含紅霉素的MRS液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜,提取基因組,用3KF/3KR引物進行PCR驗證,篩選出含有arat敲除菌的雜合菌,并在MRS固體培養(yǎng)基中連續(xù)劃線傳代兩次,挑取二次劃線的單菌落接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中,再次提取基因組,用aratF/aratR及3KF/3KR兩對引物進行PCR驗證,并對3KF/3KR引物擴增的PCR片段測序,篩選出arat敲除菌株,命名為L.casei1.8727Δarat。
1.2.5 HPLC測定PLA與Phe產(chǎn)量 由于Phe是arat的直接底物,因此對PLA產(chǎn)物進行HPLC測定時,Phe的測定也至關(guān)重要,有研究表明Phe的添加可以增加PLA的產(chǎn)量[12-13]。發(fā)酵準(zhǔn)備:制備12瓶20 mL MRS液體培養(yǎng)基,其中6瓶含終濃度2 g/L Phe。實驗菌株:L.casei1.8727及L.casei1.8727Δarat。將提前活化好的兩株菌種子液按1%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種,兩菌株均接種于MRS培養(yǎng)基與含終濃度2 g/L Phe的MRS培養(yǎng)基,每組三個平行重復(fù),于37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng),每瓶發(fā)酵液分別于24、48、72 h取樣1 mL,13 000 r/min離心10 min,0.22 μm濾膜過濾,上機測定。標(biāo)準(zhǔn)品制備:PLA與Phe標(biāo)品分別于1 L容量瓶中配置成終濃度200、400 mg/L溶液。PLA稀釋成5個梯度(mg/L):200、100、50、25、12.5;Phe稀釋成5個梯度(mg/L):400、200、100、50、25。各標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)0.22 μm濾膜過濾備用,混合標(biāo)準(zhǔn)品制備:將上述兩種標(biāo)準(zhǔn)品按1∶1(體積比)混合。色譜條件:參考黃國昌等[14]的方法進行測定。色譜柱為XBridge C18,檢測波長220 nm,進樣量10 μL,流速1 mL/min,柱溫30 ℃,流動相A液:0.05%三氟乙酸甲醇溶液,流動相B液:0.05%三氟乙酸水溶液,洗脫條件:0~20 min由A∶B從10%線性變化為100%,20~25 min保持100% A相,25~30 min A∶B從100%線性變化為10%。在進行各組發(fā)酵樣品前,先對Phe與PLA的單個標(biāo)準(zhǔn)品進行上機測定,確定Phe與PLA的洗脫時間,隨后將混合標(biāo)準(zhǔn)品與各組發(fā)酵液樣品進行上機測定,同時將MRS培養(yǎng)基在相同色譜條件下測得的Phe與PLA含量作為空白對照。最后根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并對各組發(fā)酵數(shù)據(jù)進行分析。
arat-pLCNICK質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落連續(xù)劃線兩次,再提取基因組后用3KF/3KR引物進行PCR鑒定,如圖2A所示,敲除菌株擴增出2 kb大小的條帶,與arat基因缺失后的大小相符。同時使用arat基因特異性引物對aratF/aratR進行PCR驗證,如圖2B所示,敲除菌株未擴增出目的條帶。將圖2A中敲除菌株的擴增片段割膠回收后進行測序驗證,如圖2C所示,測序所用引物為3KF/3KR,在片段兩段進行單向測序,測序結(jié)果用DNAMAN軟件與該3 kb片段進行比對,測序片段兩端與原序列一致,顯示arat基因已被敲除。
PLA在11~12 min之間出現(xiàn)洗脫峰且峰形較好(圖3A),而PLA在7~8 min之間出峰(圖3B),進行混合標(biāo)樣上機洗脫如圖3C,洗脫峰分離效果及峰形較好,說明該洗脫方法對于同時分析PLA與Phe具有較好的效果。剩余混合標(biāo)樣按相同色譜條件進樣分析,建立標(biāo)準(zhǔn)品回歸曲線,如表2所示,表明回歸曲線具有較高可信度與精確度。
各組發(fā)酵樣品按相同色譜條件進樣分析,所得結(jié)果如圖4A、4B所示。MRS培養(yǎng)基作為空白對照經(jīng)相同條件測定后發(fā)現(xiàn)其中含有約150 mg/L的Phe,而PLA的含量極低可以忽略,因此各組分Phe濃度數(shù)據(jù)減掉150 mg/L后進一步分析。圖4A中在未添加Phe時,arat基因敲除后其PLA產(chǎn)量在各時期均有顯著提高,而添加Phe后,PLA產(chǎn)量具有極顯著提高,且在72 h時PLA產(chǎn)量提高了近66.7%。圖4B中L.casei1.8727Δarat菌株的Phe產(chǎn)量相比于出發(fā)菌株具有顯著性提高,且在72 h時其Phe產(chǎn)量提高近66.7%。數(shù)據(jù)表明L.casei1.8727菌株具有自身合成代謝Phe的能力,且Phe與PLA的產(chǎn)量隨發(fā)酵時間的延長而逐漸積累,表明arat基因的敲除促進了PLA與Phe的合成。
圖2 arat基因敲除菌驗證結(jié)果 Fig.2 Verification of arat gene knockoutA:同源臂引物驗證; B:arat特異引物驗證;C:測序驗證A:Verification of primers for homologous arms; B:Verification of specific primers for arat; C:Sequencing validation
圖3 單個標(biāo)準(zhǔn)品和混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰圖 Fig.3 Chromatographic peak of single and mixed standardA:PLA的色譜峰圖;B:Phe的色譜峰圖;C:Phe與PLA的混合色譜峰圖A:Chromatogram peaks of PLA; B:Chromatogram peaks of Phe; C:Chromatogram peaks of Phe and PLA
表2 Phe與PLA線性關(guān)系
圖4 各發(fā)酵樣品Phe和PLA濃度數(shù)據(jù)分析柱狀圖Fig.4 The histogram of Phe and PLA concentration data analysis of each fermentation sampleA:PLA發(fā)酵數(shù)據(jù)柱狀圖, 1~3:兩株菌分別在MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵24、48、72 h; 4~6: 兩株菌分別在含2 g/L苯丙氨酸的MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵24、48、72 h。 B:Phe發(fā)酵數(shù)據(jù)柱狀圖, 1~3:兩株菌分別在MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵24、48、72 h。圖A、B中a和b表示相同實驗的兩組數(shù)據(jù)有顯著差異A:Histogram of PLA fermentation data, 1-3: The histograms of the two strains fermented in MRS medium for 24, 48 and 72 h; 4-6: The histograms of the two strains fermented in MRS medium containing 2 g/L Phe for 24, 48 and 72 h. B:Histogram of Phe fermentation data, 1-3: The histograms of the two strains fermented in MRS medium for 24, 48 and 72 h. In figure A and B,a and b indicate that there is a significant difference between two groups of data in the same experiment
ArAT作為氨基轉(zhuǎn)移酶中的一種,能夠催化芳香族氨基酸與α-酮戊二酸之間的轉(zhuǎn)氨反應(yīng),反應(yīng)同時需要輔酶磷酸吡哆醛(pyridoxal-5-phosphate,PLP)的參與,該反應(yīng)過程是可逆的[15]。ArAT是PLA代謝途徑中的關(guān)鍵酶,因此研究ArAT對PLA合成代謝的影響具有重要意義。本研究通過實現(xiàn)對arat基因的敲除操作后發(fā)現(xiàn)arat缺失使PLA的產(chǎn)量提高了約66.7%,同時Phe的產(chǎn)量也比出發(fā)菌株提高約57.8%,該結(jié)果表明L.casei1.8727菌株能夠自身代謝合成Phe。據(jù)相關(guān)研究可以推斷Phe在ArAT的催化下生成苯丙酮酸PPA[16-17],在本研究中因為arat基因的缺失,可能導(dǎo)致Phe不能及時轉(zhuǎn)化為PPA,從而導(dǎo)致Phe的積累。而PLA產(chǎn)量的提高,說明可能存在其他的氨基轉(zhuǎn)移酶,或者PPA作為PLA的中間代謝底物時,其在細(xì)胞中的含量受其他路徑的影響,使得在敲除arat基因后,并不能抑制PLA與Phe的合成代謝,而本研究中arat基因的缺失促進了PLA與Phe的合成,證明該反應(yīng)步驟可能受到多個代謝途徑的調(diào)控,在arat基因缺失后,很可能多個相關(guān)代謝路徑的代償最終使得PLA產(chǎn)量的提高。
有研究表明PLA的第一步轉(zhuǎn)氨反應(yīng)受多種因素的影響,如底物適用性,酶的活性,氨基受體α-酮戊二酸的可用性等[18-19]。通過酶學(xué)性質(zhì)分析進一步確定該ArAT的底物適用性;不同種屬的乳酸菌代謝合成PLA的能力具有很大差異[20-21],通過對多種不同種屬來源的ArAT進行研究以判斷酶活對轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的影響;研究表明增加α-酮戊二酸濃度能顯著提高PLA產(chǎn)量[21],α-酮戊二酸不僅作為該反應(yīng)中的氨基受體,同時涉及多個生物反應(yīng)過程,通過代謝工程調(diào)整其代謝流,使得α-酮戊二酸的體內(nèi)含量提高,促進轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的進行。
對于可能存在的其他合成PPA與Phe的代謝途徑,在KEGG數(shù)據(jù)庫中以干酪乳桿菌為種屬來源的芳香族氨基酸代謝通路中發(fā)現(xiàn)酶E2.6.1.9參與Phe代謝,該酶名為組氨醇-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Histidinol phosphate aminotranserase,HPA),該酶同樣能以Phe為底物產(chǎn)PPA,在NCBI數(shù)據(jù)庫中對多株干酪乳桿菌進行比對發(fā)現(xiàn)均存在HPA基因,該轉(zhuǎn)氨酶很有可能共同參與干酪乳桿菌的PLA合成代謝。在近期的研究中,Sun等[22]通過基因組與轉(zhuǎn)錄組水平研究植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)LY-78合成PLA的代謝調(diào)控機制,并揭示了菌株中PLA生物合成的候選通路、操縱子和關(guān)鍵基因。據(jù)以上結(jié)論做出PLA可能的體內(nèi)合成代謝途徑,如圖5所示。后續(xù)除了進一步研究ArAT的酶學(xué)性質(zhì)之外,還需要研究組氨醇-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶對PLA合成代謝的影響,同時結(jié)合代謝工程與轉(zhuǎn)錄組測序分析,進一步揭示PLA的合成代謝調(diào)控??傊狙芯堪l(fā)現(xiàn)對PLA合成代謝的研究具有重要意義,首次發(fā)現(xiàn)在干酪乳桿菌中arat基因的缺失能夠促進PLA與Phe的合成代謝,同時本研究中所運用的基因編輯系統(tǒng)及方法能夠很好地運用于干酪乳桿菌的基因敲除操作,為后續(xù)PLA代謝合成機制的進一步研究提供參考。
圖5 干酪乳桿菌中PLA可能的代謝通路示意圖Fig.5 Schematic diagram of possible PLA metabolic pathway in Lactobacillus casei圖中虛線箭頭表示有多個反應(yīng)過程The dotted arrows in the diagram indicate that there are multiple reactions