謝超慧 郝相慧 楊玲玲 徐海峰

1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部，青島 266071；2山東省第一醫(yī)科大學(xué)附屬眼科研究所 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬青島眼科醫(yī)院 山東省眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，青島 266071

目前,眼底新生血管性疾病的一線治療方法是玻璃體腔內(nèi)注射抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)藥物。然而，隨著抗VEGF制劑臨床應(yīng)用的日益廣泛及隨訪時(shí)間的延長，發(fā)現(xiàn)抗VEGF治療后無論是脈絡(luò)膜還是視網(wǎng)膜新生血管均可發(fā)生嚴(yán)重纖維化，尤其是視網(wǎng)膜新生血管纖維化，短期內(nèi)即可造成牽拉性視網(wǎng)膜脫離，脈絡(luò)膜新生血管纖維化也嚴(yán)重影響視功能的恢復(fù)。因此，在抗VEGF治療的同時(shí)如何減輕新生血管纖維化引起了廣泛關(guān)注。本課題組前期研究證實(shí)，貝伐單抗對纖維化發(fā)生過程有調(diào)控作用，抗VEGF處理后纖維化及炎性因子的表達(dá)水平發(fā)生變化。有研究表明，抗VEGF處理后，RPE細(xì)胞中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平也明顯升高，抗氧化功能降低，ROS水平升高與細(xì)胞纖維化發(fā)生直接相關(guān)。ROS在視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)中起到促進(jìn)作用。機(jī)體細(xì)胞中產(chǎn)生ROS的一個(gè)主要來源是還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NOX)表達(dá)于血管內(nèi)皮和血管平滑肌等多種細(xì)胞內(nèi)，是血管系統(tǒng)ROS的主要來源。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)NOX4的過度表達(dá)使ROS水平升高，而抑制NOX4活性僅降低了ROS產(chǎn)生的基礎(chǔ)水平，這表明NOX4并非刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS的主要酶。已有研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可引起細(xì)胞中NOX高表達(dá)，也可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞纖維化。抑制NOX表達(dá)可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增生。這些發(fā)現(xiàn)提示NOX4的表達(dá)在細(xì)胞纖維化中發(fā)揮重要作用。EMT的特征之一在于誘導(dǎo)上皮基因的丟失以及多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)。閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)是細(xì)胞緊密連接重要組成蛋白之一，其穿梭于質(zhì)膜和細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)之間，參與信號傳導(dǎo)途徑。EMT發(fā)生期間，ZO-1分子受到破壞，其參與細(xì)胞骨架構(gòu)成和維持細(xì)胞極性的特性減弱，細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)變化。纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)作為一種高分子量糖蛋白，主要以3種形式存在，其中1種是由成纖維細(xì)胞和早期間充質(zhì)細(xì)胞分泌合成，并在EMT過程中生成量增加。波形蛋白(Vimentin)是中間絲的其中1種蛋白質(zhì)，其與微管及肌動(dòng)蛋白微細(xì)絲組成細(xì)胞骨架，可錨定和支撐間充質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器，可作為EMT的標(biāo)志物。與此機(jī)制相似的因子還有α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)。NOX在促進(jìn)視網(wǎng)膜血管纖維化中有潛在作用，已有研究證實(shí)NOX可調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，然而至今尚無NOX調(diào)控RPE細(xì)胞發(fā)生EMT的直接證據(jù)。本研究擬探討NOX4抑制劑對抗VEGF治療導(dǎo)致的人RPE細(xì)胞發(fā)生EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

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細(xì)胞來源 ARPE-19細(xì)胞系購于上海賽百慷生物科技有限公司。

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主要試劑及儀器 DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素(美國Gibco公司)；貝伐單抗(瑞士Genentech公司)；NOX4抑制劑VAS2870和GKT137831(美國MCE公司)；驢血清蛋白、高效RIPA細(xì)胞快速裂解液、苯甲基磺酰氟(北京索萊寶科技有限公司)；PCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；Trizol、4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、兔抗人ZO-1一抗(40-2300)(美國Invitrogen公司)；兔抗人Vimentin一抗(10366-1-AP)、488標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(SA00013-2)(美國Proteintech公司)；兔抗人α-SMA一抗(ab32575)、兔抗人FN一抗(ab2413)、兔抗人NOX4一抗(ab133303)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗(ab8245)、生物素標(biāo)記羊抗兔二抗(ab150077)(英國Abcam公司)；化學(xué)發(fā)光液(美國Millpore公司)。T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶及6孔板(美國Corning公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)；熒光定量PCR儀、Western blot電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

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1

細(xì)胞培養(yǎng)及分組 采用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/ml(商品單位)青霉素和鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基、在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞，3～4 d傳代。將傳代后的RPE細(xì)胞按1×10個(gè)/ml接種于6孔板中，達(dá)到60%～70%融合時(shí)更換為含有2%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基，并將細(xì)胞分為空白對照組、貝伐單抗組、貝伐單抗+VAS2870組和貝伐單抗+GKT137831組，其中空白對照組不做任何處理，貝伐單抗組、貝伐單抗+VAS2870組和貝伐單抗+GKT137831組培養(yǎng)基中分別加入0.25 g/L貝伐單抗、0.25 g/L貝伐單抗+3 μmol/L VAS2870、0.25 g/L貝伐單抗+20 μmol/L GKT137831繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

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2

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各組細(xì)胞中FN、Vimentin、α-SMA、ZO-1及NOX4 mRNA的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用Trizol提取細(xì)胞中的總RNA，按照試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物由青島德羅海達(dá)生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。FN正向引物序列：5'-GGGACCGTCAGGGAGAAAA-3'，反向引物序列：5'-CGAGATATTCCTTCTGCCACTGTT-3'；Vimentin正向引物序列：5'-GCAGGAGGCAGAAGAATGGTA-3'，反向引物序列：5'-GGGACTCATGGTTCCTTTAAGG-3'；α-SMA正向引物序列：5'-GGTGACGAAGCACAGAGCAA-3'，反向引物序列：5'-CAGGGTGGGATGCTCTTCAG-3'；ZO-1正向引物序列：5'-AGGATCCATATCCCGAGGAAA-3'，反向引物序列：5'-CGAGGTCTCTGCTGGCTTGT-3'；NOX4正向引物序列：5'-CAACTGTTCCTGGCCTGACA-3'，反向引物序列：5'-GCAACGTCAGCAGCATGTAGA-3'；GAPDH正向引物序列：5'-CATGTTCGTCATGG GTGTGAA-3'，反向引物序列：5'-GGCATGGACTGT GGTCATGAG-3'。采用ABI7500 Real-Time PCR系統(tǒng)，按照Real Master Mix(SYBR green)試劑盒說明書加入試劑進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，以GAPDH為內(nèi)參，采用2法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

1

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2

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3

Western blot法檢測各組細(xì)胞中FN、Vimentin、α-SMA、ZO-1及NOX4蛋白的表達(dá) 將各組細(xì)胞用裂解緩沖液在冰上裂解30 min后收集超聲10 s，離心半徑10 cm，4 ℃、12 000 r/min離心10 min后收集上清，采用BCA蛋白測定試劑盒定量蛋白濃度。將提取的總蛋白30 μg在上樣緩沖液中煮沸10 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜(FN和NOX稀釋比例均為1∶ 1 000，Vimentin、α-SMA和ZO-1稀釋比例均為1∶ 2 000)；洗膜，滴加相應(yīng)二抗(1∶ 2 000)在室溫下孵育1 h，再次洗膜并使用Gel-Del凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)使蛋白信號可視化。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，采用ImageJ軟件分析條帶灰度。

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2

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4

細(xì)胞免疫熒光染色檢測FN、Vimentin、α-SMA和ZO-1蛋白表達(dá)的分布 將ARPE-19細(xì)胞接種到6孔板中，按照實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞后，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌3次，室溫下用40 g/L多聚甲醛固定20 min。PBS洗滌3次，檢測α-SMA和Vimentin時(shí)用體積分?jǐn)?shù)0.2% Triton X-100透化細(xì)胞1 min，檢測NOX4時(shí)用0.5% Triton X-100透化細(xì)胞30 min，檢測ZO-1和FN時(shí)不透化，再次PBS洗滌3次后，將細(xì)胞用體積分?jǐn)?shù)10%驢血清蛋白在37 ℃封閉30 min，1∶ 200稀釋一抗，并在4 ℃條件下孵育過夜，PBS洗滌后在室溫下將細(xì)胞用FITC標(biāo)記的驢抗兔IgG(1∶ 200)避光孵育1 h，PBS洗滌細(xì)胞并用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，使用激光掃描共聚焦顯微鏡捕獲圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究中計(jì)量資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)證實(shí)呈正態(tài)分布，以表示，空白對照組、貝伐單抗組、貝伐單抗+VAS2870組、貝伐單抗+GKT137831組間總體比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-

q

檢驗(yàn)。

P

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中FN、Vimentin、α-SMA、ZO-1及NOX4 mRNA相對表達(dá)量比較

空白對照組、貝伐單抗組、貝伐單抗+VAS2870組和貝伐單抗+GKT137831組細(xì)胞中FN、Vimentin、α-SMA、ZO-1和NOX4 mRNA相對表達(dá)量組間總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=97.07、195.40、722.40、38.56、70.81，均

P

<0.001)，其中貝伐單抗組FN、Vimentin、α-SMA和NOX4 mRNA相對表達(dá)量明顯高于空白對照組，ZO-1 mRNA相對表達(dá)量明顯低于空白對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)。貝伐單抗+VAS2870組和貝伐單抗+GKT137831組細(xì)胞中FN、Vimentin、α-SMA和NOX4 mRNA相對表達(dá)量明顯低于貝伐單抗組，ZO-1 mRNA相對表達(dá)量明顯高于貝伐單抗組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)(表1)。

表1 各組細(xì)胞中FN、Vimentin、α-SMA、ZO-1及NOX4 mRNA相對表達(dá)量比較 (x±s)Table 1 Comparison of mRNA expression of FN,vimentin,α-SMA,ZO-1 and NOX4 in cells among various groups (x±s)組別樣本量不同基因mRNA相對表達(dá)量FNVimentinα-SMAZO-1NOX4空白對照組30.670±0.0460.768±0.0110.751±0.0291.277±0.0140.446±0.011貝伐單抗組31.002±0.086a1.000±0.030a1.000±0.022a1.003±0.091a1.007±0.089a貝伐單抗+VAS2870組30.605±0.025b0.630±0.021b0.345±0.018b1.662±0.007b0.297±0.057b貝伐單抗+GKT137831組30.272±0.008b0.559±0.019b0.241±0.010b1.674±0.129b0.259±0.008bF值97.07195.40722.4038.5670.81P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 注:與空白對照組比較,aP<0.05;與貝伐單抗組比較,bP<0.05(單因素方差分析,SNK-q檢驗(yàn)) FN:纖維連接蛋白;Vimentin:波形蛋白;α-SMA:α-平滑肌肌動(dòng)蛋白;ZO-1:閉鎖小帶蛋白-1;NOX:還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶 Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with bevacizumab group,bP<0.05 (One-way ANOVA,SNK-q test) FN:fi-bronectin;α-SMA:α-smooth muscle actin;ZO-1:zonula occludens-1;NOX:nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase

2.2 不同分組細(xì)胞中FN、Vimentin、α-SMA、ZO-1和NOX4蛋白相對表達(dá)量比較

Western blot檢測結(jié)果顯示，空白對照組FN、Vimentin、α-SMA及NOX4條帶灰度弱于貝伐單抗組，ZO-1條帶灰度強(qiáng)于貝伐單抗組；貝伐單抗+VAS2870組和貝伐單抗+GKT137831組的FN、Vimentin、α-SMA和NOX4條帶灰度弱于貝伐單抗組，ZO-1條帶灰度強(qiáng)于貝伐單抗組(圖1)?？瞻讓φ战M、貝伐單抗組、貝伐單抗+VAS2870組和貝伐單抗+GKT137831組中FN、Vimentin、α-SMA、ZO-1和NOX4的蛋白相對表達(dá)量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=23.09、64.58、58.19、26.97、63.19，均

P

<0.001)，其中貝伐單抗組FN、Vimentin、α-SMA和NOX4蛋白相對表達(dá)量明顯高于空白對照組，ZO-1蛋白相對表達(dá)量明顯低于空白對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)。貝伐單抗+VAS2870組和貝伐單抗+GKT137831組FN、Vimentin、α-SMA和NOX4蛋白相對表達(dá)量明顯低于貝伐單抗組，ZO-1蛋白相對表達(dá)量明顯高于貝伐單抗組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)(表2)。

圖1 各組細(xì)胞EMT標(biāo)志物蛋白及NOX4蛋白表達(dá)電泳圖 1：空白對照組；2：貝伐單抗組；3：貝伐單抗+VAS2870組；4：貝伐單抗+GKT137831組 FN：纖維連接蛋白；Vimentin：波形蛋白；α-SMA：α-平滑肌動(dòng)蛋白；ZO-1：閉鎖小帶蛋白-1；NOX：還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶Figure 1 Electrophoretogram of EMT markers and NOX4 expression among various groups 1：blank control group；2：bevacizumab group；3：bevacizumab+VAS2870 group；4：bevacizumab+GKT137831 group FN：fibronectin；α-SMA：α-smooth muscle actin；ZO-1：zonula occludens-1；NOX：nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase；GAPDH：glyceralde-3-phosphate dehydrogenase

表2 各組細(xì)胞中FN、Vimentin、α-SMA、ZO-1及NOX4蛋白相對表達(dá)量比較(x±s)Table 2 Comparison of FN,vimentin,α-SMA,ZO-1 and NOX4 expression in cells among various groups (x±s)組別樣本量不同蛋白相對表達(dá)量FNVimentinα-SMAZO-1NOX4空白對照組30.622±0.0650.466±0.0850.570±0.0321.695±0.2090.519±0.042貝伐單抗組31.002±0.016a1.003±0.021a1.000±0.022a1.002±0.041a1.007±0.089a貝伐單抗+VAS2870組30.423±0.157b0.566±0.041b0.529±0.058b1.932±0.112b0.448±0.099b貝伐單抗+GKT137831組30.305±0.155b0.655±0.039b0.452±0.077b2.032±0.074b0.275±0.076bF值23.0964.5858.1926.9763.19P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 注:與空白對照組比較,aP<0.05;與貝伐單抗組比較,bP<0.05(單因素方差分析,SNK-q檢驗(yàn)) FN:纖維連接蛋白;Vimentin:波形蛋白;α-SMA:α-平滑肌肌動(dòng)蛋白;ZO-1:閉鎖小帶蛋白-1;NOX:還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶 Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with bevacizumab group,bP<0.05 (One-way ANOVA,SNK-q test) FN:fi-bronectin;α-SMA:α-smooth muscle actin;ZO-1:zonula occludens-1;NOX:nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase

2.3 各組細(xì)胞EMT標(biāo)志物蛋白表達(dá)情況比較

免疫熒光染色結(jié)果顯示，F(xiàn)N主要表達(dá)于細(xì)胞外基質(zhì)，呈綠色熒光。貝伐單抗組FN熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于空白對照組，貝伐單抗+VAS2870組和貝伐單抗+GKT137831組FN熒光強(qiáng)度均明顯減弱。Vimentin和α-SMA主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，均呈綠色熒光。貝伐單抗組Vimentin和α-SMA熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于空白對照組，貝伐單抗+VAS2870組和貝伐單抗+GKT137831組較貝伐單抗組熒光強(qiáng)度明顯減弱。ZO-1主要表達(dá)于細(xì)胞膜，呈綠色熒光。貝伐單抗組ZO-1熒光強(qiáng)度明顯弱于空白對照組，貝伐單抗+VAS2870組和貝伐單抗+GKT137831組熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于貝伐單抗組(圖2)。

圖2 各組細(xì)胞中EMT標(biāo)志物蛋白的免疫熒光染色表現(xiàn)(DAPI ×200，標(biāo)尺=20 μm) FN主要表達(dá)于細(xì)胞外基質(zhì)，Vimentin、α-SMA主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，ZO-1主要表達(dá)于細(xì)胞膜，均呈綠色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。貝伐單抗組FN、Vimentin、α-SMA熒光強(qiáng)度強(qiáng)于空白對照組；ZO-1熒光強(qiáng)度弱于空白對照組；貝伐單抗+VAS2870組和貝伐單抗+GKT137831組FN、Vimentin、α-SMA熒光強(qiáng)度弱于貝伐單抗組，ZO-1熒光強(qiáng)度強(qiáng)于貝伐單抗組 FN：纖維連接蛋白；Vimentin：波形蛋白；α-SMA：α-平滑肌肌動(dòng)蛋白；ZO-1：閉鎖小帶蛋白-1Figure 2 Immunofluorescence staining of EMT markers among various groups (DAPI ×200,bar=20 μm) FN mainly expressed in extracellular matrix，vimentin and α-SMA in cytoplasm,and ZO-1 in cell membrane,all of which showed green fluorescence,and the nuclei presented blue fluorescence (DAPI).The immunofluorescence intensity of FN,vimentin and α-SMA were stronger and the immunofluorescence intensity of ZO-1 was weaker in bevacizumab group than those in blank control group.The immunofluorescence intensity of FN,vimentin and α-SMA were weaker and the immunofluorescence intensity of ZO-1 was stronger in bevacizumab+VAS2870 and bevacizumab+GKT137831 groups than bevacizumab group FN：fibronectin；α-SMA：α-smooth muscle actin；ZO-1：zonula occludens-1

2.4 空白對照組和貝伐單抗組細(xì)胞NOX4免疫熒光染色情況比較

免疫熒光染色結(jié)果顯示，NOX4主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈綠色熒光。與空白對照組相比，貝伐單抗組中NOX4熒光強(qiáng)度明顯較強(qiáng)(圖3)。

圖3 貝伐單抗組和空白對照組細(xì)胞中NOX4的免疫熒光染色表現(xiàn)(DAPI ×200，標(biāo)尺=20 μm) NOX4主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈綠色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光(DAPI)?？梢娯惙慰菇MNOX4表達(dá)強(qiáng)于空白對照組 A：空白對照組 B：貝伐單抗組Figure 3 Immunofluorescence staining of NOX4 in bevacizumab group and blank control group(DAPI ×200,bar=20 μm) NOX4 was mainly expressed in cytoplasm,showing green fluorescence.Nuclei presented blue fluorescence (DAPI).The immunofluorescence intensity of NOX4 was higher in bevacizumab group than blank control group A：blank control group B：bevacizumab group

3 討論

抗VEGF治療使眾多眼部新生血管性疾病患者視力得以提高，但新生血管的纖維化影響了患者的視力獲益，RPE細(xì)胞對于維持正常視覺功能至關(guān)重要，其EMT與視網(wǎng)膜纖維化發(fā)病機(jī)制有關(guān)。RPE細(xì)胞經(jīng)EMT過程形成成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，并產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)成分，參與視網(wǎng)膜纖維化組織的形成。因此在抗VEGF治療同時(shí)抑制纖維化的發(fā)生具有重要意義。

許多疾病的發(fā)生與氧化應(yīng)激有關(guān)。ROS是氧正常代謝的天然副產(chǎn)物，其包括超氧化物和HO，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和維持體內(nèi)平衡中具有重要作用，但在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，ROS產(chǎn)生增多則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷并危害機(jī)體健康。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，貝伐單抗處理細(xì)胞后可使ROS和纖維化相關(guān)因子水平升高，因此ROS在RPE細(xì)胞的EMT過程中起到促進(jìn)作用。

NOX是調(diào)控ROS產(chǎn)生的重要上游信號，NADPH氧化還原酶的NOX家族在ROS參與轉(zhuǎn)化生長因子β介導(dǎo)的EMT發(fā)生過程中具有重要作用。NOX家族由NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、雙重氧化酶1(Duox1)和Duox2共7個(gè)亞型組成。其中，NOX4是表達(dá)豐富、分布廣泛的NOX亞型之一。與其他NOX成員不同，即使在沒有胞質(zhì)調(diào)節(jié)劑的情況下，NOX4也具有結(jié)構(gòu)活性，這使得NOX4在控制內(nèi)皮細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有重要作用。在此之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)NOX4通過ROS機(jī)制調(diào)節(jié)信號通路促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管的生成，但NOX抑制劑對EMT的影響未見直接證據(jù)。了解NOX抑制劑能否抑制及逆轉(zhuǎn)抗VEGF抑制劑誘導(dǎo)的EMT對于新生血管的防治具有重要意義。

本研究觀察了貝伐單抗對ARPE19細(xì)胞中NOX4表達(dá)水平的影響，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中加入貝伐單抗后，在EMT標(biāo)志物發(fā)生變化的同時(shí)，細(xì)胞中NOX4 mRNA和蛋白表達(dá)水平均增高，而加入NOX4抑制劑GKT137831或VAS2870后，NOX4呈低表達(dá)狀態(tài)，EMT標(biāo)志物中FN、Vimentin和α-SMA表達(dá)水平降低，ZO-1表達(dá)水平升高，表明由貝伐單抗引起的EMT發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，NOX4的表達(dá)與EMT密切相關(guān)，下調(diào)NOX4對貝伐單抗引起的ARPE19細(xì)胞的EMT有抑制作用，驗(yàn)證了NOX4可能參與EMT的調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)NOX4在大鼠晶狀體上皮細(xì)胞、人胸膜間皮細(xì)胞和人腎小管上皮細(xì)胞EMT過程中發(fā)揮一定作用，而NOX4抑制劑可以減輕纖維化程度，與本研究結(jié)果一致。本研究使用了2種不同的NOX4抑制劑，體外實(shí)驗(yàn)觀察了NOX4的表達(dá)，均使貝伐單抗誘發(fā)的EMT發(fā)生逆轉(zhuǎn)。由此可以推測多種NOX4抑制劑具有成為臨床有效纖維化抑制劑的可能。

綜上所述，NOX4在視網(wǎng)膜纖維化形成中可能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，NOX4抑制劑可能減少抗VEGF治療所誘發(fā)的新生血管過度纖維化的發(fā)生，這可能為年齡相關(guān)性黃斑變性等脈絡(luò)膜新生血管疾病的治療提供新的思路。但本實(shí)驗(yàn)僅觀察了2種NOX4抑制劑處理RPE細(xì)胞的生物學(xué)行為，并未在動(dòng)物模型中證實(shí)，因此需要在下一步的研究中進(jìn)行相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步檢測參與調(diào)控發(fā)生纖維化過程的誘導(dǎo)因子VEGF及各類炎性因子變化，并探討不同NOX抑制劑在不同濃度時(shí)在體內(nèi)相關(guān)通路中不同程度的影響。

利益沖突

所有作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

徐海峰：參與選題和研究設(shè)計(jì)、研究過程指導(dǎo)、數(shù)據(jù)和資料分析、文章主要內(nèi)容修改和定稿；謝超慧：參與研究設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)實(shí)施、收集和分析數(shù)據(jù)、論文撰寫及修改和定稿；郝相慧：參與研究實(shí)施、收集和分析數(shù)據(jù)；楊玲玲：實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，對文章知識性內(nèi)容的審閱和智力性內(nèi)容的修改