金耀建,黃信用,高素華,葉 均,樓宏強,張艷芳,孫義凱
(1.金華職業(yè)技術學院,浙江金華 321007;2.金華市強盛生物科技有限公司,浙江金華 321000)
抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(ACPA)是在類風濕關節(jié)炎(RA)患者血清中發(fā)現的一種自身抗體,對RA 診斷具有高度特異性,檢測ACPA 已成為診斷RA 的主要指標,并且除類風濕因子(RF)外,ACPA 也納入了新版RA分類標準[1]。ACPA 在70%~80%的RA病人體內都能被檢測到且特異性高達98%左右[2-3],且ACPA可以在RA患者出現臨床表現前5年~10年出現,能預測更嚴重的臨床癥狀[4-7]。
目前,ACPA 的檢測方法有酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、化學發(fā)光免疫分析法(CIA)、電化學發(fā)光免疫分析法(ECLIA)、膠體金免疫層析法(GICA)和時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)等,依據檢測原理的差異各檢測方法具有不同的優(yōu)缺點。膠乳增強免疫比濁法檢測ACPA是一種新型的、特異性強、靈敏度高、成本低、試劑通用型的檢測方法,能早期診斷RA。為此,該檢測試劑盒的制備具有十分重要的意義。
羧基微球(上海輝質生物科技有限公司)、牛血清白蛋白(BSA,鹽城賽寶生物科技有限公司)、環(huán)瓜氨酸肽和抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(均為廣東菲鵬生物有限公司)。
該試劑盒由試劑一、試劑二、標準品和質控品四部分組成。
1.2.1 試劑一配方
磷酸氫二鈉22.4 g、磷酸二氫鉀5.4 g、PEG6000 20 g、氯化鈉20 g、JX515 0.2 mL、純化水1000 mL,加純水至1068 g,密度為ρ=1.068,pH值為7.50±0.10。
1.2.2 試劑二配方
純化水130 mL、硼酸緩沖液40 mL(硼酸1 g、純化水40 mL,pH 值為10.00±0.10,密度為ρ=1.025)、羧基微球10 g、EDC 溶液5 mL(EDC 0.05 g、純化水5 mL,密度為ρ=1.010)、環(huán)瓜氨酸肽2 g、BSA 溶液15 mL(BSA 1.5 g、純化水15 mL,密度為ρ=1.100),試劑二稀釋液1000 mL(磷酸氫二鈉22.4 g、磷酸二氫鉀5.4 g、JX515 0.2 mL,加水到1028 g,密度為ρ=1.028,pH值為7.50±0.10)。
1.2.3 反應體系中主要成分篩選
選擇粒徑分別為70nm、108nm及240nm的羧基微球與抗原,分別按5∶1、4∶1、3∶1、2∶1比例混合,目的是選擇抗原與羧基微球交聯的合適比例。羧基微球與抗原交聯時間分別為30 min、45 min、60 min;BSA 封閉時間分別為30 min、60 min、120 min。將 約為100 U/mL 的ACPA 樣本進行1/2 及1/4 梯 度稀釋。
基本操作:樣本5μL,加試劑一150 μL,混勻,37 ℃孵育300 秒,在波長700 nm 處讀取吸光度A1,然后加試劑二50 μl,37 ℃孵育300 秒,在波長546 nm處讀取吸光度A2,并與標準曲線比較,即能得出樣本中ACPA的含量。
1.2.4 與同行試劑比對
用上述確認體系與工藝配制試劑,同時選擇北京九強生物技術股份有限公司(北京九強)ACPA試劑及血清樣本40 例(ACPA 含量為1 U/mL-100 U/mL)進行含量檢測比對,初步確定試劑盒準確性。
1.2.5 抗環(huán)瓜氨酸肽抗體水溶液檢測
校準品及質控品主要原料為ACPA,將ACPA按理論值配制成100 U/mL的水溶液,將該水溶液稀釋成1/2及1/4,再用上述確認的試劑進行檢測。
1.2.6 校準品溯源
依據GB/T 21415-2008/ISO 17511:2003“體外診斷醫(yī)療器械,生物樣品中量的測量,校準品和控制物質賦值的計量學溯源性”要求對工作校準品和產品校準品溯源。
1.2.6 .1工作校準品溯源
選用研制的ACPA 試劑,批號為20 180903;待定值工作校準品,批號為20 181014;北京九強ACPA試劑及配套校準品、質控品,批號為20180807,校準品標示值為100.0 U/mL±11.2 U/mL,質控品靶值為30.0 U/mL±6.0 U/mL 或60.0 U/mL±12.0 U/mL;新鮮血清樣本40份,在貝克曼AU480自動生化分析儀上進行檢測。
建立北京九強參照系統(tǒng)。用北京九強配套校準品校準北京九強試劑,檢測北京九強配套高低值質控品,建立參照系統(tǒng)(要求質控值在范圍內且CV≤5.0%)。
工作校準品初定值。隨機抽取10 瓶工作校準品,用以上系統(tǒng)檢測,每瓶檢測3 次,計算均勻性及均值。若均勻性符合0<F≤F0.05(vbb,vwb)的要求,則其均值作為初定值。
工作校準品終定值。在指定檢測儀器上開通兩個通道,一個通道為北京九強參照系統(tǒng),另一個通道為初定值工作校準品,用以校準本研制試劑的定值系統(tǒng),兩個系統(tǒng)同時對40份新鮮臨床樣本進行檢測(覆蓋本研制試劑線性范圍),以參照系統(tǒng)檢測結果為x,以定值系統(tǒng)檢測結果為y,進行線性回歸y=a+bx分析,若滿足以下三個條件,即斜率b在1.00±0.05 范圍內,截距a在0±10 范圍內;相關系數r≥0.975,則認為初定值可靠并作為該工作校準品最終定值。
工作校準品不確定度。工作校準品不確定度包括北京九強校準品引入,定值精密度引入,均勻性引入。北京九強校準品引入的相對不確定度(Uwcal)為5.60%,直接引用。定值精密度引入的相對不確定度(Urep)用北京九強檢測系統(tǒng)測試工作校準品10次,計算公式為:
其中x為每次測定值,n為測定次數。均勻性引入的相對不確定度(Ubb)通過隨機抽取10瓶工作校準品,用以上系統(tǒng)檢測,每瓶工作校準品檢測3 次,計算其均值xˉ、瓶間均方(MSbb)及瓶內均方(MSwb),從而得到Ubb:
通過上述計算,進而得到總相對不確定度(Uc)及工作校準品擴展不確定度(U):
其中k=2(95%);X為工作校準品定值。
1.2.6 .2 產品校準品溯源
本研究ACPA 試劑,批號為20 181019;工作校準品,批號為20170611,定值為100.0 U/mL±11.8 U/mL;待定值產品校準品,批號為20 181019;在貝克曼AU480自動生化分析儀上進行檢測。
產品校準品定值和不確定度。用工作校準品校準本試劑建立檢測系統(tǒng)。隨機抽取規(guī)格為5.0 U/mL及100.0 U/mL的產品校準品各10瓶,每瓶檢測3次,計算其均勻性及均值。若均勻性符合為0<F≤F0.05(vbb,vwb)的要求,則其均值作為定值。不確定度計算方法同工作校準品。
1.2.7 質控品定值
本研制ACPA 試劑(產品校準品批號為20180806,待定值產品質控品批號為20180806,報告定值質控品1 為19.99 U/mL,質控品2 為50.02 U/mL),用產品校準品在貝克曼庫爾特、日立、西門子、羅氏、邁瑞、東芝、雅培、迪瑞等品牌的21 種機型上定標,測試兩水平質控品各10 次,分別計算均值作為該機型上質控品定值。最后將所有機型定值匯總,取統(tǒng)計學平均值作為質控品報告定值,要求質控品準確度指標與標示值偏差≤20%。
1.2.8 確定參考區(qū)間
收集寧波市開發(fā)區(qū)中心醫(yī)院檢驗科新鮮體檢血清標本240 例,其中男120 例,女120 例。排除標準:(1)肝、膽、胰、肺及心腦血管等相關指標異常標本;(2)溶血及脂濁標本;(3)放置時間超過24 小時標本。所有標本收集后,在2 ℃~8 ℃下冷藏運輸。用本研制的試劑、標準品和質控品(批號:20181019)進行檢測,用SPSS 22.0進行數據分析,采用Dixon 法判斷離群值,采用Z 檢驗判斷參考區(qū)間是否需分組,用Kolmogorov-Smirnov 法進行數據正態(tài)性檢驗,P>0.05 表示數據呈正態(tài)分布。若數據呈正態(tài)分布,采用95%可信區(qū)間計算結果X±1.96SD。
1.2.9 產品校準品和質控品穩(wěn)定性
試劑穩(wěn)定性主要為效期穩(wěn)定性及開瓶穩(wěn)定性。校準品批號為20171129,質控品批號為20171129。
1.2.9 .1 效期穩(wěn)定性
校準品和質控品按照規(guī)定條件下2 ℃~8 ℃貯存,各取出2瓶放入對照溫度為-80 ℃的環(huán)境中,直到12 個月穩(wěn)定期滿后使用同步法進行穩(wěn)定性研究。使用該項目常規(guī)試劑盒,在全自動生化分析儀上重復條件下每瓶檢測3 次,記錄結果并用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計分析。
1.2.9 .2 首次開封后穩(wěn)定性
校準品和質控品首次開封后按照規(guī)定條件下2 ℃~8 ℃貯存,分別在貯存0、4、8、12、16 天取出同一瓶測量,每瓶3 次,記錄結果并用SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計分析。
1.2.10 干擾物研究
選擇混合血清一份(樣本批號分別為:20170905、20171017、20171129),分成五份,四份加入干擾物作為干擾標本,另一份不加干擾物作為基礎標本,各干擾組標本組合見表1。每份標本重復測五遍,記錄試驗結果,計算分析干擾物濃度,每月測1次連續(xù)測3個月,其中各組干擾值=各組干擾物標本測定均值-基礎標本測定均值。干擾值落在基礎樣本值±1.96SD 范圍內(95%可信區(qū)間內)為無顯著干擾。
表1 各干擾組標本組合
1.2.11 臨床評價
收集來自于株洲市中心醫(yī)院的臨床血清標本100例,要求排除嚴重渾濁、脂血、溶血、高膽紅素樣本。參照試劑為浙江夸克生物科技有限公司,批號為190628。目的是驗證考核試劑與已上市的對照系統(tǒng)等效性。對樣本的檢測結果進行離群值分析、回歸分析、偏倚分析等指標的計算,從而評價考核試劑在臨床上的安全性和有效性。
1.2.11.1 離均值分析
以浙江夸克生物科技有限公司生產的試劑和方法作為參照標準,用其與本文研制的試劑和方法,同時測定同一份血清標本,進行結果的離均值分析,以此來檢驗本研制的試劑和方法與參照標準的等效性。若兩種方法測試的絕對差值/相對差值均超出所有樣本均值的4倍,則被判斷為離群值,離群值不超過總數的2.5%。
1.2.11 .2 回歸分析
以考核試劑作Y軸,對照試劑作X軸,建立直線回歸方程y=a+bx,計算相關系數或決定系數并計算斜率及截距的95%可信區(qū)間,相關系數要求r≥0.975。將考核試劑測定值與對照試劑測定值按照統(tǒng)計學方法分別進行相關性和一致性分析,以考查考核試劑與對照試劑是否等效。
1.2.11 .3 偏倚分析
計算醫(yī)學決定水平的預期偏倚及95%可信區(qū)間,與可接受偏倚的限值15%進行比較,如果預期偏倚的95%可信區(qū)間未超出可接受偏倚的限值,說明二者等效。偏倚分析用方程式B=Σ(Yi-Xi)/N分別計算每組的平均偏倚B及考核試劑與對照試劑測定值差值的標準差(其中B是適當濃度范圍內估計的預期(平均)偏倚,X為對照試劑測定值,Y為考核試劑測定值)。計算醫(yī)學決定水平(Xc)預期偏倚估計值(B^c)及其95%區(qū)間
羧基微球粒徑108 nm,微球與抗原比例3∶1,微球與抗原交聯時間60分鐘,BSA 封閉時間60分鐘,這時方法學靈敏度最佳。結果見表2。
表2 反應體系中各成分篩選結果
結果顯示相關系數r=0.9835(y=0.9533x+2.5397,R2=0.9672)。因此,可以認為本試劑與北京九強試劑有很好的相關性,同時本試劑可以溯源至北京九強ACPA試劑。
如表3 所示,表明各濃度點實測結果與理論值偏差較小。因此,可以用抗環(huán)瓜氨酸肽抗體配制成合適濃度校準品及質控品以滿足實際使用。
表3 抗環(huán)瓜氨酸肽抗體水溶液檢測結果
2.4.1 工作校準品溯源結果
以北京九強作為參照系統(tǒng),溯源結果如下:北京九強低值質控品(30 U/mL)和高值質控品(60 U/mL)的均值分別是30.01 U/mL 和60.43 U/mL,偏差分別是0.04%和0.72%,CV分別是1.44%和1.10%,本工作校準品均值是100.3 U/mL,偏差0.00%,CV為1.73%,Urep=0.379%,Ubb=1.818%,Uc=5.902%,擴展不確定度=11.8。本工作校準品初定值為100.0 U/mL。參照系統(tǒng)和定值系統(tǒng)檢測臨床標本,線性回歸統(tǒng)計分析結果為y= 1.010x-0.420(r=0.981),初定值符合要求。因此,本工作校準品最終定值100.0 U/mL,該批工作校準品定值為100±11.8 U/mL。
2.4.2 產品校準品溯源結果
該批產品校準品(5.0 U/mL)定值為5.0 U/mL±0.7 U/mL,產品校準品(100.0 U/mL)定值為100.0 U/mL±12.7 U/mL。結果見表4。
表4 產品校準品溯源結果
2.4.3 質控品定值
經過對8 個品牌的21 種機型質控品檢測結果進行統(tǒng)計學分析,根據質控品準確度指標,該質控品定值分別為20.0 U/mL±4.0 U/mL,50.0 U/mL±10.0 U/mL。
2.4.4 參考區(qū)間
對240 名臨床血清標本數據分析(見表5)結果表明:(1)Z<Z*,則無需進行男女分組;(2)合并男女分組后進行正態(tài)性檢驗,結果顯示符合正態(tài)分布;(3)合并男女分組后計算參考上限及下限,則參考下限及上限分別為5.0 U/mL及34.3 U/mL。因此,參考區(qū)間確定為0 U/mL~35 U/mL。
表5 血清檢測結果統(tǒng)計學分析
2.4.5 產品校準品和質控品穩(wěn)定性
產品校準品及質控品在2 ℃~8 ℃貯存0個月、3 個月、6 個月、9 個月、12 個月,效期穩(wěn)定性檢測結果變化趨勢不顯著(P≥0.05)。
產品校準品及質控品首次開封后穩(wěn)定性檢測,0 天、4 天、8 天、12 天、16 天檢測結果的變化趨勢不顯著(P≥0.05)。
2.4.6 干擾物研究
膽紅素干擾試驗、甘油三酯干擾試驗、血紅蛋白干擾試驗結果經統(tǒng)計學分析,當膽紅素≤200 mg/L、甘油三酯≤3 g/L、血紅蛋白≤2.5 g/L 時,對三批試劑結果均無顯著影響。
2.4.7 臨床評價
用對照試劑和考核試劑檢測臨床血清標本100例,離群點數量為0 例;兩者回歸分析結果y=0.9607x-0.3451(P<0.05),系數b 95%可信區(qū)間CI=0.9180~1.0034(P<0.05),截距a 95%可信區(qū)間CI=-2.4020~1.7118(P≥0.05),說明兩種試劑直線關系成立。
對考核試劑和對照試劑檢測結果進行一致性分析,兩者檢測結果的Bland-Altam 分析基本數據見表6,絕對偏倚和相對偏倚都在允許范圍內。
表6 Bland-Altam分析基本數據
偏倚分析結果,當Xc=35 U/mL 時,B^c95%區(qū)間為[-2.639,-0.8022],而允許限度為[-5.25,5.25],考核試劑相對于對照試劑檢測結果,偏倚量在允許誤差范圍內。
膠乳增強免疫比濁法是近年來快速發(fā)展的一種穩(wěn)定、結果準確、能自動化、微量化、快速化檢測體液蛋白均相免疫比濁的方法[8-10],該方法是在羧基微球表面交聯環(huán)瓜氨酸肽抗原成為致敏顆粒,增加了靈敏度。檢測患者血清中ACPA 時,當抗原致敏的微球和病人血清中的ACPA 結合并聚集在一起,改變了反應體系中液體的透光性,透光性(即吸光度)的變化與反應體系中的抗體含量呈線性相關,通過標準曲線即可得出患者血清中的抗體含量。
通過對本研制的試劑盒反應體系中主要成分篩選,確定了最佳方法學,并將試劑盒與北京九強ACPA 試劑盒比較,結果為y=0.9533x+2.5397,R2=0.9672,說明兩者具有很好的相關性。
溯源性是試劑盒能否用于臨床診斷的重要環(huán)節(jié),本文以北京九強作為參照系統(tǒng),將參照系統(tǒng)與本工作校準品定值系統(tǒng)檢測臨床標本結果進行統(tǒng)計分析,無論均值偏差還是變異度都符合要求,線性回歸y=1.010x-0.420(r=0.981)。
該方法靈敏、穩(wěn)定,適用于臨床常用機型,最低檢測下限為5.0 U/mL,線性范圍較寬,參考范圍95%可信區(qū)間為<35 U/mL。產品校準品和質控品穩(wěn)定性好,在2 ℃~8 ℃貯存12 個月和開封16 天后檢測結果變化不顯著。干擾物膽紅素≤200 mg/L、甘油三酯≤3 g/L、血紅蛋白≤2.5 g/L 時,對三批試劑結果均無顯著影響。在臨床評價中,對照試劑和考核試劑檢測100例臨床標本,線性回歸y=0.9607x-0.3451(r=0.9763),偏倚分析在允許誤差范圍內,說明考核試劑完全達到臨床檢測要求。本研制的試劑盒已取得中華人民共和國醫(yī)療器械注冊證(體外診斷試劑),注冊證編號:浙械注準20202400782。