錢楊，饒瑜，蔣云露，沈秋霞，艾麗，吳李川，袁洋

1(四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院 輕工工程學(xué)院，四川 成都，611830)2(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都，610039)3(成都市食品檢驗(yàn)研究院，四川 成都，611130)

四川泡菜是中國(guó)泡菜的典型代表，被譽(yù)為“川菜之骨”，堪稱“國(guó)粹”[1]，其歷史可追溯到商朝?？捎米魉拇ㄅ莶嗽系氖卟硕喾N多樣，在我國(guó)西南地區(qū)，蘿卜、豇豆、辣椒是常用的制作四川泡菜的蔬菜原料[2]。不同種類的新鮮蔬菜在6%～8%的鹽水泡漬下，經(jīng)蔬菜表面或外接乳酸菌發(fā)酵5～7 d后，即可得到四川泡菜[3]。以乳酸菌為優(yōu)勢(shì)菌主導(dǎo)發(fā)酵而成的四川泡菜不僅質(zhì)地鮮嫩、味道酸咸，而且含有豐富的益生菌，經(jīng)常食用可改善腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)[4]。

微生物作為四川泡菜發(fā)酵的關(guān)鍵因子，近年來(lái)備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。傳統(tǒng)研究四川泡菜中微生物多樣性的方法主要是利用可培養(yǎng)法，但實(shí)際上四川泡菜中還有大量的不可培養(yǎng)微生物，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)方法的不斷發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)被廣泛用于多種生態(tài)系統(tǒng)的微生物多樣性研究中[5]，該法具有高準(zhǔn)性、高通量、高靈敏度和低運(yùn)行成本等特點(diǎn)，非常適合于四川泡菜中微生物多樣性的研究[6]。目前，研究者對(duì)四川泡菜中的微生物研究多關(guān)注于不同的溫度、鹽濃度、季節(jié)等條件下微生物菌群結(jié)構(gòu)的不同[7-8]，實(shí)際上，泡菜中的微生物多樣性與蔬菜原料種類有很大關(guān)系[9]。有研究表明Lactobacillus、Leuconostoc、Achromobacter和Pediococcus主導(dǎo)了白菜泡菜的發(fā)酵[10]，Lactobacillus、Serratia、Enterobacter和Pediococcus是四川蘿卜泡菜中的主要微生物[11]，Lactobacillus、Pseudomonas、Vibrio和Halomonas是青菜泡菜中的主要微生物[6]。

鑒于此，本研究選取蘿卜、豇豆、辣椒以及3種蔬菜按比例混合為四川泡菜原料，利用高通量測(cè)序技術(shù)分析比較不同蔬菜原料四川泡菜中微生物多樣性差異，通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)一步挖掘，深入分析不同蔬菜種類四川泡菜中微生物和理化因子的相關(guān)性。這對(duì)指導(dǎo)四川泡菜工業(yè)化生產(chǎn)，豐富四川泡菜產(chǎn)品種類具有重要意義，同時(shí)也為四川泡菜產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化升級(jí)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紅皮蘿卜、辣椒(二荊條)、豇豆，均購(gòu)于超市；泡菜老鹵，取自于四川本地常年制作四川泡菜家庭(鹵水已循環(huán)使用8年)；亞硝酸鈉、亞鐵氰化鉀、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺，科龍化工試劑廠；乳酸、乙酸，色譜純，美侖生物科技有限公司；瓊脂糖，美國(guó)Sigma公司；PowerSoil DNA提取試劑盒，美國(guó)Mobio公司；膠回收試劑盒，美國(guó)OMEGA公司；TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit、Hiaeq Rapid SBS Kit v2，Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH S-3C型酸度計(jì)，成都世紀(jì)方舟科技有限公司；SpectraMax?i3x酶標(biāo)儀，美谷分子儀器(上海)有限公司；冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；超低溫冰箱，Heo Ultra Freeze；凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；電泳儀，北京六一儀器廠；PCR儀，美國(guó)Eppendorf公司；Waters2695 HPLC系統(tǒng)，沃特世科技(上海)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 四川泡菜的制作及樣品采集

將新鮮紅皮蘿卜、豇豆和辣椒用自來(lái)水沖洗干凈，自然晾干。蘿卜泡菜，豇豆泡菜和辣椒泡菜需分別稱取1 kg洗凈晾干的蘿卜、豇豆和辣椒加入到3 L玻璃壇中，混合泡菜則需取3種蔬菜各1 kg混合加入到10 L玻璃壇中。將煮沸的開(kāi)水冷卻后配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的鹽溶液，并按1∶500的比例向鹽溶液中接種泡菜老鹵制成新鹽鹵。將新鹽鹵加入泡菜壇中至沒(méi)過(guò)蔬菜，加蓋，并在壇沿加水密封，每種四川泡菜制作3壇，于室溫(25～30 ℃)發(fā)酵6 d。發(fā)酵完成后分別取泡菜壇上、中、下3層鹽鹵各10 mL，混合均勻后于4 ℃冷凍離心機(jī)4 000 r/min離心10 min，將沉淀重懸于10 mL無(wú)菌生理鹽水中用于高通量測(cè)序分析，上清液用于理化特性測(cè)定。

1.3.2 不同蔬菜種類四川泡菜的理化特性測(cè)定

每2 d對(duì)四川泡菜的pH和亞硝酸鹽含量進(jìn)行測(cè)定，其中，pH的測(cè)定使用pH S-320酸度計(jì)進(jìn)行，亞硝酸鹽含量參照GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中的第二法分光光度法進(jìn)行測(cè)定。

對(duì)發(fā)酵完成后的四川泡菜進(jìn)行有機(jī)酸測(cè)定，測(cè)定方法如下，樣品處理：取2 mL樣品8 000 r/min離心2 min，取上清液1 mL于0.22 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣體積為10 μL。檢測(cè)條件：使用美國(guó)Bio-Rad125-0140酸柱(300 mm×7.8 mm)，以0.005 6 mol/L的稀硫酸為流動(dòng)相(流速0.5 mL/min)，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，沖洗時(shí)間60 min[12]。

1.3.3 總DNA的提取和擴(kuò)增

使用PowerSoil DNA提取試劑盒對(duì)不同蔬菜種類泡菜鹽鹵樣品中的總DNA進(jìn)行提取，通過(guò)擴(kuò)增引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)細(xì)菌16S rRNA V4～V5區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用2%瓊脂凝膠在5 V/cm的條件下電泳檢測(cè)20 min，切膠回收PCR產(chǎn)物，使用TE緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA片段，Qubit 2.0對(duì)PCR回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量，并按照每個(gè)樣本的測(cè)序質(zhì)量要求，進(jìn)行相應(yīng)比列的混合。

1.3.4 高通量測(cè)序及生物信息分析

高通量測(cè)序以及微生物多樣性分析在成都羅寧生物科技有限公司進(jìn)行。本次測(cè)序采用的是PE250測(cè)序方式，測(cè)序試劑盒采用Hiseq Rapid SBS Kit v2。雙端測(cè)序得到的PE reads首先使用FLASH進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控，在去除低質(zhì)量堿基及接頭污染序列等操作過(guò)程后完成數(shù)據(jù)過(guò)濾，得到可供后續(xù)分析的高質(zhì)量目標(biāo)序列。后續(xù)生物信息學(xué)操作使用QIIME、Usearch、Mothur等完成，統(tǒng)計(jì)和作圖主要使用R、python和java等軟件完成。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理及分析

通過(guò)Origin 2018、IBM SPSS Statistics 20、GraphPad Prism等軟件對(duì)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。利用Omicshare所提供的典型相關(guān)分析(canonical correlation analysis，CCA)計(jì)算工具，分析理化因子和樣品中微生物菌群的關(guān)系；利用Omicshare所提供的組間相關(guān)性分析計(jì)算不同蔬菜種類四川泡菜中微生物與理化因子的相關(guān)系數(shù)(ρ)，該分析工具主要利用R包進(jìn)行分析，本研究采用spearman系數(shù)法專門用于計(jì)算等級(jí)數(shù)據(jù)的相關(guān)性。通過(guò)計(jì)算得到的相關(guān)系數(shù)為正即表示正相關(guān)，為負(fù)即表示負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值越大，表明相關(guān)性越強(qiáng)。通常認(rèn)為0.0<|ρ|<0.2為極弱相關(guān)或無(wú)相關(guān)，0.2<|ρ|<0.4為弱相關(guān)，0.4<|ρ|<0.6為中等程度相關(guān)，0.6<|ρ|<0.8為強(qiáng)相關(guān)，0.8<|ρ|<1.0為極強(qiáng)相關(guān)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蔬菜種類四川泡菜的理化特性分析

pH和亞硝酸鹽含量是四川泡菜成熟的2個(gè)主要指標(biāo)[13]，通常情況下，當(dāng)四川泡菜的pH降至4.5以下時(shí)表明泡菜已經(jīng)基本成熟。由圖1-a和圖1-b可以看出，發(fā)酵6 d后，不同蔬菜種類四川泡菜的pH均降至4.5以下，亞硝酸鹽含量也降至安全低水平范圍內(nèi)(小于20 mg/kg)，此時(shí)豇豆泡菜的亞硝酸鹽含量為(1.14±1.08) mg/kg，是4種泡菜中亞硝酸鹽含量最低的，并且與辣椒泡菜和蘿卜泡菜具有顯著性差異(P<0.05)。有研究表明，四川泡菜的pH降低主要是由于乳酸菌代謝產(chǎn)生乳酸和醋酸引起的[14]，不同蔬菜種類四川泡菜發(fā)酵第6天的有機(jī)酸測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1-c和圖1-d，可以發(fā)現(xiàn)，辣椒泡菜具有最低的乳酸和醋酸濃度，其中，乳酸濃度與蘿卜泡菜和混合泡菜具有顯著性差異(P<0.05)，醋酸濃度與混合泡菜具有顯著性差異(P<0.05)，且辣椒泡菜具有最高的pH。豇豆泡菜和蘿卜泡菜均有最低的pH和較高的有機(jī)酸總濃度，而混合蔬菜由于受辣椒原料的影響，雖具有最高的有機(jī)酸總濃度，但其pH和辣椒泡菜無(wú)顯著性差異(P>0.05)。由此可知，蔬菜種類不同四川泡菜所表現(xiàn)出的理化特性也有所差異。

2.2 不同蔬菜種類四川泡菜中細(xì)菌群落高通量測(cè)序質(zhì)量分析

本實(shí)驗(yàn)要求每個(gè)樣本測(cè)序深度>10 000條序列，12個(gè)樣本共獲得816 897條序列，平均長(zhǎng)度為310 bp，能夠覆蓋16S rRNA V4～V5區(qū)域長(zhǎng)度。序列經(jīng)過(guò)過(guò)濾和質(zhì)量控制后，每個(gè)泡菜樣本可用序列深度均在10 000條以上。去掉低質(zhì)量序列后，在97%的相似性水平上使用UPARSE算法進(jìn)行OTU的聚類，泡菜鹽鹵樣品中的細(xì)菌總共劃分為445個(gè)OTUs，從表1中可以發(fā)現(xiàn)，每個(gè)泡菜鹽鹵樣本中OTUs的劃分情況各不相同，基于此可以對(duì)泡菜鹽鹵發(fā)酵過(guò)程中物種多樣性進(jìn)行分析。

稀釋曲線是從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的個(gè)體樣本，統(tǒng)計(jì)這些個(gè)體所代表的物種數(shù)目，并以個(gè)體數(shù)(橫坐標(biāo))和物種數(shù)(縱坐標(biāo))來(lái)構(gòu)建曲線。通過(guò)繪制稀釋曲線可間接反映樣本中物種的豐富程度。當(dāng)曲線趨于平緩時(shí)可認(rèn)為測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品

中所有的物種，測(cè)序已趨于飽和，能代表樣本中絕大多數(shù)的微生物信息[15]。由圖2-a可知，隨著測(cè)序深度的增加，OTU的數(shù)目增加量逐漸減少，但仍未達(dá)到飽和和平坦?fàn)顟B(tài)，但從圖2-b來(lái)看，隨著測(cè)序量的擴(kuò)大，多樣性指數(shù)增加的趨勢(shì)逐漸變慢，并且達(dá)到了飽和狀態(tài)，這說(shuō)明目前的測(cè)序量是合理的，四川泡菜鹽鹵中的細(xì)菌群落多樣性已經(jīng)基本都能檢測(cè)到。

a-可觀測(cè)物種數(shù)；b-香濃指數(shù)圖2 不同蔬菜種類四川泡菜鹽鹵中細(xì)菌菌群稀釋曲線Fig.2 Curves of bacterial populations of Sichuan Paocai brine samples with different vegetable species

2.3 不同蔬菜種類四川泡菜中細(xì)菌群落α多樣性分析

對(duì)不同蔬菜種類四川泡菜中細(xì)菌物種數(shù)目進(jìn)行α多樣性分析，結(jié)果如表2所示。其中，Observed代表觀測(cè)到的OTU數(shù)目，Chao1通常用于估計(jì)微生物群落的豐富度，Shannon通常用于估計(jì)微生物的多樣性，F(xiàn)aith’s PD是α水平上常用的系統(tǒng)發(fā)育多樣性度量方法。由表2可以看出，不同蔬菜種類的四川泡菜中微生物多樣性有所不同，在α水平上辣椒泡菜與豇豆泡菜和蘿卜泡菜具有顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明辣椒泡菜中微生物多樣性最為豐富?；旌吓莶说腃hao1指數(shù)和Faith’s PD指數(shù)也同豇豆泡菜和蘿卜泡菜有顯著差異(P<0.05)，而與辣椒泡菜無(wú)顯著差異(P>0.05)，究其原因可能是受辣椒原料影響所致。相較于辣椒泡菜和混合泡菜，豇豆泡菜和蘿卜泡菜中的微生物多樣性稍低。蔬菜種類不同，其組織結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)成分也有所差異，根據(jù)《中國(guó)食物成分表》可知[16]，3種蔬菜中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量各不相同，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的差異導(dǎo)致了不同蔬菜種類四川泡菜中微生物生長(zhǎng)的差異，因此在α水平上表現(xiàn)出了不同的微生物多樣性。

表2 不同蔬菜種類四川泡菜中細(xì)菌群落的α多樣性評(píng)估Table 2 α Diversity of the bacterial community in Sichuan Paocai with different vegetable species

2.4 不同蔬菜種類四川泡菜中細(xì)菌群落β多樣性分析

通過(guò)β分析可以分析不同蔬菜種類四川泡菜中微生物群落組成的差異性。從圖3主成分分析(principal component analysis，PCA)結(jié)果可以看出，在第一主成分(PC1)上辣椒泡菜與豇豆泡菜和蘿卜泡菜相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明辣椒泡菜中的微生物群落組成與其他2種泡菜中的微生物群落組成相差較大，但無(wú)論是從PC1還是PC2上分析，混合泡菜與其他3種泡菜都相距較近，說(shuō)明混合泡菜中微生物菌落和其他3種泡菜中的微生物菌群都有交集，這主要是因?yàn)榛旌吓莶怂玫氖卟嗽蠟槠渌?種泡菜原料所混合。由上述分析可知，四川泡菜的蔬菜原料種類對(duì)其微生物菌群結(jié)構(gòu)有一定影響，不同蔬菜種類四川泡菜中的細(xì)菌菌群存在差異。

圖3 不同蔬菜種類四川泡菜中細(xì)菌菌群PCAFig.3 Principal component analysis (PCA) results of bacterial communities in Sichuan Paocai with different vegetable species

2.5 不同蔬菜種類四川泡菜中細(xì)菌群落組成分析

為進(jìn)一步明確不同蔬菜種類四川泡菜中細(xì)菌群落組成的差異，對(duì)微生物多樣性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4-a所示。在門水平上，F(xiàn)irmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes是4種泡菜中主要的門(相對(duì)豐度>1%)，圖中每個(gè)散點(diǎn)代表1個(gè)樣品，從樣品的分散情況可知，同種門類在不同的泡菜中相對(duì)豐度存在差異。進(jìn)一步分析圖4-b可知，F(xiàn)irmicutes的相對(duì)豐度在4種泡菜中的占比均為最大，分別為65.61%(辣椒泡菜)、98.66%(豇豆泡菜)、91.99%(蘿卜泡菜)、89.13%(混合泡菜)；雖然Proteobacteria在4種泡菜中的相對(duì)豐度均位居第二，但它僅在辣椒泡菜中的相對(duì)豐度較高(30.70%)，而其他3種泡菜中Proteobacteria的相對(duì)豐度均未超過(guò)10%；Bacteroidetes是辣椒泡菜和混合泡菜中主要的門，其相對(duì)豐度分別為3.37%和1.30%。

由圖4-c可知，在屬水平上，Lactobacillus、Pediococcus、unclassified Enterobacteriaceae、Lactococcus、Enterobacter是4種泡菜中主要的屬，同一細(xì)菌屬在不同蔬菜種類四川泡菜中的相對(duì)豐度略有差異。進(jìn)一步分析圖4-d可知，辣椒泡菜中相對(duì)豐度>1%的屬數(shù)量最多，包括Lactobacillus(58.76%)、Pediococcus(2.46%)、unclassified Enterobacteriaceae(17.95%)、Lactococcus(1.63%)、Enterobacter(5.04%)、Pectobacterium(1.79%)、Citrobacter(0.84%)、Sphingomonas(0.76%)、Aeromonas(0.99%)9個(gè)屬；豇豆泡菜中相對(duì)豐度>1%的屬數(shù)量最少，僅有Lactobacillus(91.41%)、Pediococcus(5.26%)、unclassified Enterobacteriaceae(0.84%)3個(gè)屬；蘿卜泡菜中相對(duì)豐度>1%的屬為L(zhǎng)actobacillus(82.68%)、Pediococcus(1.92%)、unclassified Enterobacteriaceae(6.02%)、Lactococcus(4.69%)、Enterobacter(0.83%)、unclassifiedStreptococcaceae(0.54%)等6個(gè)屬；混合泡菜中相對(duì)豐度>1%的屬為L(zhǎng)actobacillus(81.48%)、Pediococcus(2.98%)、unclassified Enterobacteriaceae(6.47%)、Lactococcus(1.59%)、Enterobacter(1.40%)、Fructobacillus(0.58%)等6個(gè)屬。

a,b-門水平；c,d-屬水平圖4 不同蔬菜種類四川泡菜中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布Fig.4 Distribution of bacterial community structure during fermentation of different vegetable species in Sichuan Paocai

綜上，不同蔬菜原料四川泡菜中主要微生物的種類和數(shù)量都有所不同，辣椒泡菜中微生物種類最為豐富，豇豆泡菜中微生物種類最少，Lactobacillus是四川泡菜中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，這與CAO等[17]的研究結(jié)果一致。不同蔬菜種類四川泡菜的細(xì)菌結(jié)構(gòu)中除相對(duì)豐度>1%的主要屬外，也包括一些低豐度的細(xì)菌屬，如：Weissella、Burkholderia、Cronobacter、Pantoea、Pseudomonas、Arthrobacter等，某些細(xì)菌屬還是不同蔬菜種類四川泡菜的特有的細(xì)菌屬，如Arthrobacter(0.01%)僅在豇豆泡菜檢測(cè)到。有研究表明[18-19]，細(xì)菌是影響風(fēng)味形成的主要微生物，四川泡菜中的低豐度微生物與泡菜風(fēng)味的形成有密切關(guān)系，不同蔬菜種類四川泡菜中微生物存在差異，導(dǎo)致了不同蔬菜種類四川泡菜在具有四川泡菜特有的鮮香味的同時(shí)也富含各自獨(dú)有的風(fēng)味。

2.6 四川泡菜中微生物與理化因子的相關(guān)性分析

CCA常用來(lái)分析微生物菌群與理化因子的關(guān)系[20-21]，本研究采用此法分析不同蔬菜種類四川泡菜中屬水平細(xì)菌菌群與理化因子(pH、亞硝酸鹽、乳酸和醋酸含量)的關(guān)系。從圖5可知，在第一主坐標(biāo)上四川泡菜中屬水平細(xì)菌菌群主要和乳酸正相關(guān)，和pH負(fù)相關(guān)，在第二主坐標(biāo)上，四川泡菜中屬水平細(xì)菌菌群主要和醋酸正相關(guān)，和亞硝酸鹽負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步分析可知，不同蔬菜種類四川泡菜中屬水平細(xì)菌菌群和理化因子的相關(guān)性不同，辣椒泡菜中屬水平細(xì)菌菌群主要與pH具有極強(qiáng)的相關(guān)性(R2=0.97，P=0.000 5)，豇豆泡菜中屬水平細(xì)菌菌群主要和醋酸具有強(qiáng)相關(guān)性(R2=0.77，P=0.000 5)，蘿卜泡菜中屬水平細(xì)菌菌群主要和乳酸具有強(qiáng)相關(guān)性(R2=0.70，P=0.000 5)，混合泡菜中屬水平細(xì)菌菌群和pH、乳酸、醋酸都有一定相關(guān)性，但亞硝酸鹽和4種泡菜中屬水平細(xì)菌菌群的相關(guān)性都較低。

NT-亞硝酸鹽；LA-乳酸；AA-醋酸圖5 細(xì)菌群落和理化因子間的CCAFig.5 CCA between bacterial and physicochemical factors

為進(jìn)一步探究四川泡菜中細(xì)菌群落與理化因子的相關(guān)性，采用Spearman系數(shù)法分析四川泡菜中主要屬水平微生物(相對(duì)豐度>1%)和pH、亞硝酸鹽、乳酸以及醋酸的相關(guān)性，結(jié)果如圖6所示。在11個(gè)被分析的主要細(xì)菌屬中，共有9個(gè)細(xì)菌屬與理化因子表現(xiàn)出了顯著相關(guān)性(P<0.05)，其中與pH呈負(fù)相關(guān)的細(xì)菌屬有Lactobacillus(P<0.01)，呈正相關(guān)的細(xì)菌屬主要是unclassified Enterobacteriaceae、Enterobacter、BacteroidalesS24-7 group uncultured、Citrobacter、Sphingomonas、Aeromonas(P<0.01)；與亞硝酸鹽呈負(fù)相關(guān)的是Pediococcus(P<0.05)，呈正相關(guān)的是Sphingomonas(P<0.05)；與醋酸呈正相關(guān)的是Lactobacillus(P<0.05)，呈負(fù)相關(guān)的是unclassified Enterobacteriaceae(P<0.05)；僅有Fructobacillus與乳酸呈正相關(guān)(P<0.01)。

圖6 四川泡菜中微生物與理化因子的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between microbial flora and physicochemical factors in Sichuan Paocai

Lactobacillus是4種泡菜中主要的細(xì)菌屬，它能夠產(chǎn)生大量有機(jī)酸降低四川泡菜的pH增加其酸度[22]，本研究中Lactobacillus與pH呈負(fù)相關(guān)，與醋酸呈正相關(guān)，4種泡菜中Lactobacillus的相對(duì)豐度均在50%以上，說(shuō)明Lactobacillus在四川泡菜發(fā)酵過(guò)程中占主導(dǎo)地位，是導(dǎo)致4種泡菜pH下降的主要細(xì)菌屬。豇豆泡菜中Lactobacillus(91.41%)的相對(duì)豐度最高，在圖5的分析結(jié)果中也顯示豇豆泡菜中的微生物與醋酸具有強(qiáng)相關(guān)性。與pH呈正相關(guān)的6個(gè)細(xì)菌屬均在辣椒泡菜中有檢測(cè)到，其中unclassified Enterobacteriaceae、Enterobacter、Citrobacter、Sphingomonas和Aeromonas是辣椒泡菜中的主要細(xì)菌屬，這些細(xì)菌屬的存在導(dǎo)致了辣椒泡菜的pH為4種泡菜中最高(4.17±0.24)，這與圖5中辣椒泡菜屬水平細(xì)菌菌群與pH具有強(qiáng)相關(guān)性結(jié)果一致。Enterobacter已被證明與泡菜中生物胺的產(chǎn)生有關(guān)[23]，也有研究表明Enterobacter能夠?qū)l(fā)酵蔬菜中的乳酸轉(zhuǎn)化成丙酸，導(dǎo)致發(fā)酵蔬菜的pH升高[24]，因此，辣椒泡菜的pH較高可能與其細(xì)菌菌群中Enterobacter(5.04%)的相對(duì)豐度較高有密切關(guān)系。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析了不同蔬菜種類四川泡菜中微生物的多樣性，并結(jié)合理化特性分析，探究了四川泡菜中微生物和理化因子間的相關(guān)性。本研究中，辣椒泡菜中的微生物多樣性最為豐富，共檢測(cè)到234個(gè)OTUs，其中Lactobacillus、Pediococcus、 unclassified Enterobacteriaceae、Lactococcus、Enterobacter、Pectobacterium、Citrobacter、Sphingomonas、Aeromonas為辣椒泡菜中的主要細(xì)菌屬；豇豆泡菜中的微生物多樣性最低，僅檢測(cè)到134個(gè)OTUs，其主要細(xì)菌屬僅有Lactobacillus、Pediococcus和unclassified Enterobacteriaceae；蘿卜泡菜中共檢測(cè)到151個(gè)OTUs，Lactobacillus、Pediococcus、unclassified Enterobacteriaceae、Lactococcus、Enterobacter和unclassified Streptococcaceae是蘿卜泡菜中主要的細(xì)菌屬；混合泡菜中共檢測(cè)到196個(gè)OTUs，其中Lactobacillus、Pediococcus、unclassified Enterobacteriaceae、Lactococcus、Enterobacter和Fructobacillus是混合泡菜中的主要細(xì)菌屬。

不同蔬菜種類四川泡菜中屬水平細(xì)菌菌群和理化因子的相關(guān)性不同，辣椒泡菜中屬水平細(xì)菌菌群主要與pH具有極強(qiáng)的相關(guān)性，豇豆泡菜中屬水平細(xì)菌菌群主要和醋酸具有強(qiáng)相關(guān)性。在本研究中，Lactobacillus、Pediococcus和unclassified Enterobacteriaceae是4種泡菜共有的主要細(xì)菌屬，其中，Lactobacillus與pH呈負(fù)相關(guān)，與醋酸呈正相關(guān)；Pediococcus與亞硝酸鹽呈負(fù)相關(guān)；unclassified Enterobacteriaceae與pH呈正相關(guān)，與醋酸呈負(fù)相關(guān)。本研究明確了不同蔬菜種類四川泡菜中微生物多樣性的差異，探究了四川泡菜中微生物和理化因子的相關(guān)性，這對(duì)指導(dǎo)四川泡菜工業(yè)化生產(chǎn)，豐富四川泡菜產(chǎn)品種類具有重要意義，同時(shí)也為四川泡菜產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化升級(jí)提供理論基礎(chǔ)。