■趙玉超 蔣林樹

（北京農(nóng)學院動物科學技術學院，奶牛營養(yǎng)學北京市重點實驗室，北京102206）

天然植物中含有酚類、多糖、生物堿、揮發(fā)油、苷類和有機酸等多種功能組分。動物營養(yǎng)學研究表明，日糧中添加這些植物提取物或功能組分，能夠調(diào)節(jié)機體免疫、促進動物生長等，被認為是天然的抗生素替代飼料添加劑。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部宣布自2020 年1 月1 日起，退出除中藥外的所有促生長類藥物添加劑品種，且改革和完善了天然植物原料進入飼料原料目錄的審批流程，這為天然植物功能組分開發(fā)與應用帶來了新的機遇。

植物功能組分雖來源廣泛，但其含量和種類，受季節(jié)、地域、植物部位及制備工藝變化影響較大，導致同種植物同部位的提取物含有的功能組分、化學結(jié)構和分子量差異明顯，造成其在動物體內(nèi)代謝途徑不一致，進而影響了試驗結(jié)果的比較及產(chǎn)品的推廣利用。因此，文章綜述了飼用天然植物功能組分新產(chǎn)品創(chuàng)制需要注重的幾個關鍵要素，旨在為建立新產(chǎn)品安全性和有效性的評價體系，為深入開展天然植物功能組分飼用與機理研究提供參考。

1 我國飼用天然植物功能組分產(chǎn)品創(chuàng)制的現(xiàn)狀

天然植物功能組分產(chǎn)品，又名植物提取物產(chǎn)品，是以植物為原料，經(jīng)過物理化學提取分離過程，定向獲取或富集植物中某一種或多種有效成分，而不改變其有效成分結(jié)構而形成的產(chǎn)品。隨著植物活性物質(zhì)在畜禽養(yǎng)殖上的潛在功效不斷被人們所認識，飼用天然植物功能組分產(chǎn)品的開發(fā)應用成為了未來畜牧業(yè)發(fā)展的重要方向之一。

2012年，《飼料和飼料添加劑管理條例》經(jīng)國務院公布修訂后，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制定發(fā)布了配套規(guī)章和規(guī)范性文件，其中在《飼料原料目錄》中，列出了藥食同源的飼用天然植物117種；在《飼料添加劑品種目錄》中，列出了杜仲葉提取物等12種植物提取物產(chǎn)品。這些原料或添加劑產(chǎn)品具有改善畜禽腸道健康、增強動物免疫機能等生理功能，將不同程度地填補促生長藥物飼料添加劑退出后的技術空白。此外，自2020年開始，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部從提供審批事前咨詢服務、減少新產(chǎn)品評審材料要求、針對性地制定評審要求、優(yōu)化評審工作流程和增加評價試驗機構等方面建立了天然植物產(chǎn)品審批綠色通道，加快新產(chǎn)品審批速度，從政策角度鼓勵飼用天然植物功能組分新產(chǎn)品創(chuàng)制。天然植物功能組分制備與肉蛋奶品質(zhì)提升技術已列入國家“十四五”重點研發(fā)計劃——畜禽新品種培育與現(xiàn)代牧場科技創(chuàng)新重點專項實施方案的任務布局。

飼用天然植物功能組分新產(chǎn)品按照分離純化程度，可以分為全提取物、組分提取物和純化提取物。全提取物是天然植物材料經(jīng)過提取、濃縮之后，未經(jīng)分離純化得到的含有多種功能組分類別的產(chǎn)品；組分提取物是植物粗提物經(jīng)過分離后，可針對一種或多種組分的已知化合物進行定性定量分析的產(chǎn)品；純化提取物是植物材料經(jīng)過更嚴格的提取、分離純化之后得到單一成分的產(chǎn)品，純度一般不低于90%。

飼用天然植物功能組分產(chǎn)品的創(chuàng)制流程見圖1。中關村中獸醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)技術創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟制定的黃芪、甘草、金銀花、絞股藍等4個品種的干燥物、粉碎物和粗提物等12個團體標準已于2021年1月30日開始實施。但現(xiàn)有的可飼用植物提取物種類繁多，仍普遍缺乏國家標準和行業(yè)團體標準等。這導致許多企業(yè)在產(chǎn)品創(chuàng)制方面，只有企業(yè)標準。沒有充足的標準可以參照，導致各個企業(yè)難以使用統(tǒng)一的方法對從植物源頭進行規(guī)范化研發(fā)。天然植物中功能組分的組成和含量會因氣候、溫度、季節(jié)、土壤和其他因素而異，這些變異都讓飼用新產(chǎn)品創(chuàng)制面臨更大挑戰(zhàn)。其次，檢測指標的缺乏，導致生產(chǎn)的產(chǎn)品是否合格存在爭議，進而影響到產(chǎn)品的銷售。而在畜禽飼喂上的試驗研究，多出現(xiàn)生理生化指標結(jié)果不一致或矛盾的現(xiàn)象，這進一步阻礙了植物功能組分在畜禽上的推廣應用。

圖1 飼用天然植物功能組分產(chǎn)品創(chuàng)制流程[Azmir等（2013）]

2 原材料標準化

?impraga等（2016）將植物稱為“化學工廠”，同一物種的不同植物提取物在動物體內(nèi)會產(chǎn)生不同的生理和病理反應，主要就在于植物次級代謝物的復雜性和變異性。植物生長的地理區(qū)域、氣候、環(huán)境應激、生長和收獲期等，這些因素中的每一個都會對天然植物的化學成分產(chǎn)生影響。為了保證最終產(chǎn)品的質(zhì)量和功效，天然植物功能組分原材料的標準化是新產(chǎn)品創(chuàng)制的必然要求，這是能否生產(chǎn)合格產(chǎn)品的第一步，也是至關重要的一步。原材料的采收季節(jié)、采收部位、加工方式及貯藏條件與制備產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量有直接關系。因此，對植物材料的采收季節(jié)、采收部位、加工方式、貯存條件等制定簡便的標準操作規(guī)程，是非常有必要的。

首要的影響因素是植物材料的基源，也就是遺傳因素。由于植物同物異名、同名異物等原因，導致提取物市場品種混亂。而在試驗研究方面，國內(nèi)動物營養(yǎng)學界對植物來源缺乏關注，往往只說明了“種”或“屬”的提取物，缺乏拉丁學名進行有效辨識，在與國際相關研究比較時，往往證據(jù)并不充足。這方面可參考中藥質(zhì)量控制，國家藥典標準及國家局（部）頒布的標準都要求“一名一物”。因此，飼用植物功能組分新產(chǎn)品創(chuàng)制的前提是必須確定原植物的科名、中文名及拉丁學名等。例如，不同的紫錐菊物種[Echinacea angustifoliaDC、Echinacea pallida(Nutt.) Nut、Echinacea purpurea(L.) Moenc]中含有的紫錐菊苷、醇酰胺、咖啡酸衍生物、黃酮類化合物和精油含量方面差異明顯。

決定植物功能組分類別的首要因素是遺傳，但各組分積累含量可能與環(huán)境因素關系更為密切。特別是地理因素，造成同一物種在不同產(chǎn)地的植物功能組分含量不同。例如，姜黃（Curcuma longaL.）是姜科的一種常見草本植物，其根莖具有較大的應用價值，但研究顯示出不同地理來源的姜黃素含量和精油成分的差異顯著。因此，新產(chǎn)品創(chuàng)制，必須考慮物種的最佳產(chǎn)地，確定不同產(chǎn)地下某植物功能組分的指紋圖譜。其次，要考慮植物材料的采收時間。植物提取物產(chǎn)品應用的物質(zhì)基礎是其中含有的功能組分，而功能組分的質(zhì)和量與植物原材料的采收時間（包括采收期和采收年限）關系密切。植物材料的生長發(fā)育期不同，其所含的功能組分含量差異較大。Chalchat等（2008）的一項研究表明，冬季采集的羅勒草（Ocimum basilicumL.）富含含氧單萜，而夏季采集的羅勒草富含倍半萜。因此，應根據(jù)有效成分積累規(guī)律和可采收率來綜合確定最佳采收期。此外，植物采收部位也是一個考慮因素。如車前草的不同部位中含有不同種類和含量的多糖、多酚、環(huán)烯醚萜苷、咖啡酸衍生物、黃酮類化合物和生物堿。應確定植物不同采收部位中功能組分的含量變化規(guī)律，確定適宜的采收部位。

3 提取分離工藝優(yōu)化

采用傳統(tǒng)提取工藝如液液萃取、固相萃取和固相微萃取等面臨的主要問題是萃取時間長（2～12 h），昂貴和高純度的有機溶劑大量消耗，有機溶劑揮發(fā)，選擇性低，熱不穩(wěn)定化合物分解等，不適合未來的飼用新產(chǎn)品創(chuàng)制。為了克服傳統(tǒng)提取方法的局限性，新方法開始不斷被探索應用，包括超聲輔助萃?。║AE）、微波輔助萃取（MAE）、酶解輔助萃?。‥AE）、脈沖電場輔助萃?。≒EFAE）、超臨界流體萃?。⊿FE）和加壓液體萃?。≒LE）等，被認為是綠色工藝。所有工藝都有其優(yōu)點和缺點，提取技術的選擇需要依據(jù)植物種類和目標化合物的種類來進行，這方面已經(jīng)有大量綜述（見圖2）。盡管針對這些方法的研究已經(jīng)有大量學術論文和專利，但工業(yè)上仍未能被廣泛應用。因此，需要在工業(yè)應用的情景下，來優(yōu)化這些新型綠色方法并提高其規(guī)?；a(chǎn)的適應性。

圖2 飼用天然植物功能組分提取與優(yōu)化[Kumar等（2021）]

植物提取物可能包含數(shù)千種成分，要想富集某類或某種成分就必須進行分離純化，通常需要結(jié)合多種分離技術，主要取決于待分離化合物的溶解性、揮發(fā)性和穩(wěn)定性。粗提物可經(jīng)大孔樹脂、凝膠過濾、膜分離、重結(jié)晶法等進行純化富集。如果需要制備純化提取物產(chǎn)品，還應該采用快速柱色譜（FCC）、中壓液相色譜（MPLC）、制備型液相色譜（Prep-HPLC）和高速逆流色譜（HSCCC）等進一步純化。Sticher（2008）針對天然植物產(chǎn)物分離制備中的常用技術及其技術原理、溶劑體系選擇和應用示例等進行了全面詳細的闡述。Prep-HPLC 和HSCCC 是目前最重要和最常用的分離制備純產(chǎn)物的方法，適合大批量制備。在過去的20年中，Prep-HPLC的使用已成為分離純化天然植物功能組分的主要手段之一，且隨著眾多色譜柱和設備制造商的競爭，Prep-HPLC系統(tǒng)的相對成本有所下降，許多研究團隊已經(jīng)能夠擁有并掌握Prep-HPLC 系統(tǒng)。HSCCC 是在逆流色譜的基礎上進行了根本性的改進，分辨率、分離時間和上樣量均有提高，可在數(shù)小時內(nèi)高效分離多克數(shù)量的樣品。另一方面，高效提取、分離和純化方法的聯(lián)合應用成為新趨勢，如SFE/MAE與HSCCC 從天然植物中提取、分離和純化得到的產(chǎn)物純度可達到98%～99%。每一種方法都有優(yōu)缺點，新產(chǎn)品創(chuàng)制之前，研發(fā)人員必須根據(jù)預期的天然產(chǎn)物的物理化學性質(zhì)來評估合適的提取和分離方法，進行大量試驗優(yōu)化條件參數(shù)，以提高產(chǎn)品的得率或純度。

4 產(chǎn)品質(zhì)量控制

質(zhì)量控制是評價植物功能組分產(chǎn)品創(chuàng)制能否合格的關鍵一環(huán)。針對植物功能組分產(chǎn)品多成分、多靶點復雜體系的特點，如何科學有效地評價其質(zhì)量，是研究的熱點問題。質(zhì)量控制要求植物功能組分產(chǎn)品的特性、純度和有效成分符合既定規(guī)格，且控制污染物，并在規(guī)定條件下制造、包裝、貼標簽和保存，防止摻假。

4.1 指紋圖譜

指紋圖譜是指植物材料經(jīng)過制備后，采用現(xiàn)代儀器分析技術，通過圖像、圖形、光譜等圖譜或數(shù)據(jù)反映天然植物中所含功能組分的種類和含量，是一種綜合的、可量化的鑒別模式。其特點主要表現(xiàn)在兩方面，一是整體性，能夠全面反映植物化學成分的種類和含量，相比單一成分的定性定量，更能從整體上反映提取物的有效成分；二是穩(wěn)定性和特征性，其將色譜圖轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)，在缺乏標準品的情況仍可以對其成分進行鑒別，提供更加豐富和有用的信息，有效保證產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定。

應用最廣泛的是高效液相色譜（HPLC）和超高效液相色譜（UHPLC）連接光電二極管陣列檢測器（PDA）、熒光檢測器（FD）和質(zhì)譜（MS）等，具有分辨率高、重復性好、效率高的特點。高分辨率質(zhì)譜（HRMS）、帶電氣溶膠檢測器（CAD）和蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）常用于植物提取物的非靶向分析。此外，氣相色譜（GC）結(jié)合火焰離子檢測器（FID）和MS、超臨界流體色譜（SFC）、超高效超臨界流體色譜（UHPSFC）、電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）、核磁共振（NMR）、傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）和高效薄層色譜（HPTLC）也已被采用。

天然植物中功能組分的首選分析技術是HPLC結(jié)合PDA/UV 檢測器，這可能是因為目前大多數(shù)實驗室都比較成熟地建立了該方法。而UHPLC近年來也越來越普遍，F(xiàn)D、CAD、ELSD和最常見的MS等檢測手段正在替代UV。雖然GC可用于揮發(fā)性物質(zhì)的分析，但SFC及其增強形式UHPSFC更具應用前景。而SFC是一種強大的分析手段，在定性、定量方面有較大的選擇范圍，可實現(xiàn)傳統(tǒng)LC 無法實現(xiàn)的異構化合物的分離，具有較好的應用前景。圖3給出了各種分析技術及其檢測方法在鑒定特定功能組分方面的適用性。指紋圖譜的建立應該能包含大部分成分或指標性成分的全部，通過峰位順序、比值等反映植物產(chǎn)地的特征性。此外，樣本制備、分析過程和數(shù)據(jù)采集等都需要規(guī)范化操作，不同機構、不同操作人員重復的結(jié)果應在誤差合理范圍之內(nèi)，以體現(xiàn)指紋圖譜的穩(wěn)定性。

圖3 天然植物功能組分分析技術的適用性[Fibigr等（2018）]

4.2 一測多評

一測多評（QAMS）是另一種常用的質(zhì)量評價模式，基于植物提取物中某一對照品的典型組分作為內(nèi)標，同時對多個成分進行含量測定，建立該組分與其他待測組分之間的相對校正因子，其他組分則根據(jù)對照品的圖譜確定色譜峰，進而采用相對校正因子計算其組分的含量。QAMS僅需測定內(nèi)標的含量，就可以對多個組分定性定量，減少了檢測時間，降低了檢測成本。隨著研究的深入，QAMS已經(jīng)形成了較為成熟完善的科學評價體系，流程包括色譜的優(yōu)化和驗證、色譜穩(wěn)定性評價、評估和驗證QAMS的可行性，QAMS計算值與外標法實測值的相對標準偏差小于5%時，則可以準確評價天然植物功能組分產(chǎn)品質(zhì)量。目前，QAMS 已成功用于黨參、淫羊藿、黃連、黃芪、黃芩、連翹等多種中藥材的質(zhì)量評定。針對飼用天然植物提取物多成分、多靶點的特點，單一成分往往很難表達產(chǎn)品質(zhì)量狀況，多成分質(zhì)量控制是未來趨勢。飼用新產(chǎn)品在創(chuàng)制推廣應用上必然要面臨成本難題，而QAMS則可以有效解決對照品短缺問題，降低檢測成本，適合在新產(chǎn)品創(chuàng)制中采用。

5 組分協(xié)同作用評價

天然植物功能組分的生物活性取決于其生物可及性和生物利用度，但動物腸道吸收某組分化合物之后可能導致其他組分的生物利用度發(fā)生變化，進而影響后者的生物活性。全提取物和組分提取物產(chǎn)品是多種植物化學物質(zhì)的組合。通常認為，不同組分的代謝物可相互作用產(chǎn)生比單獨化合物更強的生物活性，也稱為組分的協(xié)同作用。此作用可能是調(diào)節(jié)多種途徑、多種細胞和炎癥標志物的結(jié)果。以姜黃素和胡椒堿組合的研究為例，在結(jié)腸和肝臟中，胡椒堿可抑制姜黃素在肝臟和腸道的葡萄糖醛酸化，增加姜黃素的生物利用度，同時腸道微生物菌群代謝這些化學物質(zhì)，反過來也影響微生物組成，最終提高血液和組織中化合物的水平。

6 動物試驗評價

由于植物提取物產(chǎn)品成分的復雜性和變異性，導致動物體內(nèi)試驗之間的相互比較存在較大問題。而動物試驗研究中動物品種、動物數(shù)量、預飼時間和采樣時間、添加劑量水平，以及試驗條件、試驗環(huán)境和牧場管理等，這些復雜因素讓試驗數(shù)據(jù)很難重復。因此，飼用天然植物功能組分的動物體內(nèi)研究必須在試驗動物數(shù)量、試驗設計和數(shù)據(jù)分析的細節(jié)更加科學規(guī)范。相關部門應在動物試驗設計和數(shù)據(jù)管理分析制定相關標準，在創(chuàng)新研究設計、基于新技術的數(shù)據(jù)管理方面不斷接軌國際，滿足飼用天然植物功能組分新產(chǎn)品創(chuàng)制的需求。其次動物攝入的植物功能組分產(chǎn)品要進行化學表征。而當前大多數(shù)研究都普遍缺乏這一關鍵數(shù)據(jù)，造成隨后的指標結(jié)果不可比較。

除了評定常規(guī)的基礎指標如營養(yǎng)物質(zhì)消化、瘤胃發(fā)酵、免疫和抗氧化、生產(chǎn)性能和畜產(chǎn)品品質(zhì)，未來飼用新產(chǎn)品的開發(fā)評估需要注重：①確定評估功能組分產(chǎn)品的等效性（即評估不同廠家或同一廠家的不同批次的同一種產(chǎn)品能否產(chǎn)生相同的生物效應的指標）的方法；②明確在畜禽體內(nèi)發(fā)揮作用的活性成分和生物反應模式；③評估活性物質(zhì)的吸收、分布、代謝和消除。最終目標是產(chǎn)生足夠的高質(zhì)量研究數(shù)據(jù)來支撐新產(chǎn)品應用的決策。

7 完善標準管理

醫(yī)藥上很多出版物規(guī)定了植物原料和簡單成品的最低質(zhì)量標準，其中包括歐洲藥典、美國藥典、中華人民共和國藥典和中國香港本草標準等。這些高質(zhì)量專著包含了單個植物藥的特性、成分和含量、純度和效果，列出了在良好生產(chǎn)規(guī)范（GMP）的關鍵工序。歐盟EMA、美國FDA、中國SFDA 相關藥典和標準中對植物提取物質(zhì)量標準的要求比較與分析見表1。

表1 歐盟EMA、美國FDA、中國SFDA關于植物提取物質(zhì)量標準的對比

因此，參考植物藥的標準，政府部門可制定宏觀的法律法規(guī)、提取物標準用于監(jiān)管所有飼用植物產(chǎn)品的創(chuàng)制。①健全標準項目，包括產(chǎn)品的基本項目即植物名稱、產(chǎn)地、性狀、鑒別、保質(zhì)期、包裝等，增加雜質(zhì)檢測、特征/指紋圖譜，安全性指標即重金屬、有害元素、黃曲霉素等，有效性指標即有效組分/特征主成分或類組分及其含量。②明確監(jiān)管部門、評價試驗機構、生產(chǎn)企業(yè)在標準實施中的地位、責任和義務。政府部門可約束企業(yè)嚴格執(zhí)行GMP，對產(chǎn)品制造設施、摻假等行為進行監(jiān)督，對新產(chǎn)品要求企業(yè)出具第三方評價試驗機構報告。企業(yè)在原料選擇、GMP執(zhí)行和上市監(jiān)督方面有義務遵守質(zhì)量標準。③建立以企業(yè)為主體，高校、科研院所和行業(yè)協(xié)會共同參與的標準提高激勵機制，各方在生產(chǎn)和科研方面應關注原料變更、工藝更新、檢測數(shù)據(jù)變化等，不斷提高新產(chǎn)品創(chuàng)制的標準水平。飼用天然植物功能組分產(chǎn)品標準和規(guī)范化生產(chǎn)體系的建立，將從硬件設備和軟件技術各方面對企業(yè)提出更高要求，提高行業(yè)準入門檻，從而起到凈化市場、規(guī)范企業(yè)行為，突破現(xiàn)階段從動物試驗研究到生產(chǎn)應用的瓶頸。

8 小結(jié)

為了充分發(fā)揮天然植物在無抗替抗背景下的優(yōu)勢，推動畜牧業(yè)高質(zhì)量發(fā)展，飼用天然植物功能組分新產(chǎn)品必須采取標準化、規(guī)范化創(chuàng)制，以期能夠有效且安全地調(diào)控動物生長與健康。完整的飼用植物功能組分產(chǎn)品創(chuàng)制應從植物基源、產(chǎn)地、采收加工、提取分離、功能組分定性定量、協(xié)同等相互作用評價、動物試驗評定等多層次多要素把控產(chǎn)品質(zhì)量。未來，政府部門、生產(chǎn)企業(yè)、科研單位應逐步聯(lián)合建立飼用天然植物功能組分的質(zhì)量標準，尤其是原料采收加工、提取和檢驗這三個重要環(huán)節(jié)，探索構建適合畜禽生產(chǎn)的新產(chǎn)品創(chuàng)制體系