王倩 王羅俊 顧然 田甜 李亞騏 瞿祥 龍光文 涂麗 蔡立君 田錦勇

(1貴州省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 貴陽 550002；2中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學附屬西京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3貴州省人民醫(yī)院急診內(nèi)科；貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 4全科醫(yī)學科；5神經(jīng)內(nèi)科)

帕金森病(PD)高發(fā)于老年人群，其臨床表現(xiàn)為運動遲緩、姿勢平衡障礙等，目前關于多巴胺神經(jīng)元細胞凋亡的機制尚未完全闡明〔1〕。因而如何抑制神經(jīng)元細胞凋亡成為治療PD的關鍵環(huán)節(jié)。研究表明顱腦損傷后微小RNA-122-5p(miR-122-5p)的表達下調(diào)，其可能通過促使p53表達上調(diào)而促進神經(jīng)細胞凋亡〔2〕。miR-122在大鼠肝損傷中呈低表達，上調(diào)miR-122對肝細胞化學性損傷發(fā)揮保護作用〔3〕。但miR-122-5p在PD模型細胞損傷中的作用機制尚未完全闡明。Targetscan預測miR-122-5p的靶基因，預測顯示核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構域(NOD)2可能是miR-122-5p的靶基因，研究表明NOD2在6-羥基多巴胺(OHDA)誘導的PD動物模型中呈高表達，敲除NOD2可減輕神經(jīng)元損傷〔4〕。腎缺血再灌注損傷小鼠腎組織中NOD2表達水平升高，抑制NOD2信號通路可減輕炎癥反應而減輕腎損傷〔5〕。NOD2高表達還可促進潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生及發(fā)展，抑制NOD2表達可減輕結(jié)腸黏膜炎癥〔6〕。腦缺血后腦組織中NOD2的表達上調(diào)，下調(diào)NOD2的表達可對局灶性腦缺血發(fā)揮保護作用〔7〕。但miR-122-5p是否通過調(diào)控NOD2的表達影響PD細胞的損傷尚未可知。因此本研究主要探討miR-122-5p是否通過調(diào)控NOD2基因而抑制MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 SH-SY5Y細胞購自美國ATCC細胞庫。1-甲基-4苯基-吡啶離子(MPP+)購自美國Sigma公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司；胰蛋白酶購自美國Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自上海吉泰依科賽生物科技有限公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量(qRT)PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；RIPA蛋白裂解液購自美國Sigma公司；Lipofectamine2000購自北京索萊寶科技有限公司；miR-122-5p mimics、miR-122-5p抑制劑(anti-miR-122-5p)、NOD2小干擾RNA(si-NOD2)及其各自陰性對照購自廣州銳博生物科技公司；丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程；二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒購自北京碧云天生物有限公司；NOD2、Bax、Bcl-2抗體與辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗均購自美國Santa Cruz公司。

1.2實驗分組 用1 mmol/L的MPP+誘導SH-SY5Y細胞建立PD模型(MPP+組)，未經(jīng)處理的SH-SY5Y細胞作為Con組〔8〕，將SH-SY5Y細胞隨機分為： MPP++miR-NC組(miR-NC轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞48 h，隨后用1 mmol/L的MPP+處理24 h)、MPP++miR-122-5p組(miR-122-5p mimics轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞48 h，隨后用1 mmol/L的MPP+處理24 h)、MPP++si-NC組(si-NC轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞48 h，隨后用1 mmol/L的MPP+處理24 h)、MPP++si-NOD2組(si-NOD2轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞48 h，隨后用1 mmol/L的MPP+處理24 h)、MPP++miR-122-5p+pcDNA組(miR-122-5p mimics與空載體pcDNA共轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞48 h，隨后用1 mmol/L的MPP+處理24 h)、MPP++miR-122-5p+pcDNA-NOD2組(miR-122-5p mimics與pcDNA-NOD2共轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞48 h，隨后用1 mmol/L的MPP+處理24 h)。

1.3qRT-PCR檢測細胞中miR-122-5p、NOD2 mRNA表達水平 收集各組細胞，加入1 ml Trizol，細胞裂解后轉(zhuǎn)移至1.5 ml無菌無酶的EP管內(nèi)，室溫放置10 min，加入200 μl氯仿，振蕩混勻，室溫孵育5 min，4℃ 12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，吸取上清轉(zhuǎn)移至另一無菌無酶的EP管內(nèi)，加入200 μl異丙醇，室溫靜置10 min，4℃ 12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，棄上清，加入預冷乙醇，反復沖洗后晾干，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解沉淀，應用紫外分光光度計測定RNA質(zhì)量。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，配制qRT-PCR體系：SYBR Green 預混液15 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各1 μl，ddH2O補足體系至25 μl。反應條件：95℃預變性2 min，變性、退火及延伸：40個循環(huán)(95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s)。miR-122-5p以U6為內(nèi)參，NOD2 以GAPDH為內(nèi)參，置于96孔板熒光定量PCR儀進行擴增反應，反應結(jié)束后得到Ct值，采用2-ΔΔCt法計算miR-122-5p、NOD2 mRNA相對表達量。

1.4測定MDA、GSH含量 收集各組細胞，采用比色法檢測MDA、GSH含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡 分別取各組轉(zhuǎn)染后SH-SY5Y細胞，按照細胞凋亡檢測試劑盒進行操作，預冷PBS洗滌細胞，取1×106個細胞加入200 μl結(jié)合緩沖液重懸，加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl的PI，充分混勻，室溫避光孵育15 min，加入400 μl結(jié)合緩沖液重懸至流式管內(nèi)，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?SH-SY5Y細胞以每孔3×103個細胞的密度接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)12 h，按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，每孔共轉(zhuǎn)NOD2的3'-非翻譯區(qū)(UTR)熒光素酶報告基因(40 ng)或其突變載體、pRL-TK熒光素酶內(nèi)參質(zhì)粒(10 ng)及終濃度為20 nmol/L的miR-122-5p mimics，以miR-NC為對照，轉(zhuǎn)染24 h，應用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

1.7Western印跡檢測NOD2、B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)蛋白表達 SH-SY5Y細胞處理后分別收集各組細胞，加入細胞裂解液裂解細胞，采用BCA法測定蛋白濃度，取30 μg蛋白樣品進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用含有牛血清白蛋白(BSA)的Tis-HCl緩沖液(TBST)封閉1 h，加入NOD2、Bax、Bcl-2抗體(1∶500)，4℃孵育24 h，TBST洗膜，加入二抗(1∶2 000)，室溫杜宇1 h，TBST洗膜，滴加ECL顯影，應用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗，方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-122-5p和NOD2在MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷中的表達 與Con組相比，MPP+組SH-SY5Y細胞中miR-122-5p表達水平顯著降低，NOD2 mRNA及蛋白表達水平顯著升高(均P<0.001)，見表1、圖1。

2.2miR-122-5p靶向調(diào)控NOD2的表達 Targetscan預測miR-122-5p的靶基因，miR-122-5p可靶向NOD2的3'UTR區(qū)，見圖2。為驗證miR-122-5p是否靶向作用于NOD2，構建NOD2的熒光報告基因載體及突變體載體后，共轉(zhuǎn)染NOD2的3'UTR熒光素酶報告基因載體與miR-122-5p mimics，結(jié)果顯示，miR-122-5p可抑制NOD2的3'UTR熒光素酶報告基因的活性(P<0.05)，而當miR-122-5p的結(jié)合位點突變后，miR-122-5p對NOD2的3'UTR熒光素酶報告基因活性的抑制作用消失，見表2。

表1 miR-122-5p和NOD2在MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷中的表達

圖1 Western印跡檢測NOD2蛋白

圖2 NOD2的3'UTR中含有與miR-122-5p互補的核苷酸序列

表2 雙熒光素酶報告實驗

采用Western印跡檢測結(jié)果顯示，SH-SY5Y細胞中轉(zhuǎn)染miR-122-5p mimics后，與miR-NC組(0.43±0.04)相比，miR-122-5p組NOD2蛋白表達水平顯著降低(0.22±0.02，P<0.05)；而SH-SY5Y細胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-122-5p后，與anti-miR-NC組(0.41±0.05)相比，anti-miR-122-5p組NOD2蛋白表達水平顯著升高(0.89±0.08，P<0.05)，見圖3。

1～4：miR-NC組，miR-122-5p組，anti-miR-NC組，anti-miR-122-5p組圖3 miR-122-5p靶向調(diào)控NOD2的表達

2.3miR-122-5p過表達對MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷的影響 與Con組比較，MPP+組SH-SY5Y細胞中MDA含量明顯升高，而GSH含量明顯降低，細胞凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，Bax蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)，進一步研究顯示，與MPP++miR-NC組相比，MPP++miR-122-5p組SH-SY5Y細胞中MDA含量明顯降低，GSH含量明顯升高，細胞凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，Bax蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)，見表3、圖4、圖5。

2.4抑制NOD2表達對MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷的影響 與MPP++si-NC組比較，MPP++si-NOD2組SH-SY5Y細胞中MDA含量明顯降低，GSH含量明顯升高，細胞凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，Bax蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)，見圖6、表4。

表3 miR-122-5p過表達對MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷的影響

圖4 miR-122-5p過表達對MPP+誘導SH-SY5Y細胞凋亡的影響

1～4:Con組,MPP+組，MPP++miR-NC組，MPP++miR-122-5p組圖5 Western印跡檢測凋亡相關蛋白表達

1～4：Con組，MPP+組，MPP++si-NC組，MPP++si-NOD2組圖6 NOD2和凋亡相關蛋白表達

表4 抑制NOD2表達對MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷的影響

2.5NOD2過表達逆轉(zhuǎn)了miR-122-5p過表達對MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷的作用 與MPP++miR-122-5p+pcDNA組比較，MPP++miR-122-5p+pcDNA-NOD2組SH-SY5Y細胞NOD2蛋白表達、凋亡率、MDA含量與Bax蛋白表達水平均顯著升高，而GSH含量及Bcl-2蛋白表達水平均顯著降低(均P<0.05)，見表5、圖7。

表5 NOD2過表達逆轉(zhuǎn)了miR-122-5p過表達對MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷的作用

1～4：miR-NC組，miR-122-5p組，miR-122-5p+pcDNA組，miR-122-5p+pcDNA-NOD2組圖7 NOD2和凋亡相關蛋白表達

3 討 論

miRNA可通過結(jié)合mRNA的3'UTR區(qū)序列而負性調(diào)控基因表達進而參與神經(jīng)退行性疾病等多種病理過程〔9,10〕。研究表明炎癥因子釋放量增加可損傷多巴胺神經(jīng)元，既往研究發(fā)現(xiàn)PD發(fā)病機制與多巴胺氧化產(chǎn)生的毒性代謝物、細胞凋亡及炎癥反應等密切相關〔11〕。

miR-122-5p在黑色素瘤組織中高表達，并可通過誘導細胞周期阻滯而抑制細胞增殖〔12〕。miR-122-5p在不同病理類型或不同組織中的表達及其可能作用機制不同，研究表明miR-122-5p在四氯化碳誘導的急性肝損傷大鼠中表達下調(diào)，上調(diào)miR-122-5p表達可有效改善大鼠肝臟損傷〔13〕。miR-122-5p在膝骨關節(jié)炎中的表達水平降低，其低表達量與疾病嚴重程度呈負相關〔14〕。本研究結(jié)果說明miR-122-5p表達降低可能加重MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷。GSH屬于抗氧化酶類并可有效降低氧化應激反應從而防止脂質(zhì)過氧化引起的神經(jīng)元凋亡〔15〕。PD疾病發(fā)生過程中Bcl-2與Bax可介導神經(jīng)元細胞凋亡、細胞質(zhì)性細胞死亡等過程，研究表明Bcl-2過表達或Bax低表達可減少神經(jīng)元細胞的凋亡〔16〕。說明PD模型細胞中的氧化應激反應被激活，抗氧化應激能力降低，神經(jīng)元細胞凋亡增加，而miR-122-5p過表達可明顯提高細胞抗氧化能力及抗凋亡能力。提示miR-122-5p過表達可改善MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷，對SH-SY5Y細胞發(fā)揮保護作用。

本研究結(jié)果證實NOD2是miR-122-5p的靶基因，miR-122-5p可負性調(diào)控NOD2表達，其中NOD2屬于NOD家族成員，并可在多種炎癥性疾病或免疫疾病中發(fā)揮重要作用，研究表明NOD2在PD發(fā)生過程中可能發(fā)揮重要作用〔17〕。NOD2可通過調(diào)控多種信號通路參與炎癥反應、氧化應激反應等多種病理過程，研究表明敲除NOD2基因可通過減少炎癥因子生成量而改善糖尿病小鼠腎損傷〔18〕。相關研究報道指出，敲除NOD2基因可通過減少TNF-α等炎性細胞因子釋放及促進Bcl-2蛋白表達而保護PD小鼠神經(jīng)元〔19〕。提示miR-122-5p可能通過調(diào)控NOD2基因表達而保護PD模型細胞。進一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制NOD2表達后，MPP+誘導SH-SY5Y細胞氧化應激水平降低，細胞凋亡能力受到抑制，而NOD2過表達可逆轉(zhuǎn)miR-122-5p過表達對MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷的保護作用。提示miR-122-5p過表達可靶向抑制NOD2表達及增強抗氧化能力從而對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷發(fā)揮保護作用。

綜上所述，MPP+誘導SH-SY5Y細胞模型中，miR-122-5p表達下調(diào)，NOD2表達上調(diào)，miR-122-5p過表達可通過靶向NOD2抑制細胞凋亡及增強其抗氧化能力，對PD模型細胞損傷發(fā)揮保護作用，可為PD治療提供新方向。