李佳熹 曹 炬 （重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，重慶 400016）

膿毒癥是一種由宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙，也是患者進(jìn)入ICU 常見的重要原因，具有較高的發(fā)病率和病死率［1-4］。膿毒癥發(fā)病機(jī)制與全身炎癥網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)、基因的多態(tài)性、免疫功能障礙、器官組織損傷以及宿主對不同感染病原微生物的異常反應(yīng)等多因素相關(guān)，與機(jī)體多系統(tǒng)、多器官病理生理改變密切相關(guān)，目前還沒有有效的治療方法來提高患者的生存率［5-6］。因此，探究CXCL16 在膿毒癥中的病理過程及其作用，對膿毒癥的治療及預(yù)后有著重要的意義。血清CXC趨化因子配體16（CXC chemokine ligand 16，CXCL16）是趨化因子家族中的一員，是以膜蛋白結(jié)合形式及可溶性蛋白形式兩種方式存在的跨膜蛋白，具有清道夫受體和促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤的作用［7］。有研究表明CXCL16 可誘導(dǎo)急性胰腺炎小鼠的腺泡細(xì)胞壞死，并且近年來CXCL16 作為壞死性胰腺炎的檢測指標(biāo)［8-9］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)CXCL16 可發(fā)揮其炎癥因子功能參與心衰的發(fā)生發(fā)展，并且高水平表達(dá)的CXCL16與心衰的嚴(yán)重程度密切相關(guān)［10-11］。但CXCL16在膿毒癥中的表達(dá)水平及病理過程中的作用仍不清楚。因此，本研究旨在通過探究CXCL16 在小鼠膿毒癥中的表達(dá)水平與免疫病理過程中的作用，為膿毒癥的診斷、治療及預(yù)后提供新的理論依據(jù)及應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動物選取SPF 級C57BL/6 小鼠，雄性，8～10 周齡，體質(zhì)量22～24 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；CXCL16、IL-6、TNF-α 和IFN-γ 的ELISA試劑盒購自R＆D systems；CXCL16重組蛋白及Anti-CXCL16蛋白購自R＆D systems 公司；TRIzol試劑盒購自TaKaRa 公司；Fc 封閉抗體、細(xì)胞染色buffer、Ly6G 單克隆抗體、F4/80 單克隆抗體、CD11b單克隆抗體購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 在C57BL/6 小鼠腹腔內(nèi)注射甲苯噻嗪（4.5 mg/kg）和氯胺酮（90 mg/kg）進(jìn)行麻醉。麻醉后固定其四肢及口舌，進(jìn)行腹腔盲腸穿刺結(jié)扎術(shù)（CLP），引起腹腔感染，引發(fā)小鼠膿毒癥［12］。沿小鼠腹部中間位置切開2.5 cm，暴露盲腸，在近盲腸底部1/2 處用3/0 型號手術(shù)縫合線結(jié)扎，使用22 號針穿刺盲腸，擠出少量糞便，保證盲腸與腹腔相通，隨即將盲腸放回腹腔，確認(rèn)無糞便與切口接觸，逐層縫合切口，消毒，建立CLP 模型。皮下注射生理鹽水（5 ml/100 g）進(jìn)行復(fù)蘇。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為Sham 組、Control 組、CLP 組、Sham+CXCL16 組、Sham+PBS 組、CLP+CXCL16 組、CLP+PBS 組、CLP+Anti-CXCL16 組 和CLP+IgG 組，每 組20 只；CLP+CXCL16 組和CLP+PBS 組在完成CLP 后立即向小鼠腹腔內(nèi)分別注射CXCL16 重組蛋白0.5 μg 和等量PBS；CLP+Anti-CXCL16組和CLP+IgG 組在完成CLP后立即向小鼠腹腔內(nèi)分別注射CXCL16 抗體蛋白10 μg 和 等 量IgG 蛋 白；Sham 組 不 做 任 何 操 作；Control 組僅打開小鼠腹腔且不做CLP 處理；CLP 組按照手術(shù)步驟進(jìn)行CLP手術(shù)。

1.2.3 生存率實(shí)驗(yàn) 觀察CLP模型小鼠經(jīng)CXCL16重組蛋白、Anti-CXCL16 抗體蛋白和PBS 處理后的生存率。小鼠生存率實(shí)驗(yàn)完成于重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，保證各組小鼠生存環(huán)境溫度（20～26 ℃）、濕度（40%～70%）、光照及喂養(yǎng)條件相同，連續(xù)觀察14 d，每天觀察2次，記錄小鼠生存情況。

1.2.4 ELISA 檢測小鼠體內(nèi)CXCL16、IL-6、TNF-α和IFN-γ 表達(dá)量 血清樣本取自血液離心后上清液，腹腔灌洗液樣本取自5 ml PBS 反復(fù)沖洗3 次小鼠腹腔后的灌洗液，組織蛋白取自按照TRIzol 說明書提取的小鼠肝、肺、腎組織勻漿蛋白。ELISA 反應(yīng)孔中加入0.1 ml 的樣品，室溫孵育2 h，洗滌后加入0.1 ml 酶標(biāo)抗體，室溫孵育2 h。隨后，加底物液顯色，孵育30 min后，加入終止液，測定吸光值。

1.2.5 檢測小鼠血清生化指標(biāo) 收集小鼠血清樣本，檢測肝臟功能生化指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transami?nase，AST）；腎功能指標(biāo)尿素（Urea）、肌酐（Creati?nine）。血清樣本于采集后7 d 內(nèi)檢測，保證無溶血現(xiàn)象，按照儀器操作要求進(jìn)行檢測。

1.2.6 炎癥細(xì)胞檢測及流式細(xì)胞術(shù)分選炎癥細(xì)胞 收集小鼠腹腔灌洗液5 ml，1 500 r/min 離心5 min，PBS洗2次后重懸，臺盼藍(lán)排斥試驗(yàn)測定細(xì)胞存活率，用血液分析儀計數(shù)細(xì)胞數(shù)量。取500μl 腹腔灌洗液，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，1 ml 染色Buffer 重懸；1 500 r/min 離心5 min，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液300 μl，避光靜置3 min，加入等量PBS停止裂解，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，1 ml 染色Buffer 洗2 次后，加入1 ml 染色Buffer 重懸；重懸液分組，每組分別加入1 μl Fc 封閉抗體，依次加入CD11b 單克隆抗體、F4/80 單克隆抗體、Ly6G 單克隆抗體及同型對照后上機(jī)檢測。

1.2.7 HE 染色觀察組織的損傷情況和病理評分收取肝、肺、腎臟組織約200 g，4%甲醛固定，石蠟包埋，4μm 切片后用蘇木精和伊紅染色（HE），并由病理醫(yī)師使用BH2 Olympus 顯微鏡（Olympus）隨機(jī)分組分析。根據(jù)下列參數(shù)對肺進(jìn)行評分：支氣管炎、水腫、間質(zhì)炎癥、肺泡內(nèi)炎癥，以及肺表面匯合性炎癥浸潤的百分比，每個參數(shù)的等級從0（陰性）到4（嚴(yán)重）；根據(jù)下列參數(shù)對肝臟、腎臟進(jìn)行評分：血栓數(shù)量、膿腫數(shù)量、炎癥程度、壞死程度，每個參數(shù)的等級從0（陰性）到3（嚴(yán)重）。肺、肝臟、腎臟病理評分總和表示為所有參數(shù)的評分之和。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 分析采用GraphPad Prism 5.01版本完成（GraphPad Software，San Diego，CA）。組間比較采用Mann WhitneyU檢驗(yàn)，生存研究采用Kaplan Meier分析和Log-Rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 CXCL16 在小鼠膿毒癥中的表達(dá)情況 由圖1可知，Control 組和Sham 組小鼠中血清CXCL16 濃度表達(dá)正常且無顯著性差異，CLP 組小鼠血清中CXCL16 的表達(dá)水平顯著升高，提示CLP 模型構(gòu)建成功；與Control 組比較，腹腔灌洗液和肺、腎組織勻漿蛋白中，CLP 組的CXCL16 表達(dá)水平顯著升高。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 膿毒癥小鼠中CXCL16的表達(dá)水平Fig.1 Expressions of CXCL16 in spesis mice

2.2 CXCL16 對小鼠生存率的影響 由圖2 可知，PBS、CXCL16重組蛋白對Control組小鼠生存情況無影 響（P＜0.05）；與CLP+PBS 組 相 比，經(jīng)0.5 μg CXCL16 重組蛋白處理后的小鼠生存率顯著降低，追加CXCL16 重組蛋白劑量至1.0 μg 時，小鼠生存率進(jìn)一步降低。為保證標(biāo)本采集順利，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中CLP+CXCL16 組 均 采 用0.5 μg CXCL16 蛋 白 處理，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 CXCL16重組蛋白注射后膿毒癥小鼠的Kaplan-Meier曲線Fig.2 Kaplan-Meier curves of spesis mice after CXCL16 recombinant protein injection

2.3 CXCL16 對膿毒癥小鼠體內(nèi)炎癥細(xì)胞的影響由圖3可知，與CLP+PBS 組相比，CLP+CXCL16組腹腔灌洗液中的白細(xì)胞數(shù)量明顯增加，并且24 h 白細(xì)胞數(shù)量高于6 h，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。提示CXCL16 持續(xù)促進(jìn)炎癥細(xì)胞產(chǎn)生，主要由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞組成。

圖3 CXCL16對膿毒癥小鼠體內(nèi)炎癥細(xì)胞的影響Fig.3 Effects of CXCL16 on inflammatory cells in sepsis mice

2.4 CXCL16 對膿毒癥小鼠體內(nèi)相關(guān)炎癥因子的影響 由圖4 可知，與Control 組相比，CLP+PBS 組小鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ、IL-10 濃度升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；與CLP+PBS 組相比，CLP+CXCL16 組小鼠血清和腹腔灌洗液中IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ 表達(dá)水平顯著升高，IL-10 表達(dá)水平降低，提示CXCL16 進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子產(chǎn)生，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 CXCL16對膿毒癥小鼠血清中炎癥因子的影響Fig.4 Effects of CXCL16 on inflammatory cytokines in serum of sepsis mice

2.5 CXCL16 對膿毒癥小鼠肝肺腎組織損傷的影響 由圖5 可知，與Control 組相比，CLP+PBS 組肝、肺、腎臟組織損傷加重，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；與CLP+PBS 組比較，CLP+CXCL16 組肝、肺、腎臟組織損傷明顯加重，充血程度及炎癥浸潤程度顯著增加，正常組織輪廓減少，病理評分更高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.001）。

圖5 膿毒癥小鼠肝、肺、腎組織病理形態(tài)HE 及病理評分（×100）Fig.5 Pathological morphology of liver，lung and kidney in septic mice HE and pathological scores（×100）

2.6 CXCL16 對血清標(biāo)記物的影響 由圖6 可知，與Control 組相比，CLP+PBS 組血清肝腎功能指標(biāo)ALT，AST，Creatinine 和Urea 水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與CLP+PBS 組相比，CLP+CXCL16 組血清標(biāo)志物ALT、AST、Creatinine 和Urea含量顯著升高（P＜0.001），并且24 h 表達(dá)水平高于6 h，提示肝腎功能降低，損傷加重。

圖6 CXCL16對肝腎功能血清標(biāo)記物的影響Fig.6 Effects of CXCL16 on serum markers of liver and kidney function

2.7 Anti-CXCL16 抗體蛋白對膿毒癥小鼠的治療效果 由圖7 可知，與CLP+IgG 組相比，CLP+Anti-CXCL16 組生存率明顯升高，存活時間更長，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；組織損傷明顯減輕，充血及炎癥浸潤程度降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；血清標(biāo)志物ALT、LDH、Urea 表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖7 Anti-CXCL16 抗體蛋白對膿毒癥小鼠的影響Fig.7 Effects of anti-CXCL16 on sepsis mice

3 討論

膿毒癥是大多重癥監(jiān)護(hù)病房患者病死的重要原因。膿毒癥嚴(yán)重程度可分膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克，常見并發(fā)癥包括休克、急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能不全等。超過70%的膿毒癥患者的死亡發(fā)生在膿毒癥發(fā)病后的3 d，也有多數(shù)死亡發(fā)生在膿毒癥發(fā)病后的幾周，為了降低患者的病死率，膿毒癥早期的臨床檢測指標(biāo)尤為重要［13-14］。因此研究CX?CL16在膿毒癥中的表達(dá)水平及病理過程中的作用，鑒定有效可靠的膿毒癥早期標(biāo)志物及免疫治療新靶點(diǎn)具有重要意義。

趨化因子具有控制免疫細(xì)胞的遷移模式和定位能力，對免疫細(xì)胞發(fā)育和穩(wěn)態(tài)所需的細(xì)胞遷移、原發(fā)性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的產(chǎn)生、病理過程中免疫細(xì)胞的招募至關(guān)重要［15］。CXCL16 作為趨化因子家族中的一員，早期發(fā)現(xiàn)于免疫細(xì)胞中，是急性炎癥的重要遞質(zhì)［16-17］。本研究證實(shí)，CXCL16 在膿毒癥小鼠中表達(dá)水平顯著上調(diào)：全身循環(huán)（血清）和感染局部（腹腔灌洗液和肝、肺、腎組織蛋白），通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)加重小鼠組織損傷乃至加速死亡。既往研究表明，CXCL16 在腎組織損傷的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，CXCL16 可通過CXCL16/ROCK1 信號通路加重缺血-再灌注所致的急性腎損傷［18］。本研究結(jié)果顯示，在CXCL16 重組蛋白處理后，膿毒癥小鼠肝、肺、腎組織損傷加重，充血及炎癥浸潤程度增高，與之相應(yīng)的肝腎功能的血清標(biāo)記物表達(dá)量升高。更有相關(guān)研究表明，TNF-α 和INF-γ 能夠刺激CXCL16 的分泌，INF-γ 具有增強(qiáng)誘導(dǎo)CXCL16 的產(chǎn)生的能力［19］。本次研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CXCL16 重組蛋白處理后的小鼠腹腔灌洗中，白細(xì)胞數(shù)目大量增多，其中中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞顯著增多，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可以通過分泌炎癥因子等途徑促進(jìn)加重小鼠炎癥反應(yīng)。

多個對膿毒癥治療的臨床藥物試驗(yàn)失敗的一部分原因是患者對膿毒癥的反應(yīng)具有異質(zhì)性，目前除了支持性護(hù)理和對癥治療，還沒有能夠治療人類敗血癥的特定藥物［20］。因此，對膿毒癥治療的研究方向?qū)⒅匦玛P(guān)注于潛在的先天和適應(yīng)性免疫紊亂，以促進(jìn)膿毒癥的恢復(fù)和生存［21-22］。早期有相關(guān)研究表明，在結(jié)腸炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，給予抗CXCL16 抗體可改善結(jié)腸炎癥反應(yīng)［23］。與本次實(shí)驗(yàn)相符的是，經(jīng)過Anti-CXCL16 抗體蛋白治療后，膿毒癥小鼠生存時間延長，病死率降低，病理結(jié)果顯示肝、肺、腎組織損傷減輕，肝腎功能標(biāo)記物降低。有研究表明，目前對膿毒癥的治療研究主要集中在免疫調(diào)節(jié)治療上，主要為逆轉(zhuǎn)持續(xù)的免疫細(xì)胞功能障礙，這種免疫細(xì)胞功能障礙在急性膿毒癥與病死率密切相關(guān)［24］。

綜上所述，本文通過CLP 誘導(dǎo)小鼠模擬膿毒癥形成，結(jié)果顯示CXCL16 在膿毒癥小鼠的血清、腹腔灌洗液及肝、肺、腎組織蛋白中顯著高表達(dá)，小鼠生存率降低，加重了肝、肺、腎臟組織損傷，其作用機(jī)制可能為CXCL16 促進(jìn)小鼠體內(nèi)炎癥細(xì)胞的產(chǎn)生和增加相關(guān)炎癥因子的表達(dá)水平。同時Anti-CXCL16抗體蛋白具有一定的保護(hù)作用，降低病死率及組織損傷，為膿毒癥免疫治療提供新思路。本研究在動物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上可開展臨床實(shí)驗(yàn)，對人類膿毒癥中CXCL16 的表達(dá)、相關(guān)影響和作用機(jī)制做進(jìn)一步研究。