賈盼紅 熊曉嫚 李 琪 周向東③ 唐歡歡 王 杰

（海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸內科，?？?570102）

細菌內毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）能夠誘導氣道上皮細胞、巨噬細胞等細胞產生大量炎癥因子（IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α）的分泌，形成“炎癥瀑布”，進而損傷機體［1-2］。目前針對“炎癥瀑布”的治療，除了使用皮質醇激素外，中醫(yī)藥對抑制炎癥瀑布效應也具有獨特的效果。本課題組前期發(fā)現苦味類中藥可抑制炎癥因子釋放［3］，地膽頭（Ele?phantopus scaber Linn）是長江以南常用的民間中藥，味苦，具有清熱解毒、利尿消腫、抑菌等功效［4］。在本課題組前期實驗及臨床觀察中已證實地膽頭能夠有效抑制社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）的炎癥因子釋放，有效改善CAP 癥狀，縮短治療時間［5］。

Apelin 是近年來發(fā)現的一種肽類激素，是G 蛋白偶聯受體APJ（apelin receptor）的內源性配體［6-7］。Apelin 通過減少線粒體ROS 觸發(fā)的氧化損傷、線粒體介導的細胞凋亡以及由NF-κB 和NLRP3 炎癥小體激活所誘導的炎癥反應來預防LPS誘導的急性肺損傷（acute lung injury，ALI）［8］。因此，Apelin 對LPS誘導的ALI/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）有保護作用。然而，迄今為止，Apelin/APJ 在人體肺組織及支氣管上皮細胞中的表達定位以及調控尚未得到研究。此外，地膽頭對Apelin/APJ 的作用，以及地膽頭發(fā)揮抗炎作用是否與Apelin/APJ 相關，目前也無相關研究。因此，本研究采用人支氣管上皮細胞急性細胞肺損傷模型，觀察Apelin/APJ定位表達，探討外源性Apelin-13治療對支氣管上皮細胞炎癥因子的影響。另外，本研究用地膽頭干預LPS 致急性肺損傷細胞模型，探討地膽頭對急性肺損傷治療作用以及對Apelin/APJ的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 人支氣管上皮細胞16HBE 購自上海弘順生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基（武漢普諾賽公司）；胎牛血清（上海YEASEN）；RIPA 裂解液、TEMED、Western 封閉液、PVDF 膜（0.22μm）、PVDF浸潤活化泡液、ECL免疫印跡化學發(fā)光試劑（上海碧云天生物技術有限公司）；CCK8試劑盒、脂多糖LPS（biosharp 公 司）；Human IL-1β Quantikine ELISA Kit、Human IL-6 Quantikine ELISA Kit、Human TNF-α Quantikine ELISA Kit（上海酶聯）；Apelin、APJ 一抗、Anti-GAPDH 抗體、HRP 標記的山羊抗小鼠抗體（美國Abcam 公司）；SureScriptTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit、ALL-in-oneTMqPCR Primer（中國易錦生物有限公司）。

1.1.3 主要儀器與設備 恒溫水浴箱（蘇州安泰空氣技術有限公司）；酶標儀（SynergyHTX 公司，美國）；全自動化學發(fā)光圖像分析系統（中國天能公司）；Mx3OO5P 實時熒光定量PCR 儀（Stratagene 公司，美國）；10 cm 細胞培養(yǎng)皿、6 孔板、12 孔板、96 孔板、200 μl PCR 管、無RNA 酶的吸頭（Axygen 公司，美國）；共聚焦激光顯微鏡（FV1000）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、傳代、凍存及復蘇 16HBE 細胞用DMEM 高糖培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，置于5%CO2和37 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48 h 后換液，細胞融合至70%～80%時，終止消化，按1∶3的比例接種到培養(yǎng)皿中進行傳代培養(yǎng)或接種到孔板中提取16HBE 細胞培養(yǎng)上清液、總蛋白及RNA繼續(xù)后續(xù)實驗。

1.2.2 地膽頭提取液制備 地膽頭采集于海南省儋州市那大鎮(zhèn)城郊，經海南醫(yī)學院科學實驗中心易國輝研究員鑒定為菊科類地膽頭草，取地膽頭粉480 g，用95%乙醇熱回流旋轉蒸發(fā)共得22 g 浸膏，提取率4.5%。取地膽頭浸膏10 mg，使用DMSO 50μl溶解，超聲振蕩1 h，使浸膏完全溶解，用9.5 ml完全培養(yǎng)基配制地膽頭母液濃度為1 mg/ml。再分別配制20、40、80μg/ml地膽頭液。

1.2.3 實驗分組及給藥 實驗分6 組（n=8）：正常對照組（陰性對照組），模型組（LPS組，10μg/ml），陽性對照組（LPS+Apelin-13 組，1 μmol/L），低、中、高地膽頭組［LPS+ESE（20μg/ml）組、LPS+ESE（40μg/ml）組、LPS+ESE（80μg/ml）組］。

1.2.4 CCK8 測細胞活力 將細胞按照5×104個/孔（100 μl）接種于96 孔板，設6 組，培養(yǎng)24 h 后將20、40、80μg/ml地膽頭提取液及Apelin-13（1μmol/L）各20μl 分別加入對應組，設4 個復孔，培養(yǎng)箱孵育3 h，將20 μl 10 μg/ml LPS 分別加入LPS 組、20、40、80μg/ml 地膽頭組及Apelin-13 組，再次放入培養(yǎng)箱孵育16 h，每組每孔各加CCK8 10 μl，2 h 后酶標儀下測吸光度，設置450 nm，重復3次。按以下公式計算細胞活力：細胞活力（%）=實驗組OD 值/空白組OD值×100%。

1.2.5 細胞免疫熒光、激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內Apelin/APJ 蛋白表達定位情況 細胞分組同

1.2.3 培養(yǎng)細胞密度達到80%時，棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定細胞10 min。吸干殘留液，滴加山羊血清工作液在室溫孵育1 h。棄血清，再加入兔抗多克隆抗體（1∶100）過夜。第2 天取出用PBS 清洗，加入FITC山羊抗兔二抗。避光37 ℃孵育1 h。各組均加入DAPI。用抗熒光減滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡下采集分析圖像。

1.2.6 ELISA 檢測細胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α的含量 細胞分組同1.2.3，將20、40、80 μg/ml 地膽頭提取液及Apelin-13（1 μmol/L）各20μl 加入對應組，培養(yǎng)箱孵育3 h，將10μg/ml 20μl LPS 分別加入LPS 組、20、40、80 μg/ml 地膽頭組及Apelin-13組，再次放入培養(yǎng)箱孵育16 h。嚴格按照其說明書操作，450 nm波長處測OD值。

1.2.7 Western blot 法檢測Apelin、APJ 蛋白表達細胞分組及藥物干預分別同1.2.3和1.2.6。每孔加RIPA 裂解液，細胞刮刮取細胞。4 ℃12 000 r/min離心。取上清液。采用BCA 法測定蛋白濃度。煮沸法使蛋白質變性。配制SDS-PAGE 凝膠。經SDS-PAGE 電泳分離，切膠、轉膜，室溫下在搖床上脫脂奶粉封閉液封閉2 h，PBST 洗滌，4 ℃孵育一抗12 h，二抗液室溫孵育2 h。天能系統曝光捕獲圖片，Image J分析條帶灰度值。

1.2.8 RT-PCR 檢測Apelin、APJ mRNA 水平 按1.2.3進行細胞分組，PBS清洗貼壁細胞后加入裂解液，使RNA 充分溶解。藥物干預同1.2.6，采用Sim?ply P 總RNA 提取試劑盒提取RNA。按SureScriptTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒說明書逆轉錄成cDNA。按照All-in-oneTMqPCR Primer 試劑盒說明書進行PCR擴增反應，實驗重復3次，并設置空白對照組，保證各復孔之間的Ct值差異不超過1，引物購自GeneCopoeiaTM公司。根據2-ΔΔCt法分析目的基因的表達情況，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。

1.3 統計學分析 每組實驗重復3次，統計分析用Graphpad prism8 軟件進行。應用SPSS22.0 軟件進行單因素方差分析。蛋白灰度值分析采用Image J軟件。計量資料數據均采用±s表示，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Apelin/APJ 蛋白在氣道上皮細胞及炎癥損傷模型表達、定位 在正常對照組中，Apelin/APJ 表達于細胞膜，在給予LPS刺激時，細胞膜Apelin/APJ熒光強度明顯變亮。而后給予地膽頭提取液（20μg/ml）刺激細胞時，細胞膜Apelin/APJ 蛋白表達量明顯增多，提示Apelin/APJ 系統在急性炎癥損傷期間被激活，參與急性炎癥損傷調節(jié)（圖1）。

圖1 Apelin/APJ 蛋白在氣道上皮細胞及炎癥損傷模型表達、定位Fig.1 Expression and localization of Apelin/APJ protein in airway epithelial cells and inflammatory injury model

2.2 Apelin-13 及地膽頭提取物對氣道上皮細胞細胞活力的影響 與正常對照組比較，LPS 誘導后細胞活力明顯下降（P＜0.05）；與LPS組對比，Apelin-13干預后氣道上皮細胞活力明顯增高（P＜0.05）。地膽頭干預后氣道上皮細胞活力明顯提高，且濃度越高細胞活力增高越明顯（P＜0.05）。見圖2。

圖2 Apelin-13 及地膽頭提取物對氣道上皮細胞細胞活力的影響Fig.2 Effects of Apelin-13 and extract of Elephantopus scaber Linn on viability of airway epithelial cells

2.3 Apelin-13 及地膽頭提取物對氣道上皮細胞炎癥因子表達的影響 實驗結果顯示：與正常對照組相比，LPS 模型組IL-1β、IL-6、TNF-α 分泌顯著增加（P＜0.05）；與LPS 組對比，地膽頭干預后氣道上皮細胞IL-1β、IL-6、TNF-α 分泌明顯減少（P＜0.05），且濃度越高分泌越減少，80 μg/ml 地膽頭抑制炎癥因子釋放優(yōu)于Apelin-13組（P＜0.05）。見表1。

表1 地膽頭對IL-1β、IL-6、TNF-α的影響（±s，n=8，pg/ml）Tab.1 Effects of elephantopus scaber linn on IL-1β，IL-6，TNF-α（±s，n=8，pg/ml）

表1 地膽頭對IL-1β、IL-6、TNF-α的影響（±s，n=8，pg/ml）Tab.1 Effects of elephantopus scaber linn on IL-1β，IL-6，TNF-α（±s，n=8，pg/ml）

Note：Compared with negative control group，1）P＜0.05；compared with LPS group，2）P＜0.05；compared with LPS+Apelin-13，3）P＜0.05.

TNF-α 24.50±1.90 67.30±2.501）36.80±2.702）40.20±1.402）36.90±1.702）30.20±2.302）3）Groups Negative control LPS（10μg/ml）LPS＋Apelin-13（1μmol/L）LPS＋ESE（20μg/ml）LPS＋ESE（40μg/ml）LPS＋ESE（80μg/ml）IL-1β 62.23±7.60 96.37±8.501）79.43±6.402）83.62±5.702）78.32±8.202）69.65±6.702）3）IL-6 3.52±0.11 5.08±0.221）3.74±0.322）4.03±0.272）3.76±0.552）3.57±0.182）3）

2.4 地膽頭提取物對Apelin/APJ mRNA 轉錄的影響 與正常對照組相比，LPS（10 μg/ml）可使細胞Apelin/APJ mRNA 轉錄增高（P＜0.05）；與LPS 組相比，給予Apelin-13、地膽頭干預后Apelin/APJ 的mRNA 轉錄水平進一步增高（P＜0.05）。結果表明，LPS 可使Apelin/APJ 轉錄上調，Apelin-13、地膽頭可進一步刺激氣道上皮細胞Apelin/APJ轉錄（圖3）。

圖3 地膽頭提取物對Apelin/APJ mRNA 轉錄的影響Fig.3 Effects of extract from Elephantopus scaber Linn on Apelin/APJ mRNA transcription

2.5 地膽頭提取物對Apelin/APJ蛋白表達的影響與正常對照組相比，LPS（10μg/ml）可使支氣管上皮細胞Apelin/APJ 表達增高（P＜0.05）；與LPS組相比，給予Apelin-13、地膽頭干預后Apelin/APJ 的表達水平進一步增高（P＜0.05）。結果表明：LPS 可使Apelin/APJ 表達上調，Apelin-13、地膽頭可進一步刺激支氣管上皮細胞Apelin/APJ表達（圖4）。

圖4 地膽頭提取物對Apelin/APJ蛋白表達的影響Fig.4 Effects of extract from Elephantopus scaber Linn on Apelin/APJ protein expression

3 討論

感染性疾病是臨床常見病，呼吸系感染性疾病尤為常見，呼吸系感染性疾病直接參與其他多種呼吸系疾病的進展、惡化，是造成全球患者發(fā)病及死亡的主要原因［9］。感染性疾病中生物因素最為常見，細菌內毒素（LPS）可誘導氣道上皮細胞、巨噬細胞等細胞炎癥因子（IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α）的分泌、釋放，引起ALI“炎癥風暴”。臨床上針對“炎癥風暴”炎癥因子釋放的藥物是糖皮質激素，雖然激素對抑制炎癥因子釋放效果明顯，但較多患者存在激素抵抗，高劑量糖皮質激素增加患者股骨頭壞死發(fā)病率，因此臨床上針對呼吸系統感染性疾病治療急需新的治療靶點和策略［10］。另外在介導肺部炎癥和損傷的機制及途徑等方面已被廣泛研究，但關于預防肺部感染和損傷的機制及途徑研究較少，很少有內源性抗肺損傷機制的報道［11-12］。

本實驗通過培養(yǎng)支氣管上皮細胞及LPS構建急性肺損傷細胞模型，首先以細胞免疫熒光法激光共聚焦技術觀察各組細胞胞內Apelin/APJ 分布，闡明Apelin/APJ 蛋白為支氣管上皮細胞膜上表達。LPS刺激使支氣管上皮細胞Apelin/APJ 膜蛋白表達量明顯增多，提示Apelin/APJ 系統在ALI 期間被激活。其次，ELISA 檢測不同分組的細胞炎癥因子釋放水平，結果顯示LPS 使細胞炎癥因子表達明顯增多，Apelin-13 及不同濃度梯度地膽頭組藥物干預組IL-1β、IL-6、TNF-α 明顯下降，提示Apelin-13 及地膽頭可抑制IL-1β、IL-6、TNF-α 炎癥因子釋放，抑制炎癥損傷。采用Western blot 法明確了Apelin-13 及不同濃度梯度地膽頭組藥物干預細胞中Apelin/APJ表達量相較于對照組及LPS組增高，再次提示Apelin/APJ參與急性肺損傷調控。利用qPCR 檢測細胞Apelin/APJ 轉錄水平，結果提示Apelin/APJ 系統在急性炎癥損傷期間被激活，參與急性炎癥損傷調節(jié)。驗證了該通路可以抵消炎癥和損傷反應，防止失控的肺損傷。同時也提出中草藥地膽頭抗炎作用與Ape?lin/APJ 通路相關，與Apelin-13 陽性對照組有類似作用。

雖然Apelin-APJ 途徑是ALI 保護機制，但Ape?lin 較短的血漿半衰期限制目前的研究應用于臨床治療。長效APJ 受體激動劑的開發(fā)將克服這一局限。中草藥毒副作用相對較少，能夠從多種途徑發(fā)揮抗炎性，在新藥研發(fā)領域一直備受關注［13-14］。本課題組研究證實地膽頭可有效抑制社區(qū)獲得性肺炎炎癥因子釋放，有效減少患者住院時間，減輕癥狀，同時也證實地膽頭能夠顯著增加AECOPD 治療效果，增強抗氧化能力，明顯改善肺功能。地膽頭抑制炎癥因子釋放。機制可能與TLR4/NF-κB 通路相關［15］。目前關于中草藥抗炎作用的研究，較少涉及分子水平層面上。然而中草藥具有多種有效成分，往往具有多靶點抗炎性，造成研究者及醫(yī)務工作者對大多數中草藥抗炎作用的具體分子機制了解不夠深入及全面，至今發(fā)表從基因水平研究中草藥抗炎作用的報道也不多，以致嚴重阻礙了中草藥在世界范圍內的推廣及臨床應用［16］。因此運用現代科學方法研究傳統中草藥的抗炎機制是發(fā)展宏大中醫(yī)藥的必經之路，探尋中草藥抗炎新靶點分子機制，尋找抗炎性強且毒副作用低的抗炎中草藥為大勢所趨［17］。