畢方方

（廣西大學(xué)行健文理學(xué)院，廣西南寧 530005）

瘦素（Leptin）可以提高機(jī)體能量代謝效率、增加能量消耗，同時(shí)降低動(dòng)物的食欲、減少體內(nèi)脂肪沉積，從而減輕體重[1]。Leptin可以直接作用于脂肪組織增強(qiáng)脂肪的代謝，消耗脂肪儲(chǔ)備，也直接通過下丘腦調(diào)控動(dòng)物采食量。瘦素是通過其受體（Lepr）發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。Tartaglia等[2]首先發(fā)現(xiàn)Leptin受體(OB-R)是在小鼠脈絡(luò)叢內(nèi)，長度約5.1 kb的單個(gè)帶狀OB-RmRNA。小鼠的OB-R由894個(gè)氨基酸殘基組成，是一種跨膜受體，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞漿區(qū)三部分組成[3]。 Kielar等用分子生物學(xué)方法檢測到OB-R mRNA在人和嚙齒動(dòng)物的腦、心、胎盤、肝、腎、胰、脾、肌肉、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸、腎上腺中均有表達(dá)。目前，尚未有研究廣西沼澤型水牛Lepr 基因表達(dá)與其生殖功能的相關(guān)性的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過對廣西沼澤型水牛Lepr 基因序列進(jìn)行克隆，并運(yùn)用Lasergene軟件比對水牛與其他物種的差異，為今后進(jìn)一步的研究提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來自于南寧肉聯(lián)廠屠宰的水牛，成年健康且雌雄不限。選取其背部肌肉做樣品，將采集到的樣品放入凍存管，于-80℃保存，備用。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備

TRIzol LS? Regent RNA提取試劑盒購自Invitrogen 公司（美國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶、pMD18-T載體以及DNA marker購自Takara生物公司（日本）；質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購于博日（杭州）；UV-1601型紫外分光光度計(jì)購自BioRad公司；175S/00771型凝膠成像分析系統(tǒng)；TD-20/20型熒光光度計(jì)購自TURNER DESIGN公司。

1.3 總RNA的提取及cDNA合成

從某屠宰場獲取本地水牛背部肌肉，放入1 ml的玻璃勻漿器，并加入液氮水研磨成勻漿，參照Trizol法提取總RNA。DNA 酶處理后1%瓊脂糖凝膠電泳檢測核糖體 RNA28S 和18S條帶的完整性（紫外分光光度計(jì)測定波長260 nm 和280 nm 處的OD值1.8～2.0）。經(jīng)RNA純度和完整性檢測符合試驗(yàn)要求后進(jìn)行 cDNA合成。以提取的總 RNA為模板，加入抑制劑RNase Inhibitor、Oligo(dT)18 Primer底 物、M-MVL Reverse Transcriptase、dNTP Mixture，42℃ 30 min，95℃ 5 min，5℃ 5 min反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.4 lepr基因的克隆擴(kuò)增

根據(jù) NCBI中GenBank報(bào)道的水牛Leptin基因序列，設(shè)計(jì)1對特異性引物，并將序列送大連TaKara公司進(jìn)行合成。上游引物5'－GTTGAAACTAAGCTTAATTC－3'，下游引物5'－TGGTGGATGAGGCCTTCACTT－3'，所擴(kuò)增目的片段大小約為522 bp。PCR反應(yīng)體系（20 μl）:10×taqDNA聚合酶Buffer 5 μl，taqDNA聚合酶1μl，cDNA 2 μl，dNTPmix(10 mmol/L) 2 μl，上下游引物各1 μl，ddH2O 8 μl。

PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3 min后， 95℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸40 s，循環(huán)30次，最后72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳后，用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并初步鑒定。確定目的條帶與預(yù)期一致后，利用DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物回收后與pMD18-T載體連接， 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀均勻涂布于LB/平板上，倒置平皿于37℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性單菌落于含有Amp+的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。鑒定結(jié)果呈陽性的菌株送上海生工生物科技有限公司測序。

1.5 生物信息學(xué)分析

分別使用NCBI blast程序和生物軟件Lasergene 7.0對Lepr基因CDS序列進(jìn)行分子生物學(xué)分析，并與GenBank中高同源性動(dòng)物的Lepr基因CDS序列進(jìn)行比較，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣西沼澤型水牛Lepr基因PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增電泳后，在500 bp處附近擴(kuò)增出一條明顯的單一條帶，它與預(yù)期估計(jì)值522 bp接近（圖1），可初步推斷獲得廣西沼澤型水牛leptin基因片段。

圖1 廣西沼澤型水牛Lepr基因PCR擴(kuò)增

2.2 廣西沼澤型水牛Lepr編碼區(qū)核苷酸序列及氨基酸序列分析

測序結(jié)果顯示，基因編碼區(qū)序列長度為522 bp，該核苷酸序列與GenBank中水牛的lepr基因(KU508424)編碼區(qū)序列的同源性達(dá)99.8%，此外，序列分析發(fā)現(xiàn)，廣西沼澤型水牛lepr基因序列與報(bào)道中水牛的相比，在第310位發(fā)生堿基突變，但為無意義突變。用MegAlign程序比對廣西沼澤型水牛Lepr基因序列與豬、野牛、黃牛、馬鹿、綿羊等物種，其序列同源性分別為90.8%、92.6%、92.9%、96.2%、96.1%（圖2），其氨基酸序列同源性分別為88.6%、89.9%、97.4%、95.3%、94.4%（圖3）。

圖2 廣西沼澤型水牛Lepr基因 CDS 序列與其他物種同源性分析

圖3 廣西沼澤型水牛Lepr蛋白氨基酸序列與其他物種同源性分析

用MegAlign程序中Phylogenetic tree對測序所得的廣西沼澤型水牛lepr基因核苷酸序列與GenBank發(fā)表的其他動(dòng)物序列進(jìn)行親緣分析，結(jié)果表明，黃牛、野牛牛與廣西沼澤型水牛親緣關(guān)系最接近，與綿羊、馬鹿、豬親緣關(guān)系依次變遠(yuǎn)，與傳統(tǒng)生物分類學(xué)規(guī)律基本保持一致（圖4）。

圖4 廣西沼澤型水牛lepr基因與其他動(dòng)物的進(jìn)化樹

3 討論

近年來，隨著Leptin基因的功能研究在脂肪代謝、生殖調(diào)控、腫瘤、營養(yǎng)代謝病等發(fā)面的應(yīng)用，對其受體分布、基因多樣性的研究也快速發(fā)展，特別是 Leptin在畜牧生產(chǎn)中生殖調(diào)控方面的研究，有助于提高家畜的生產(chǎn)性能，提高經(jīng)濟(jì)效益。Yu等研究發(fā)現(xiàn)垂體中促性腺激素的分泌是可以通過Leptin的調(diào)控促性腺激素釋放激素（GnRH）的表達(dá)來調(diào)控的，如ob/ob小鼠由于體內(nèi)Leptin表達(dá)量不足，促性腺激素分泌減少或其功能損傷，表現(xiàn)為生殖器官萎縮和小鼠不育[4]。ob/ob小鼠的生殖功能的恢復(fù)可以通過注射外源Leptin來實(shí)現(xiàn)，進(jìn)一步證明leptin對動(dòng)物生殖有調(diào)控作用。同時(shí)Leptin還可以刺激垂體和卵巢分泌LH、PRL和FSH。

有些文獻(xiàn)報(bào)道，Leptin對生殖有一定得作用，尤其是在胎盤生理發(fā)育過程中。在妊娠過程中，Leptin濃度會(huì)有所升高，在妊娠的第3個(gè)月和妊娠后期Leptin會(huì)達(dá)到2個(gè)峰值，母體分娩后24 h，血漿中Leptin值將會(huì)下降到正常值[5]。lepr在卵巢或睪丸中有大量表達(dá)，這表明Leptin可對卵巢和睪丸的功能進(jìn)行調(diào)控。分析既往研究發(fā)現(xiàn)，Leptin（100 ng/ml）對水牛卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡有抑制作用，由于滋養(yǎng)層細(xì)胞可以局部產(chǎn)生Leptin，在胎盤周邊Leptin激素的有效濃度會(huì)增大，當(dāng)滋養(yǎng)層細(xì)胞中Leptin的表達(dá)受到抑制時(shí)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這種現(xiàn)象可以通過添加外源Leptin得到恢復(fù)。

綜上所述，Leptin和lepr基因與水牛的生殖調(diào)控有密切的關(guān)系。本試驗(yàn)成功克隆了廣西沼澤型水牛Lepr 基因編碼序列，對水牛Lepr基因的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行了比對，為進(jìn)一步研究水牛Lepr基因的功能、多樣性及表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。