趙 沙 顏子娟 張 舒 余俊紅 吳秀蕓1，** 王祿山

（1）山東大學微生物技術(shù)國家重點實驗室，青島 266237；2）青島啤酒股份有限公司啤酒生物發(fā)酵工程國家重點實驗室，青島 266000）

幾丁質(zhì)是自然界廣泛存在的生物多糖之一，由N-乙酰-D-氨基葡萄糖（GlcNAc）經(jīng)β-1,4-糖苷鍵連接聚合而成。幾丁質(zhì)作為結(jié)構(gòu)多糖，存在于許多生物細胞外基質(zhì)中，包括真菌細胞壁、昆蟲外骨骼、甲殼類外殼和線蟲卵殼等［1］。幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)與纖維素類似，由單一單體聚合形成線型鏈狀結(jié)構(gòu)，相鄰兩個單體反向呈180°排列（圖1a）。幾丁質(zhì)鏈通過分子內(nèi)和分子間的氫鍵網(wǎng)絡形成高度結(jié)晶的幾丁質(zhì)，構(gòu)成抗降解屏障。根據(jù)幾丁質(zhì)鏈的方向差異可以分為α 型、β 型及γ 型幾丁質(zhì)［2］。不同于纖維素，幾丁質(zhì)的抗降解屏障不僅表現(xiàn)在高度結(jié)晶的整體結(jié)構(gòu)［3］，還表現(xiàn)在N-氨基乙?；潭龋╠egree of acetylation， DA） 和 糖 單 元 的 聚 合 程 度（degree of polymerization，DP）兩個方面［2］。幾丁質(zhì)是重要的生物質(zhì)資源，其降解產(chǎn)物GlcNAc和幾丁質(zhì)寡糖（chitin-oligosaccharide，CHOS）具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤等多種特異性生物活性，被廣泛應用于農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)和醫(yī)藥領域［4-6］。

利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)高附加值產(chǎn)物主要有化學法和生物酶法兩種方法。化學法需要使用高濃度的HCl或H2SO4，易造成危險和環(huán)境污染，生物酶法具有綠色、快速的特點，可以形成環(huán)境友好和生物相容的產(chǎn)物［7］。幾丁質(zhì)酶（EC 3.2.1.14）特異性水解幾丁質(zhì)糖苷鍵產(chǎn)生低聚寡糖。自然界中，幾丁質(zhì)酶廣泛分布在古菌、細菌、真菌、高等植物及動物中［1］，其中，細菌幾丁質(zhì)酶由于產(chǎn)生的豐度和商業(yè)潛能一直是研究的熱點。細菌中幾丁質(zhì)降解酶基因存在明顯的基因擴增及多結(jié)構(gòu)域組合現(xiàn)象，并且不同家族、不同作用模式的幾丁質(zhì)酶系可以協(xié)同參與幾丁質(zhì)的高效降解［8］，對生態(tài)系統(tǒng)碳氮比的平衡起著至關重要的作用［9］。因此，充分認識細菌幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)功能、降解模式及分子設計策略，對于高效生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，推動低品質(zhì)生物質(zhì)原料的綠色轉(zhuǎn)化技術(shù)的快速發(fā)展具有重要意義。

Fig.1 Structure of chitin and chitinase圖1 幾丁質(zhì)與幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)示意圖

1 細菌幾丁質(zhì)酶的分類與結(jié)構(gòu)特點

在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫CAZy （http://www.cazy.org/）中，幾丁質(zhì)酶基于序列相似性主要被歸類為GH18和GH19家族。其中，GH18家族幾丁質(zhì)酶廣泛分布在古菌、細菌、真菌、高等植物及動物中，而GH19 家族幾丁質(zhì)酶主要分布于植物中，細菌中分布較少，且細菌中的GH19家族幾丁質(zhì)酶由植物幾丁質(zhì)酶進行基因水平轉(zhuǎn)移產(chǎn)生［10］。截至2021年7月，GH18家族中被表征的細菌幾丁質(zhì)酶序列有192條，結(jié)晶結(jié)構(gòu)有22個，而GH19家族被表征的細菌幾丁質(zhì)酶有15條序列，其中2個獲得晶體并解析結(jié)構(gòu)，分別為來源于天藍鏈霉菌A3（2）（Streptomyces coelicolor A3（2））的Chi19G（PDB ⅠD 2CJL） 和 灰 色 鏈 霉 菌HUT 6037（Streptomyces griseus HUT 6037） 的ChiC （PDBⅠD 1WⅤU）。

幾丁質(zhì)酶一般由多個結(jié)構(gòu)域組成，包括催化結(jié)構(gòu)域（CD）、碳水化合物結(jié)合模塊（CBM）和/或Ⅲ型纖維連接蛋白（FnⅢ）等底物輔助結(jié)合結(jié)構(gòu)域（圖1b）。GH18 家族幾丁質(zhì)酶催化結(jié)構(gòu)域較為保守，為經(jīng)典的（β/α）8TⅠM 桶結(jié)構(gòu)，由8 個α 螺旋和8個β折疊經(jīng)無規(guī)則卷曲（Loop）組成，催化裂隙位于桶結(jié)構(gòu)的上方。GH18家族幾丁質(zhì)酶根據(jù)序列和結(jié)構(gòu)特征又可被分為A、B、C 3 個亞家族。其中，Sub A 幾丁質(zhì)酶在Loop7 上具有（α+β）插入結(jié)構(gòu)域（CⅠD），而Sub B和Sub C幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)則不存在插入結(jié)構(gòu)域，Sub B 在Loop6 上存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)［11］。GH19家族幾丁質(zhì)酶的催化結(jié)構(gòu)域高度螺旋化，其底物結(jié)合裂隙相對較淺。有研究表明，GH18家族幾丁質(zhì)酶在催化裂隙中存在保守的催化序列DxDxE，其中，SubA 亞家族結(jié)構(gòu)域CⅠD 中存在兩個相對保守的序列YxR 與［E/D］xx［Ⅴ/Ⅰ］，能夠參與底物的結(jié)合和催化［12］。而GH19 家族幾丁質(zhì)酶催化中心具有一個相對保守的序列［FHY］-G-R-G-［AP］-x-Q-［ⅠL］-［ST］-［FHYW］-［HN］-［FY］-NY，并以兩個Glu作為催化殘基（質(zhì)子酸與質(zhì)子堿），二者結(jié)合可以作為GH19 家族幾丁質(zhì)酶識別的標志［10］。GH18 家族與GH19 家族保守結(jié)構(gòu)的不同可能直接導致其作用機制的差異［13］。

2 細菌幾丁質(zhì)酶的作用機制

GH18 家族幾丁質(zhì)酶為底物輔助保留型催化斷鍵 機 制 （substrate-assisted retaining catalytic mechanism），而GH19家族幾丁質(zhì)酶為單一置換反轉(zhuǎn)型催化機制（single displacement inversion mechanism）。另外幾丁質(zhì)酶按照其作用模式分為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶和外切幾丁質(zhì)酶。前者可以隨意切割聚合物的鏈內(nèi)糖苷鍵生產(chǎn)寡糖，而后者只能從幾丁質(zhì)聚合物末端逐漸降解生成單體或二聚體［14］。GH18家族幾丁質(zhì)酶又可分為持續(xù)性幾丁質(zhì)酶和非持續(xù)性幾丁質(zhì)酶。持續(xù)性幾丁質(zhì)酶能夠沿著底物糖鏈滑動，并在每次催化發(fā)生后不脫離幾丁質(zhì)鏈而進行持續(xù)水解［15］，有效降解結(jié)晶幾丁質(zhì)。持續(xù)性幾丁質(zhì)酶多為外切幾丁質(zhì)酶，但也有例外，如人殼丙糖苷酶（human chitotriosidase，HCHT）是以持續(xù)性為降解模式的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶［16］。

2.1 酶與底物結(jié)合

不同幾丁質(zhì)酶底物結(jié)合裂隙的形狀和組成不同（圖2a）。GH18家族幾丁質(zhì)酶存在長且深的底物結(jié)合裂隙，至少包含5 個底物結(jié)合亞位點（Sub C 亞家族），Sub B 亞家族Loop 的差異使得活性亞位點增為7 個，Sub A 亞家族CⅠD 結(jié)構(gòu)域的插入更加拓寬了酶分子與底物的結(jié)合裂隙，使亞位點擴展為8個。并且不同亞家族活性架構(gòu)氨基酸的保守度明顯不同，其中Sub A（PDB ⅠD 1EHN）亞家族的保守度最高，絕對保守氨基酸在-6 到+2 亞位點都有分布，Sub B（PDB ⅠD 4AXN）與Sub C（PDB ⅠD 3A4W）亞家族的保守度相對較高，在-3 至+2 亞位點均存在保守氨基酸。GH18 家族3 個亞家族都具有相同的催化斷鍵位點（酸性的Asp和Glu）。而GH19家族幾丁質(zhì)酶（PDB ⅠD 3WH1）的底物結(jié)合裂隙較淺，一般可以容納4個底物糖環(huán)，相對保守的氨基酸在-2 至+2 亞位點均有分布，但其保守性相對GH18家族幾丁質(zhì)酶較弱（圖2a）。有趣的是，GH19 家族幾丁質(zhì)酶的正負亞位點結(jié)構(gòu)對稱，而GH18 家族幾丁質(zhì)酶正負亞位點結(jié)構(gòu)具有不對稱性，尤其是GH18 Sub A 亞家族。這表明在幾丁質(zhì)酶的進化過程中，通過增加結(jié)合底物的亞位點，并形成類似隧道的活性架構(gòu)來獲得持續(xù)催化的能力［17］。

GH18家族幾丁質(zhì)酶與底物C2官能團和突出的O6原子相互作用較多，在C2官能團方面，幾丁質(zhì)酶同時結(jié)合底物亞氨基氮原子和乙?；踉?，保守的GH18家族幾丁質(zhì)酶活性位點殘基主要與底物的O7 原子相互作用；GH19 家族幾丁質(zhì)酶活性位點殘基則不表現(xiàn)出對底物氮原子和氧原子的偏好。GH18 家族幾丁質(zhì)酶平均每個亞位點僅形成2 個氫鍵相互作用，GH19家族幾丁質(zhì)酶每個亞位點平均可形成4 個氫鍵相互作用，GH18 家族幾丁質(zhì)酶相對較少的氫鍵相互作用可加速持續(xù)性。GH18 和GH19家族幾丁質(zhì)酶活性中心表面都包含多個保守的芳香族氨基酸殘基，這些殘基通過疏水相互作用力結(jié)合幾丁質(zhì)底物［18-19］，但GH18家族幾丁質(zhì)酶的CH-π 相互作用平均分布于8 個亞位點，并且具有相對較高的保守性，為持續(xù)性作用提供滑行的軌道［7］，而GH19 家族幾丁質(zhì)酶的CH-π 相互作用主要存在于-2 及+2 亞位點，且保守性相對較低，可穩(wěn)定底物結(jié)構(gòu)（圖2b）。綜上所述，GH18 家族持續(xù)性幾丁質(zhì)酶活性架構(gòu)亞位點的不對稱性以及活性中心芳香族氨基酸的高度保守性可能是該家族幾丁質(zhì)酶具有持續(xù)性催化機制的結(jié)構(gòu)基礎［20］。

Fig.2 Conserved analysis of chitinase active center圖2 幾丁質(zhì)酶活性中心保守性分析

2.2 催化機制

目前，隨著對GH18家族幾丁質(zhì)酶催化機制的研究，越來越多的證據(jù)表明底物輔助保留模型能夠更好地解釋反應機理。以來自黏質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens）的幾丁質(zhì)酶SmChiB（PDBⅠD 1E6N）為例闡述［21］，當GlcNAc進入-1亞位點時，在氨基酸殘基的作用下發(fā)生構(gòu)象變化，由椅式構(gòu)象變?yōu)榇綐?gòu)象，使得N-乙酰基的羧基氧原子靠近異頭碳（C1）并發(fā)起親核攻擊，Tyr214 與羧基氧原子形成氫鍵穩(wěn)定該結(jié)構(gòu)。Asp142 進行翻轉(zhuǎn)與N-乙?；纬蓺滏I，穩(wěn)定中間體結(jié)構(gòu)，另外Asp142 翻轉(zhuǎn)后靠近Glu144 并與其形成氫鍵激活質(zhì)子供體，糖苷鍵斷裂，產(chǎn)物解離，惡唑啉離子中間體形成。后催化水分子對C1 發(fā)動親核攻擊，惡唑啉離子中間體解體，Glu144 恢復初始狀態(tài)，Asp142 在Asp140 的輔助下翻轉(zhuǎn)回初始位置，產(chǎn)物釋放，水解完成（圖3a）。但也有個例存在，如來自同一株菌的SmChiA（PDB ⅠD 1EHN）［22］的催化過程中并未形成惡唑啉離子中間體。在底物糖苷鍵質(zhì)子化后，與Asp311相互作用的Asp313翻轉(zhuǎn)到其替代位，并與催化殘基Glu315 相互作用使得-1 亞位點GlcNAc的N-乙酰氨基團繞C2-N2旋轉(zhuǎn)，N-乙酰氨基團的N-H翻轉(zhuǎn)至另一位置完成水解過程。

GH19 家族幾丁質(zhì)酶采用單一置換反轉(zhuǎn)機制，以來自蕊形真蘚（Bryum coronatum）的GH19家族幾丁質(zhì)酶BcChi-A（PDB ⅠD 3WH1）［23］為例進行闡述。催化過程如下（圖3b）：催化反應發(fā)生前，Glu61作為催化酸，Glu89作為催化堿。GlcNAc到達-1亞位點時保持椅式構(gòu)象不變。Glu61提供H離子使糖苷鍵中的異頭氧原子質(zhì)子化，糖苷鍵斷裂，形成羰基碳鎓離子中間體，同時Gln164 與-1 亞位點的GlcNAc的N-乙酰氨基團形成氫鍵，從而阻止惡唑啉離子中間體的形成。Glu70作為一般堿起著穩(wěn)定水分子的作用，當中間體形成后，被Ser102的羥基氧原子形成氫鍵固定的催化水分子可以被Glu70激活并發(fā)生親核攻擊。水解產(chǎn)物發(fā)生構(gòu)型反轉(zhuǎn)，產(chǎn)生α異頭物，產(chǎn)物釋放，水解完成。

Fig.3 The schematic diagram of chitinase catalysis mechanism圖3 幾丁質(zhì)酶催化機制示意圖

3 持續(xù)性作用機制

由于結(jié)晶幾丁質(zhì)具有抗降解性，持續(xù)性幾丁質(zhì)酶要從結(jié)晶表面剝離出單條幾丁質(zhì)鏈，進而可以持續(xù)性降解，不斷產(chǎn)生二糖單元。目前，持續(xù)性幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)基礎在模式細菌S.marcescens中得到一定研究。S.marcescens包含兩個持續(xù)性幾丁質(zhì)酶，SmChiA 和SmChiB，屬于GH18 家族并具有保守的CⅠD結(jié)構(gòu)域［12］。其中SmChiA從非還原端向還原端移動，在非還原端在釋放（GlcNAc）2，而SmChiB則從還原端向非還原端移動，在還原端釋放（GlcNAc）2（圖4a），SmChiA的半衰期和速度都比SmChiB 大，表明不對稱的亞位點結(jié)構(gòu)決定了結(jié)晶多糖的降解方向和程度［24］。結(jié)晶結(jié)構(gòu)表明兩者的活性架構(gòu)中芳香氨基酸呈線性排列［18］。這些芳香族殘基（特別是Trp）可以與糖環(huán)的一側(cè)或兩側(cè)形成堆積或疏水相互作用，并形成一個靈活的鞘，推動幾丁質(zhì)鏈沿著鞘滑動［25］?；钚约軜?gòu)芳香族氨基酸的缺失通常會導致酶對結(jié)晶幾丁質(zhì)底物的親和力、持續(xù)性和活性降低［7］。此外，活性架構(gòu)中極性殘基與芳香殘基均呈線性排列（圖4b），也可能參與持續(xù)性。Hamre 等［25］證明活性架構(gòu)極性氨基酸Thr276 在持續(xù)性作用過程中發(fā)揮重要作用，突變體ChiA-T276A產(chǎn)物的［（GlcNAc）2］/［GlcNAc］比例降低近50%，幾丁質(zhì)降解效率降低26.7%。Jana等［26］通過定點誘變確定了S.marcescens幾丁質(zhì)酶SmChiB 活性架構(gòu)中極性氨基酸的作用。但是，目前對極性殘基在底物結(jié)合、糖苷酶作用模式和持續(xù)性中的作用的了解仍然相對有限。

Fig.4 The schematic diagram of the processive catalysis mechanism of chitinases圖4 幾丁質(zhì)酶持續(xù)性催化機制示意圖

盡管結(jié)晶幾丁質(zhì)和纖維素的物理和化學穩(wěn)定性是相似的，但是幾丁質(zhì)酶移動產(chǎn)生雙糖的速度是纖維素酶的10 倍［27-28］。幾丁質(zhì)酶快速單向運動的機制越來越受到人們的關注。Nakamura等［29］利用高精度單分子成像、X射線晶體學和全原子動力學模擬等技術(shù)研究了SmChiA單向持續(xù)性運動機理，分為化學步驟（底物輔助催化和產(chǎn)物釋放）和機械步驟（脫晶和鏈滑動）。在另一項研究中，Nakamura等［30］通過單分子熒光成像成功測定了SmChiA 的基本速率常數(shù)，結(jié)果表明持續(xù)性幾丁質(zhì)酶SmChiA需要與內(nèi)切幾丁質(zhì)酶以及輔助催化酶類AA10家族裂解多糖單加氧酶CBP21（LPMO）協(xié)同作用，才能有效地結(jié)合到鏈端并增加水解活性。為了研究幾丁質(zhì)酶的持續(xù)性，人們開發(fā)了各種各樣的研究方法。經(jīng)典的方法包括使用薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）等方法定量產(chǎn)物，計算G2/（G1+G3）的比例［31-32］以及可溶性還原糖的比例［33］，使用水溶性殼聚糖（部分去乙?；瘞锥≠|(zhì)）作為底物測定產(chǎn)物中偶數(shù)糖與奇數(shù)糖的比例。此外，使用熒光標記底物［34-35］或安培生物傳感器［36］已成功地確定有效結(jié)合酶的分數(shù)，以估計酶的持續(xù)性能力。近年來，高速原子力顯微鏡［37］或全內(nèi)反射熒光顯微鏡［30，38］等單分子成像技術(shù)的應用，使人們能夠直接觀察有效結(jié)合的持續(xù)性酶。

4 細菌幾丁質(zhì)酶系協(xié)同降解模式

自然界中，幾丁質(zhì)經(jīng)過脫乙?；刃揎椬饔?，其結(jié)構(gòu)具有一定的復雜性，需要多種幾丁質(zhì)酶協(xié)同降解［2，39］。一些細菌可以分泌多種幾丁質(zhì)酶，利用特異的協(xié)同降解模式實現(xiàn)高效降解幾丁質(zhì)。代表菌株是模式菌S.marcescens，分泌GH18 家族幾丁質(zhì)酶SmChiA、SmChiB 和SmChiC、GH20 家族殼二糖酶（chitobiase）和LPMO［27，40-41］；嗜熱鏈霉菌Streptomycessp. F-3，胞外分泌6 種幾丁質(zhì)降解相關蛋白，除了GH18 家族幾丁質(zhì)酶SsChi18A、SsChi18B 和SsChi18C、GH20 家 族SsGH20A 和AA10 家族裂解多糖單加氧酶SsLPMO10A 外，還包含一種GH19 家族幾丁質(zhì)酶SsChi19A［11］；紅茶纖維弧菌（Cellνibrio japonicas）可分泌GH18家族的幾丁質(zhì)酶CjChi18B、CjChi18C、CjChi18D 及GH18 家族糖苷酶CjChi18A，及AA10 家族的CjLPMO［41］。幾丁質(zhì)降解酶系包含至少4 類酶：a. LPMO，如CBP21、SsLPMO10A 和CjLPMO，通過氧化裂解作用隨機切割幾丁質(zhì)聚合物釋放自由鏈末端；b. 內(nèi)切幾丁質(zhì)酶，如GH18 家族的SmChiC、SsChi18B、SsChi18C、CjChi18C 和CjChi18D，GH19家族的SsChi19A，通過水解作用使糖苷鍵斷裂，從而釋放自由鏈末端或產(chǎn)生寡聚糖；c. 持續(xù)性外切幾丁質(zhì)酶，如SmChiA、SmChiB、SsChi18A 及CjChi18B，它們均屬于GH18-Sub A 家族，可從幾丁質(zhì)鏈的還原端或非還原端持續(xù)性降解并產(chǎn)生二糖單元；d.殼二糖酶或N-乙 酰 氨 基 葡 萄 糖 苷 酶 （endo-β-Nacetylglucosaminidase，NAG），如GH20 家族的殼二糖酶、SsGH20A 和GH18 家族的CjChi18A，將（GlcNAc）2水解為GlcNAc。幾丁質(zhì)酶系協(xié)同降解過程如下［42］：LPMO 和內(nèi)切幾丁質(zhì)酶在結(jié)晶幾丁質(zhì)表面作用釋放自由鏈末端，持續(xù)性幾丁質(zhì)酶由鏈末端切入、剝離幾丁質(zhì)單鏈并進行持續(xù)性降解產(chǎn)生二糖單元，內(nèi)切幾丁質(zhì)酶在作用過程中產(chǎn)生的寡聚糖，由內(nèi)切幾丁質(zhì)酶或持續(xù)性幾丁質(zhì)酶進一步降解產(chǎn)生寡糖，最后殼二糖酶或β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶將寡糖降解為單糖，運送至胞內(nèi)進一步降解（圖5a-c）。研究表明，一些不具備幾丁質(zhì)水解活性的結(jié)合蛋白（chitin binding protein，CBP）可增加底物可及性與幾丁質(zhì)酶協(xié)同作用［43］。

在細菌中，磷酸烯醇丙酮酸依賴的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）和ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運體分別負責GlcNAc單體和低聚物的攝取［44］，這些產(chǎn)物在胞內(nèi)進行代謝，經(jīng)EMP途徑進入TCA循環(huán)，實現(xiàn)幾丁質(zhì)的徹底降解（圖5d）。此外，弧菌幾丁質(zhì)水解酶的誘導受到組氨酸激酶和雙組分系統(tǒng)的復雜調(diào)節(jié)（圖5e）。在靜息狀態(tài)下，CBP 與膜蛋白ChiS 的周質(zhì)域結(jié)合。當分泌的幾丁質(zhì)酶將幾丁質(zhì)降解為胞外空間的低聚糖時，低聚糖被孔蛋白運輸并與CBP結(jié)合。在結(jié)合狀態(tài)下，CBP/ChiS 復合物解離并轉(zhuǎn)運信號表達幾丁質(zhì)降解基因。ChiS 的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域由3 個亞結(jié)構(gòu)域組成：依賴ATP 的組氨酸激酶/磷酸酶（HK）結(jié)構(gòu)域、Asp 響應調(diào)節(jié)器（RR）域和組氨酸磷酸化轉(zhuǎn)移（HP）結(jié)構(gòu)域［45］。

Fig.5 The shematic diagram of synergistic degradation of chitinases圖5 幾丁質(zhì)酶協(xié)同降解示意圖

5 細菌幾丁質(zhì)酶系的理性設計策略

為滿足工業(yè)應用需求，提高幾丁質(zhì)酶的催化活性和熱穩(wěn)定性是目前幾丁質(zhì)酶設計的研究熱點，表1總結(jié)了近年來對幾丁質(zhì)酶設計改造的實例。傳統(tǒng)的設計策略定向進化技術(shù)通過隨機誘變或重組技術(shù)獲得突變體，不需對酶的結(jié)構(gòu)和功能有深入的了解，但是構(gòu)建的突變文庫容量非常大，所以該方法對高通量篩選的方法要求非常高［46］。Songsiriritthigul 等［47］利用定向進化技術(shù)，對地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）來源的GH18 家族ChiA進行易錯突變，從10個突變體中最終篩選到酶活性提高2.7 倍的幾丁質(zhì)酶突變體。Menghiu等［48］通過易錯PCR 技術(shù)建立Bacillus licheniformisDSM8785 chiA 的突變體庫，使用熒光激活細胞分選（FACS）技術(shù)篩選出酶活提高100%的突變體DH08，發(fā)現(xiàn)在DH08 中3 個位點發(fā)生突變分別是K128E、H130N和D220Y。

目前對幾丁質(zhì)酶進行設計使用最多的是半理性設計策略，該策略在對結(jié)構(gòu)簡單認識的基礎上對特定結(jié)構(gòu)域的殘基進行突變，建立簡潔的突變體庫，通過組合篩選出最優(yōu)突變體。例如，采用基于共識的半理性設計引入二硫鍵和Pro 提高了幾丁質(zhì)酶PpChi1 的熱穩(wěn)定性，50℃時半衰期值為野生型的26.3 倍，最適反應溫度由45℃提高到52.5℃［49］。用來自環(huán)狀芽孢桿菌WL-12 （Bacillus circulansWL-12）BcChiA1 的CBM12 代 替 白 長 鏈 霉 菌ATCC 27414 （Streptomyces albolongusATCC 27414）SaChiA4 的CBM5，使SaChiA4 對幾丁質(zhì)粉的活性提高了近54%（28×103U/g），對膠質(zhì)幾丁質(zhì)活性提高了49%［50］。深綠木霉PTCC5220（Trichoderma atroνiridePTCC5220）的Chit42 缺乏1 個幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，將S. marcescens SmChiB的CBM 與Chit42 融合，得到了一種具有更強幾丁質(zhì)結(jié)合能力的嵌合幾丁質(zhì)酶，并且嵌合幾丁質(zhì)酶對植物病原真菌具有較高的抗真菌活性［51］。

理性設計B.circulans的ChiA1 突變體突變T682A 導致了對幾丁質(zhì)底物更高的特異性［52］。突變S.marcescensChiB 的表面殘基構(gòu)成G188A/A234P 雙突變體，其在57℃時，半衰期增加了10倍，表觀Tm增加了4.2℃［53］。S.marcescensB4A 的幾丁質(zhì)酶突變體S390Ⅰ可耐受90℃高溫［54］。蘇云金芽孢桿菌WB7（Bacillus thuringiensisWB7）活性位點突變體E209Q拓寬pH［55］。

隨著幾丁質(zhì)酶被表征的序列和結(jié)構(gòu)不斷增多，計算分析方法不斷更新。可以基于蛋白質(zhì)（亞）家族豐富的序列數(shù)據(jù)的祖先序列重構(gòu)技術(shù)來對幾丁質(zhì)酶進行設計。研究表明，寒武紀前的酶分子比現(xiàn)存的酶更耐高溫，所以將現(xiàn)存酶恢復成祖先酶的序列可以設計出耐熱蛋白，該方法現(xiàn)已成功獲得了更耐熱的細胞色素P450 酶和更耐高溫的酮醇酸還原異構(gòu)酶［56］。另一方面，可以基于結(jié)構(gòu)生物信息學進行理性設計，利用已有結(jié)構(gòu)進行分子模建，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹及酶活性中心序列譜。AlphaFold 利用多序列比對，將有關蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的物理和生物學知識結(jié)合在深度學習算法的設計中，高度精確地預測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，為理性設計提供精確的模板［57-59］。通過對GH18 3 個亞家族和GH19 家族的活性中心序列譜分析發(fā)現(xiàn)，其活性架構(gòu)亞位點數(shù)是從大到小變化的，并且保守性也是越來越低的。這種基于結(jié)構(gòu)生物信息學的統(tǒng)計分析可以定位關鍵功能區(qū)和功能殘基，建立小而精的突變文庫，從而有效改變酶的穩(wěn)定性、活性及底物特異性等［60］。

Table 1 Recent progress in engineering activity and stability of chitinases表1 幾丁質(zhì)酶改造實例

續(xù)表1

6 總結(jié)與展望

幾丁質(zhì)酶解產(chǎn)物CHOS 及GlcNAc 在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、工業(yè)等方面發(fā)揮重要作用。CHOS被認為是潛在的益生元，容易被人體腸道吸收并可抑制一些食物致病菌的生長［62］。研究發(fā)現(xiàn)，CHOS 不僅能夠影響各種復雜途徑抑制結(jié)腸黏膜內(nèi)的炎癥［63］，而且在新的抗癌治療策略中得到了廣泛的關注［64］。GlcNAc 能夠促進成纖維細胞釋放酸性黏多糖，恢復胃腸道保護結(jié)構(gòu)的形成，是一種潛在的治療炎癥性腸病的候選藥物［60］。在未來的研究中，可以運用代謝工程策略將代謝通量轉(zhuǎn)向目標產(chǎn)物，也可以有效強化整個幾丁質(zhì)降解途徑，促進目標產(chǎn)物合成。

雖然許多細菌幾丁質(zhì)酶被純化和表征，但不同幾丁質(zhì)酶確切的相互作用和催化機制仍然是不清楚的，持續(xù)性幾丁質(zhì)酶前進的動力之源仍未得到解答，LPMO 氧化還原作用所需還原能的來源仍未知，進一步的機制研究是必須且迫切的。另外，GH19 家族幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)與功能有待進一步研究。幾丁質(zhì)協(xié)同降解酶系的精細分工與合作仍需進一步探究。目前，蛋白質(zhì)工程設計改造現(xiàn)存的幾丁質(zhì)酶分子，以提高幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性和催化活性，構(gòu)建高效的協(xié)同降解酶系是工業(yè)亟待解決的關鍵問題。雖然人們已經(jīng)嘗試運用定向進化、半理性設計等方法來設計酶分子，但是仍需要建立一個普適的策略能夠大幅度地提高酶分子的性質(zhì)。前面已經(jīng)提到了祖先序列重構(gòu)和基于結(jié)構(gòu)生物信息學的理性設計策略需要被分析和發(fā)展，依賴于結(jié)構(gòu)和大量的時間、資源來訓練數(shù)據(jù)集的分子動力學模擬和深度學習技術(shù)在用來改造酶分子的道路上仍任重道遠。