周 娟，龍云川，周 偉，鄧春英，黃 霞，周少奇

(1.貴州科學(xué)院，貴州 貴陽 550001；2.貴州大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.清華大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，北京 100084)

自然界中的微生物資源豐富且廣泛分布于各種生境中，微生物資源能為農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥、食品等行業(yè)提供所需的材料和能源。放線菌是微生物資源中不可或缺的一大類，在土壤生物地球化學(xué)循環(huán)和土壤生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用。放線菌實際的應(yīng)用價值和經(jīng)濟價值都極其廣泛，在自然環(huán)境中能產(chǎn)生很多有活性的物質(zhì)，如抗生素、酶及其抑制劑等。此外，放線菌能生產(chǎn)具有臨床和藥學(xué)重要性的新型先導(dǎo)化合物，在目前已知的1000種不同抗生素中，約70%是由放線菌生產(chǎn)的。近年來，更多新的活性物質(zhì)從特殊生境微生物中分離純化出來，而作為活性物質(zhì)新來源的放線菌受到了國際科學(xué)研究者的關(guān)注和重視。

貴州喀斯特地區(qū)復(fù)雜的地形、裂隙懸崖、溶洞和多變的氣候條件形成了多種生態(tài)系統(tǒng)，促進了生物多樣性的豐富程度。由于區(qū)域的自然條件和地理隔離具有一定的特殊性，不同生境條件下微生物的多樣性組成在一定程度上存在明顯差異。目前關(guān)于貴州喀斯特地貌不同生境放線菌的資源及多樣性研究相對較少，因此，本研究選取貴州西南喀斯特不同地區(qū)不同生境的土壤作為研究對象，對土壤中的放線菌進行分離、篩選、鑒定，通過分析考察不同生境中放線菌的分布和多樣性，為貴州地區(qū)的微生物資源現(xiàn)狀開發(fā)、保護和可持續(xù)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

分別從貴州興義萬峰林國家地質(zhì)公園(104°55′24″E，25°59′17″N)、六盤水梅花山(104°33′52″E，26°44′56″N)、畢節(jié)威寧草海國家自然保護區(qū)(104°14′39″E，26°51′59″N)、畢節(jié)金沙縣(106°20′51″E，27°28′35″N)、遵義綏陽雙河洞(107°20′30″E，28°10′42″N)采集土壤樣品，采樣區(qū)域具體信息如表1所示。

表1 研究區(qū)域基本信息Tab.1 The basic information of the study areas

.研究方法

..土壤樣品的采集與制備

分別選取采樣區(qū)域不同生境土壤作為樣品來源，設(shè)置10 m×10 m樣方，采用五點法采集樣方內(nèi)土壤，每個點采集3個不同樣品充分混勻作為該點土樣，采樣時將所采區(qū)域范圍的植被、落葉用取樣器刮除，離地表面5～20 cm深處用取樣器均勻取樣，剔除石礫、植被殘體等，將土壤樣品充分混勻，取部分裝進無菌自封袋帶回實驗室，及時冷凍干燥，研磨為均勻細小的顆粒，放于-20 ℃冰箱中標(biāo)號保存以備用。

..放線菌的分離純化

將處理后的土壤樣品分別進行放線菌的分離純化。采用十倍梯度稀釋法制備土樣，選取10、10、103個稀釋濃度的土壤菌懸液，均勻涂布于改良后的高氏1號培養(yǎng)基平板上，為抑制土壤樣品中其他微生物的生長繁殖，確保分離得到放線菌，本研究在滅菌后的高氏1號培養(yǎng)基中添加了75 mg/L的無菌重鉻酸鉀。經(jīng)28 ℃培養(yǎng)7～15天后，觀察各平板上菌落的長勢和色素分泌情況，挑取不同的單菌落進行多次分離純化，最后將純化菌株進行斜面保藏和甘油保存。

..放線菌的形態(tài)鑒定

將分離得到的放線菌菌株進行形態(tài)鑒定，觀察記錄菌株在高氏1號培養(yǎng)基上的形態(tài)、可溶性色素顏色、氣生和基內(nèi)菌絲顏色、形狀等，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株菌絲體特征，參照《放線菌分類基礎(chǔ)》、《鏈霉菌鑒定手冊》將菌株鑒定到屬或鏈霉菌的類群。

..放線菌的16S rDNA序列分析

利用細菌DNA抽提試劑盒提取純培養(yǎng)放線菌的基因組，選用通用引物7F(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)和1540R(5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)擴增放線菌的16S rDNA基因片段?；驍U增反應(yīng)體系參照龍云川等方法進行。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳驗證后，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行基因序列測定與分析。運用MEGA軟件通過Neighbor Joining方法構(gòu)建放線菌各菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，并分析發(fā)育親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 典型放線菌菌株的形態(tài)特征

從貴州興義萬峰林國家地質(zhì)公園、六盤水梅花山、畢節(jié)威寧草海國家自然保護區(qū)、畢節(jié)金沙縣、遵義綏陽雙河洞共采集土壤樣品25份，用梯度稀釋法分離純化得到放線菌菌株156株，部分放線菌的典型菌落形態(tài)如圖1所示。從圖1可以看出，不同種類的放線菌菌株的孢子顏色、氣絲顏色、基內(nèi)絲體顏色存在一定差異，呈現(xiàn)白色、灰色、褐色、鮮黃色、橙紅色等多種顏色，部分放線菌菌株還可產(chǎn)生不同顏色的可溶性色素。

注：a為菌株511(鏈霉菌屬(Streptomyces)燼灰類群)；b為菌株531(鏈霉菌屬(Streptomyces)灰褐類群)；c為菌株542(鏈霉菌屬(Streptomyces)灰紅紫類群);d為菌株552(鏈霉菌屬(Streptomyces)灰褐類群)；e為菌株624(鏈霉菌屬(Streptomyces)淡紫灰類群)；f為菌株1091(非鏈霉菌屬)。圖1 典型放線菌菌落Fig.1 Typical actinomycetes colonies

部分放線菌的菌絲形態(tài)如圖2所示，圖2-a孢子絲較直，少數(shù)呈螺旋形或環(huán)狀，孢子呈柱形；圖2-b孢子絲松敞，呈規(guī)則螺旋形，孢子呈橢圓形，表面較光滑；圖2-c菌落致密，孢子絲呈緊密螺旋形，孢子多呈卵圓形，表面常有大突起。

注：a為菌株511；b為菌株552；c為菌株624。圖2 放線菌菌絲的典型形態(tài)Fig.2 Typical morphology of actinomycetes mycelia

綜上可知，不同種類的放線菌菌株的菌絲生長情況各異，有的菌株(圖1-e)菌絲致密,有的菌株(圖1-a)菌絲較為疏松。不同種類的放線菌孢子絲及孢子也形態(tài)各異(圖2)。

2.2 典型放線菌菌株的鑒定

基于放線菌單菌落在平板中的培養(yǎng)特征，對相同放線菌菌株進行歸類，挑選了25株代表性的菌株進行16S rRNA測序，得到放線菌菌株的分類學(xué)信息，如表2所示。分離得到的156株菌株分別鑒定為6個屬：游動放線菌屬()、小單孢菌屬()、諾卡氏菌屬()、類諾卡氏菌屬()、放線菌屬()、鏈霉菌屬()，分別屬于24個種和1個疑似新種。分離到18個不同種類的鏈霉菌屬放線菌，7種稀有放線菌(非鏈霉菌屬)。

表2 代表性放線菌菌株分類Tab.2 Taxonomic assignment of actinomycetes strains

2.3 不同生境對放線菌分布的影響

從各采集區(qū)域選擇1種代表性的生境土壤樣品進行生境對土壤放線菌分布的影響探究。不同生境中放線菌的分布如表3所示，采集地生境為荒地、山坡時，分離純化出的放線菌菌株數(shù)量和放線菌所屬的種類較少，采集地生境為濕地時，分離純化出的放線菌數(shù)量和種類最多，喀斯特洞穴中(綏陽雙河洞)次之。

表3 不同生境中放線菌的分布情況

2.4 放線菌的16S rDNA序列分析

在鑒定分離得到的放線菌菌株時，發(fā)現(xiàn)1個疑似新種(菌株L6152)，16S rDNA序列測定結(jié)果表明該基因片段大小為1463 bp。Blast分析結(jié)果顯示，該菌株的序列與枝鏈霉菌()相似度為97.5%。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)顯示，菌株L6152與枝鏈霉菌(該菌株登陸號為KX462528)雖位于同一分支，但親緣關(guān)系較遠，故該菌株為疑似新種，暫命名枝鏈霉菌(sp.nov.)。菌株L6152從喀斯特洞穴綏陽雙河洞分離得到，該洞穴的特殊環(huán)境給新型放線菌的生存提供了有利條件。

圖3 基于16S rDNA序列分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA

3 結(jié)論與討論

以貴州喀斯特地區(qū)不同生境的土壤為對象，開展放線菌微生物資源及其多樣性調(diào)查。在貴州興義市、六盤水市、威寧縣、金沙縣、綏陽縣等地采集土樣標(biāo)本25份，共分離得到不同種類的放線菌菌株156株，分屬6個屬及25個種，其中有1個疑似新種，暫命名枝鏈霉菌(sp.nov.)。放線菌群落中鏈霉菌屬是占絕對優(yōu)勢的類群，廣泛分布于5個不同生境的土壤中。鏈霉菌因代謝物豐富多樣，具有很強的適應(yīng)性；Long和D’Angeli的研究也證實了鏈霉菌屬在多種生境的土壤中具有較高的豐度，本研究與其研究結(jié)果基本一致。

本研究結(jié)果表明，在進行放線菌菌株分離及資源利用時，應(yīng)結(jié)合不同種類放線菌的生長特性及采樣地生境特點。建議優(yōu)先選擇自然保護區(qū)和受人為活動干擾較少的區(qū)域，這有利于增加土壤放線菌的種類、數(shù)量以及發(fā)現(xiàn)稀有放線菌的概率。此外，本研究中稀有放線菌的種類和數(shù)量較少，這可能與采用的分離培養(yǎng)基種類較少有關(guān)。部分稀有放線菌有著獨特的適應(yīng)環(huán)境與培養(yǎng)條件，例如某些放線菌偏好寡營養(yǎng)的培養(yǎng)環(huán)境。

洞穴生境由于有機營養(yǎng)物質(zhì)有限、無光照、濕度高等特點，是一類極端的生物棲息地。放線菌是細菌域中重要的門之一，在森林、農(nóng)田等多種生境環(huán)境中都有發(fā)現(xiàn)。放線菌自身的代謝特點可以較好的適應(yīng)洞穴生境的寡營養(yǎng)環(huán)境。本研究中發(fā)現(xiàn)洞穴生境中放線菌的分布較為豐富(綏陽雙河洞)，與該研究結(jié)果一致。

稀有放線菌在培養(yǎng)基中的恢復(fù)及生長過程需要各種類型的特殊環(huán)境條件，本研究所分離出的稀有放線菌的種類和數(shù)量較少。后續(xù)放線菌菌株分離及資源采集時，可針對放線菌的生長特性及采樣地生境特點，對分離培養(yǎng)基及分離條件進行針對性設(shè)計。本研究初步揭示了貴州喀斯特地區(qū)土壤微生物放線菌的分布，可為喀斯特區(qū)域放線菌的資源保護和開發(fā)利用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。