李 冉，夏旋燕，孫 苗，周 婷，賴(lài)童飛

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311121)

0 引言

銳頂鐮孢菌(Fusariumacuminatum)屬于半知類(lèi)真菌，是一種無(wú)性型子囊菌，其分生孢子呈鐮刀形，頂細(xì)胞為喙?fàn)睿?xì)胞足跟明顯，廣泛分布在植物和土壤中.作為一種重要的病原菌，它是人參、玉米、谷物、豆類(lèi)等作物根腐病[1-3]和大蒜、馬鈴薯等作物莖腐病的主要致病菌[4-5]，還能夠侵染越橘、獼猴桃、南瓜等果實(shí)[6-8]，造成寄主產(chǎn)量損失和品質(zhì)下降，嚴(yán)重危害我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn).同時(shí)F.acuminatum能夠產(chǎn)生多種單端孢霉烯類(lèi)毒素，如T-2毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol)和4-乙酰雪腐鐮刀菌烯醇(4-acetylnivalenol)，直接損傷腎臟、肝臟及消化道黏膜，引起胃腸出血或炎癥、壞死性皮炎、白細(xì)胞數(shù)量降低、免疫下降及流產(chǎn)等癥狀，對(duì)人、畜健康產(chǎn)生巨大威脅[9-11].此外，F(xiàn).acuminatum還具有冰核活性，可誘發(fā)植物霜凍[12-14].目前，除了精選抗病品種、做好田間消毒及管理工作，使用有機(jī)硫類(lèi)和唑類(lèi)殺菌劑可獲得一定的防治效果[15].

小RNA(sRNA)是一大類(lèi)長(zhǎng)度約為18～30 nt的非編碼RNA分子，廣泛存在于人類(lèi)、動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)，主要包括微RNA(miRNA)、小干擾RNA(siRNA)、小非編碼RNA(sncRNA)、核小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、Piwi互作RNA(piRNA)及重復(fù)相關(guān)小干擾RNA(rasiRNA)等.小RNA通常與蛋白質(zhì)組成復(fù)合物，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用，其主要功能包括靶向降解mRNA、抑制翻譯、編輯DNA以及促進(jìn)異染色質(zhì)形成等，在基因表達(dá)、細(xì)胞分化、發(fā)育與衰老、物質(zhì)及能量代謝等細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[16-18].因此，本研究以具有重大危害的病原菌F.acuminatum為研究對(duì)象，采用高通量小RNA測(cè)序技術(shù)，獲得F.acuminatum全基因組水平小RNA圖譜，利用大數(shù)據(jù)的覆蓋率和深度，發(fā)掘F.acuminatum特有或新的小RNA，并對(duì)小RNA的表達(dá)水平和作用靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè)與注釋.研究結(jié)果有助于加深對(duì)F.acuminatum生活周期、發(fā)病規(guī)律及致病機(jī)制的了解，為闡明F.acuminatum特定生理過(guò)程的分子調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

病原菌Fusariumacuminatum為本實(shí)驗(yàn)室自有菌種，紅富士蘋(píng)果(MalusdomesticaBorkh. Cv. Red Fuji)購(gòu)自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng).PDA培養(yǎng)基(potato dextrose agar)購(gòu)自美國(guó)BD公司(Becton, Dickinson and Company)，PDB培養(yǎng)基(potato dextrose broth)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，其他常規(guī)試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司.

1.2 菌種活化及測(cè)序樣品準(zhǔn)備

挑選生理成熟、無(wú)機(jī)械損傷及病蟲(chóng)害的蘋(píng)果果實(shí)，經(jīng)75%乙醇表面消毒，在超凈臺(tái)中風(fēng)干后，利用接種針在果實(shí)赤道部位形成0.3 cm深的傷口，挑取少量菌絲體覆于傷口上，在25 ℃及90%濕度條件下培養(yǎng)，每日觀察、拍照并測(cè)量病斑直徑.在發(fā)病果實(shí)病斑邊緣剝?nèi)ス?，利用無(wú)菌鑷子夾取0.2 cm × 0.2 cm左右果肉置于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日統(tǒng)計(jì)菌落直徑.在培養(yǎng)一周的培養(yǎng)基上，利用打孔器獲取直徑為1 cm的菌餅，加入到含有100 mL PDB的三角瓶中，在200 r/min、25 ℃的搖床中振蕩培養(yǎng)36 h，離心收集菌絲，無(wú)菌水漂洗兩次后液氮速凍，-80 ℃超低溫冰箱保存.整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，兩次樣品等質(zhì)量混勻后用于小RNA測(cè)序.

1.3 小RNA的分離、文庫(kù)制備及測(cè)序

小RNA測(cè)序由BGI華大基因提供技術(shù)服務(wù)，嚴(yán)格按照華大基因標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目流程進(jìn)行，主要過(guò)程簡(jiǎn)述如下：提取樣品總RNA，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離18～30 nt的RNA，在3’端連接5-腺苷酸化的單鏈DNA接頭，加入逆轉(zhuǎn)錄引物與3’端接頭雜交后，連接5’接頭，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄延伸，合成一鏈cDNA.使用高敏聚合酶對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，富集連接有3’接頭和5’接頭的cDNA，放大文庫(kù)產(chǎn)量，利用PAGE電泳分離100～120 bp的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行文庫(kù)定量及pooling環(huán)化，通過(guò)BGISEQ-500平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序.

1.4 測(cè)序結(jié)果分析

測(cè)序獲得的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)堿基判讀技術(shù)(base calling)轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)(raw data)，以FASTQ格式存儲(chǔ)，隨后去除誤插入片段序列、插入片段過(guò)長(zhǎng)序列、低質(zhì)量序列、polyA序列和小片段序列獲得干凈序列(clean tags)，統(tǒng)計(jì)sRNA的序列種類(lèi)、序列數(shù)量及長(zhǎng)度分布.之后使用AASRA軟件將clean tags與近源物種的全基因組序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Fusarium+oxysporum)及sRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)[19].為保證每個(gè)sRNA有唯一注釋?zhuān)凑誐iRbase、pirabank、snoRNA、Rfam以及其他RNA的優(yōu)先級(jí)順序?qū)γ總€(gè)sRNA進(jìn)行注釋.根據(jù)miRNA前體存在發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)的特性，利用miRDeep2和miRA進(jìn)行miRNA預(yù)測(cè)[20-21]，利用Piano進(jìn)行piRNA預(yù)測(cè)[22]，結(jié)合siRNA堿基特性預(yù)測(cè)潛在的siRNA[23].結(jié)合自由能、分值等篩選條件，利用TAPIR(參數(shù)為-c 4)和TargetFinder(參數(shù)為-score 5-mfe_ratio 0.6)軟件進(jìn)行miRNA靶標(biāo)的預(yù)測(cè)[24].利用Gene Ontology Consortium數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.geneontology.org/)對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行Gene Ontology(GO)功能注釋及富集分析.利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)進(jìn)行KEGG及pathway顯著性富集分析.

1.5 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次重復(fù)，數(shù)據(jù)在Microsoft Excel中進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05時(shí)表示差異顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 F. acuminatum生理?xiàng)l件分析

F.acuminatum早期已經(jīng)通過(guò)形態(tài)學(xué)及遺傳背景鑒定，經(jīng)回接活化后，菌絲粗壯且無(wú)明顯間隔，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛，PDA培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢(圖1A)，菌落整體呈現(xiàn)粉紅色，背面呈紅褐色，新生氣生菌絲顏色較淺，棉絮狀至絨狀(圖1B).蘋(píng)果染病后，侵染部位塌陷腐爛，呈黃褐色(圖1C)，25 ℃條件下病斑擴(kuò)展迅速，10 d左右即可達(dá)到3 cm以上(圖1D).在PDA培養(yǎng)基上，菌絲擴(kuò)展更為迅速，10 d左右菌落直徑已經(jīng)超過(guò)6 cm(圖1E).由此推斷，本實(shí)驗(yàn)中F.acuminatum處于正常的生理狀態(tài)，有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)開(kāi)展.

A：菌絲形態(tài)；B：菌落形態(tài)；C：侵染蘋(píng)果果實(shí)表型；D：活體侵染速度；E：體外菌落擴(kuò)展速度.圖1 Fusarium acuminatum生理狀態(tài)Fig.1 Physiological state of Fusarium acuminatum

2.2 F. acuminatum菌絲中小RNA測(cè)序分析

培養(yǎng)36 h的F.acuminatum菌絲經(jīng)BGISEQ-500測(cè)序分析后，共獲得30 000 000個(gè)原始序列，其中包含1 294 958個(gè)低質(zhì)量序列、1 399 790個(gè)無(wú)效接頭序列、267個(gè)PolyA序列、3 193 954個(gè)有效長(zhǎng)度序列.有效序列中包含24 111 031個(gè)clean tag，占有效序列的80.37%，且98.8%的clean tag的質(zhì)量值高于20(圖2A)，表明測(cè)序質(zhì)量較好.通過(guò)對(duì)clean tag長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，小RNA的長(zhǎng)度主要分布在18～28 nt之間，其中長(zhǎng)度在20～22 nt的小RNA數(shù)量最多(圖2C).通過(guò)與已知小RNA數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，共有16 540 060個(gè)小RNA(有效序列的68.60%)能夠與基因組匹配.注釋統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，位于基因間隔區(qū)域的小RNA數(shù)量最多，無(wú)注釋小RNA(unmap)、其他sncRNA、核糖體RNA(rRNA)、外顯子(exon)、內(nèi)含子(intron)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)、miRNA前體(precursor)、snRNA、snoRNA以及成熟的miRNA的數(shù)量依次減少(圖2B).

A：堿基質(zhì)量分布圖，每個(gè)點(diǎn)表示此位置達(dá)到某一質(zhì)量的堿基總數(shù)，顏色越深表示數(shù)目越多；B：小RNA分類(lèi)注釋?zhuān)籆：小RNA長(zhǎng)度分布.圖2 Fusarium acuminatum中小RNA測(cè)序結(jié)果Fig.2 Small RNA sequencing result in Fusarium acuminatum

2.3 miRNA及siRNA預(yù)測(cè)分析

通過(guò)與miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)中已知miRNA成熟體比對(duì)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)已知miRNA的成熟體和前體為miR-466i-5p，成熟體序列為T(mén)GTGTGTGTGTGTGTGTGTG.基于miRNA前體能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，對(duì)其余未知的sRNA進(jìn)行miRNA預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)了11個(gè)新的miRNA，其二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖3所示，序列信息如表1所示.預(yù)測(cè)的miRNA首位堿基無(wú)明顯偏好性，其他位置的堿基偏好性如圖4A所示.結(jié)合已經(jīng)報(bào)道的siRNA堿基特性，共預(yù)測(cè)了6 503個(gè)潛在的siRNA，首位堿基為A的siRNA數(shù)量最高而為U的數(shù)量最少.其他位置的堿基偏好性如圖4B所示.

A—K表示預(yù)測(cè)的新miRNAs novel_mir1至novel_mir11.圖3 預(yù)測(cè)miRNAs前體的莖環(huán)結(jié)構(gòu)Fig.3 Precursor structures of predicted novel miRNAs

表1 預(yù)測(cè)新的miRNAs信息Tab.1 Information of predicted novel miRNAs

A：miRNA；B：siRNA圖4 miRNA和siRNA序列中的堿基分布Fig.4 The base distribution in predicted novel miRNA and siRNA sequences

2.4 miRNA靶基因的預(yù)測(cè)及功能分析

通過(guò)TAPIR軟件預(yù)測(cè)到143個(gè)靶基因，通過(guò)TargetFinder軟件預(yù)測(cè)到129個(gè)靶基因，其中123個(gè)基因得到了兩種軟件的支持.通過(guò)GO富集分析發(fā)現(xiàn)，靶標(biāo)基因多定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞器，具有結(jié)合或催化活性，主要參與到細(xì)胞周期和代謝途徑中(圖5)；Pathway富集分析發(fā)現(xiàn)，參與MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、自體吞噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工的靶基因數(shù)量較多，參與類(lèi)倍半萜烯及三萜生物合成以及類(lèi)胡蘿卜素合成的靶基因的富集因子較高(圖6).

圖5 miRNA靶標(biāo)基因GO功能分類(lèi)Fig.5 GO functional classification of miRNA targets

富集因子表示sRNA的靶標(biāo)基因位于該代謝途徑的基因數(shù)目與所有有注釋基因中位于該條目基因總數(shù)的比值.富集因子值越高，表明富集程度越大.Q值是多重假設(shè)檢驗(yàn)校正后的p值，越接近零，表示富集越顯著.圖6 miRNA靶標(biāo)基因pathway富集統(tǒng)計(jì)Fig.6 Statistics of pathway enrichment of miRNA targets

3 討論

銳頂鐮孢菌作為一種常見(jiàn)致病菌，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大的危害，早期的研究主要集中于該致病菌的生理特性、進(jìn)化分類(lèi)以及宿主的鑒定，而在分子水平的相關(guān)研究鮮有報(bào)道[25-27].本研究通過(guò)高通量小RNA測(cè)序，預(yù)測(cè)了11個(gè)新的miRNA和6 503個(gè)潛在的siRNA.

miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度在20～24 nt的小RNA，由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA經(jīng)Dicer酶加工而成，5’端具有磷酸基而3’端為羥基，每個(gè)miRNA可能有多個(gè)靶基因，多個(gè)miRNAs可以協(xié)同精細(xì)調(diào)節(jié)同一基因，其調(diào)控基因的主要方式有3種：第一種是與靶基因的mRNA互補(bǔ)結(jié)合并切割，第二種是與靶基因的mRNA部分結(jié)合阻遏靶基因的翻譯，第三種是前兩種方式的結(jié)合[28-30].本研究中，檢測(cè)到一個(gè)已知的miRNA為miR-466i-5p，其功能主要與人類(lèi)的疾病相關(guān)，在真菌中還未見(jiàn)該miRNA的相關(guān)報(bào)道.Liao等發(fā)現(xiàn)該miRNA能夠與miR-466K和長(zhǎng)鏈非編碼RNA Kcnqlotl結(jié)合，提高調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Tead1的表達(dá)，誘發(fā)低氧引起的心肌細(xì)胞損傷[31].Wang等發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺處理后，SP+肺癌細(xì)胞中miR-466i-5p表達(dá)顯著上升，表明該miRNA與肺癌細(xì)胞的增殖密切相關(guān)[32].本實(shí)驗(yàn)共預(yù)測(cè)到miR-466i-5p靶基因152個(gè)，其中29個(gè)具有明確功能，包括GTPase、transcription factor、transporter、reductase、coenzyme A、transferase、kinase、dehydrogenase、ATPase、epimerase等，涉及多種代謝途徑，表明miR-466i-5p對(duì)病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的意義.此外新發(fā)現(xiàn)的11個(gè)miRNA中，根據(jù)序列信息及結(jié)構(gòu)，novel_mir2、novel_mir3、novel_mir4以及novel_mir11也預(yù)測(cè)到了潛在靶標(biāo)，通過(guò)生物信息學(xué)分析，這些miRNA的靶基因多定位于細(xì)胞膜組織，具有催化或結(jié)合活性，主要與代謝相關(guān).siRNA是一類(lèi)細(xì)胞內(nèi)被RNaseⅢ(Dicer)切割成長(zhǎng)度為20～25 bp的雙鏈RNA，具有兩個(gè)突出核苷酸的羥基化3’末端和磷酸化5’末端.siRNA首先會(huì)與其他蛋白質(zhì)形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)，正義RNA被內(nèi)切核酸酶切割，保留的反義鏈將與其互補(bǔ)的靶mRNA結(jié)合并誘導(dǎo)mRNA切割，導(dǎo)致mRNA降解進(jìn)而沉默靶基因.已知的siRNA主要通過(guò)RNA干擾的方式調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)[33-35].本研究在F.acuminatum細(xì)胞中共預(yù)測(cè)了6 503個(gè)潛在的siRNAs，長(zhǎng)度集中于19～24 nt，已有數(shù)據(jù)對(duì)其堿基偏好性進(jìn)行了評(píng)估，但這些siRNAs的具體功能和作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討.

本研究結(jié)合miRNA和siRNA預(yù)測(cè)結(jié)果以及大量的未注釋及其他類(lèi)型的sRNA，較為全面地探討了F.acuminatum細(xì)胞內(nèi)sRNA的組成、長(zhǎng)度分布、堿基偏好性、分類(lèi)和潛在的調(diào)控靶標(biāo)，為今后研究F.acuminatum侵染結(jié)構(gòu)形成、致病因子產(chǎn)生、定殖以及擴(kuò)散等特定過(guò)程的時(shí)序性調(diào)控提供了理論基礎(chǔ)，有助于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中合理有效防治F.acuminatum引起的病害.

第21卷第4期2022年7月杭州師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)Journal of Hangzhou Normal University(Natural Science Edition)Vol.21 No.4Jul. 2022