鄭苗苗，趙振鵬，王 慧

(皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

0 引言

一般情況下，有機(jī)配體和金屬配合物可在稀的非水溶液中發(fā)出明亮熒光，但在濃溶液或聚集態(tài)下因聚集引起猝滅(ACQ)現(xiàn)象而發(fā)出極微的熒光.2001年，唐本忠教授研究組報(bào)道了一種稱為“聚集誘導(dǎo)熒光增強(qiáng)”(AIE)效應(yīng)的新現(xiàn)象，正好與ACQ相反，即在良性溶劑中大多不發(fā)光，在聚集態(tài)或固態(tài)下發(fā)出強(qiáng)烈的熒光而廣受研究者的關(guān)注[1-3].近年來，有不少的發(fā)光金屬配合物被研究出來，但大多都是發(fā)藍(lán)綠光，發(fā)紅光的金屬配合物十分有限.在OLED中，紅光帶隙較藍(lán)綠光窄，激子極其容易發(fā)生非輻射躍遷而猝滅；在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，因細(xì)胞自身易存在藍(lán)綠色自熒光干擾，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)難以進(jìn)行[4-5].因此，對(duì)具有穿透能力強(qiáng)、激發(fā)能量低、背景熒光干擾小等優(yōu)勢(shì)的紅光AIE材料進(jìn)行研究有著重要的科學(xué)意義.

金屬釕(Ⅱ)配合物因具有較大的斯托克斯位移、優(yōu)秀的光穩(wěn)定性、長(zhǎng)的熒光壽命等優(yōu)勢(shì)，在光電轉(zhuǎn)化材料、生物細(xì)胞成像、生物分子及離子熒光探針、抗癌藥物、靶向檢測(cè)與給藥等應(yīng)用中脫穎而出[6-7]，逐漸成為諸多領(lǐng)域研究的熱門.

本文以鄰菲啰啉為母體，設(shè)計(jì)合成了一種具有AIE性質(zhì)的釕配合物1(圖1).結(jié)合理論計(jì)算，研究了配合物1的光學(xué)性質(zhì)及AIE性質(zhì)，初步探索了配合物1在活細(xì)胞和固定細(xì)胞中的細(xì)胞成像.

圖1 配合物1的合成路線圖Fig.1 The synthetic route of complex 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器試劑：鄰菲啰啉(99 %)，乙基香蘭素(98 %)，三氯化釕水合物(35.0%—42.0 % Ru basis)，六氟磷酸鉀(99 %)，其他試劑和藥品皆為分析純，購(gòu)于上海阿拉丁試劑有限公司，實(shí)驗(yàn)用水為超純水.儀器：Bruker Avance 400 型核磁共振儀；TCS SP 8 型共聚焦顯微成像系統(tǒng)；Nicolet FT-IR-is5 型傅里葉變換紅外光譜儀；UV-5900 PC型紫外光譜儀；Finnigan LCQ 型質(zhì)譜儀(ESI源)；HITACHI F-4600 型熒光光譜儀；Infinite 200 pro 型酶標(biāo)儀.

1.2 配合物1的合成配體L合成見參考文獻(xiàn)[8].氮?dú)獗Ｗo(hù)下，稱取M3(0.17g,0.35 mmol)，L(0.11g，0.33 mmol)，50 mL甲醇和10 mL二氯甲烷置于三口燒瓶中，65℃下反應(yīng)24 h后，向燒瓶中加入六氟磷酸鉀 (0.92g，5 mmol)，繼續(xù)反應(yīng)4 h.反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去溶劑，所得固體用20 mL二氯甲烷溶解，減壓抽濾除去無機(jī)鹽，所得濾液經(jīng)硅膠柱層析分離，洗脫劑為二氯甲烷∶甲醇=50∶1，得紅色固體 0.12 g.IR (KBr, cm-1): 3473,2924,2852,2361,1976,1600,1524,1366,1196,1144,1038,838,719,556.1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 14.07 (s,1 H),9.72 (s,1 H),9.06 (d,J=8.1 Hz,2 H),8.78 (d,J=8.1 Hz,4 H),8.40 (s,4 H),8.19—7.96 (m,7 H),7.86—7.74 (m,8 H),7.05 (d,J=8.2 Hz,1 H),5.77 (s,1 H),4.20 (q,J=6.8 Hz,2 H),1.44 (t,J=6.9 Hz,3 H). ESI-MS: 計(jì)算值1109.82；實(shí)驗(yàn)值819.1581[M-2PF6-]+.

1.3 光學(xué)性質(zhì)測(cè)試以二甲基亞砜作溶劑，將配合物1配制濃度為1.0 mmol /L的母液.移取50 μL母液，置于5 mL容量瓶中，分別用苯、四氫呋喃(THF)、乙酸乙酯(EA)、乙醇(EtOH)、乙腈、二甲基亞砜(DMSO)、PBS緩沖溶液定容至5 mL.在紫外可見吸收和熒光光譜測(cè)試中配制的配合物1濃度均為10 μmol /L.熒光光譜測(cè)試條件激發(fā)波長(zhǎng)為 456 nm，狹縫寬度均為 10.0 nm，電壓為 500 V.

1.4 細(xì)胞成像測(cè)試將可傳代的人肝癌細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)接種于激光共聚焦小皿中，待細(xì)胞密度漲至50%—60%時(shí)，進(jìn)行如下兩組實(shí)驗(yàn)：1) 將配合物1與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng) 30 min，用PBS緩沖溶液洗滌3遍；2) 移去孔中培養(yǎng)基，用PBS緩沖溶液洗滌2遍，加入1 mL4%的多聚甲醛溶液室溫下培養(yǎng)20 min，移去多聚甲醛，用PBS洗滌2遍，然后加入含有配合物1的新鮮培養(yǎng)基，共孵育30 min后，用PBS洗滌2遍.其中配合物1的濃度為10 μmol/L.

2 結(jié)果與討論

2.1 光學(xué)性質(zhì)

圖2是配合物1在7種不同極性溶劑中紫外可見吸收光譜和熒光光譜.從圖2A可以看出，隨著溶劑極性的增加，配合物1吸收峰位置和吸光度均沒有發(fā)生明顯的變化.配合物1的最大吸收峰在456 nm左右，有可能是配體和金屬之間的電荷轉(zhuǎn)移混有配體內(nèi)的電荷轉(zhuǎn)移躍遷[9].為了進(jìn)一步佐證吸收峰的電子躍遷歸屬，采用密度泛函理論(B3LYP)對(duì)配合物1的躍遷過程進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算采用G09程序包，6-31G對(duì)C、H、N、O原子及LANL2DZ對(duì)Ru原子.如圖3所示，理論計(jì)算得出配合物1的最大吸收峰在449 nm左右，是HOMO到LUMO的躍遷，其中HOMO軌道的電子云主要集中在配體L上，LUMO軌道上的電子云主要集中在鄰菲啰啉配體、釕原子及配體L上，可歸屬于LMCT(配體到金屬的躍遷)、ICT(分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移躍遷)及L1L2CT(配體到配體之間的電荷轉(zhuǎn)移躍遷，L1為配體L，L2為鄰菲啰啉)躍遷的混合.

圖2 配合物1在7種不同極性溶劑中的紫外可見吸收光譜(A)和熒光光譜(B)Fig.2 UV-vis absorption (A) and fluorescence spectra (B) of complex 1 in seven different solvents

圖3 配合物1的分子軌道能級(jí)圖Fig.3 The molecular orbital energy diagram for complex1

從圖2B可以看出，配合物1的最大熒光發(fā)射峰位置隨溶劑極性增加變化不大，其最大熒光發(fā)射峰在600 nm，屬于紅光區(qū).相較于其他溶劑，配合物1在PBS中的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，約是乙醇的5倍.

2.2 聚集誘導(dǎo)熒光性質(zhì)

從上述結(jié)果可以看出，配合物1在水中的熒光強(qiáng)度高于其他溶劑，這可能是由于聚集誘導(dǎo)熒光導(dǎo)致的.為了進(jìn)一步驗(yàn)證配合物1是否具有AIE性質(zhì)，我們選擇配合物1的良性溶劑乙醇和不良溶劑水，作為測(cè)試的混合溶劑.用移液槍移取配合物1的母液50 μL，置于5 mL的容量瓶中，用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇/水定容至5 mL，配成一系列不同含水量(fw=0%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，99%)的混合溶液，測(cè)試配合物1的熒光光譜(見圖4).如圖5所示，隨著含水量的增加，配合物1的熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出先降低后增強(qiáng)再降低的現(xiàn)象.當(dāng)含水量小于10 %時(shí)，配合物1的熒光強(qiáng)度逐漸降低，造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于水含量增加，使得溶劑極性增大，從而誘導(dǎo)了ICT過程[10].當(dāng)含水量大于10 %時(shí)，配合物1的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)含水量達(dá)到80 %時(shí)，其熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，約是純乙醇的5.2 倍，這種現(xiàn)象可解釋為當(dāng)向整個(gè)體系中加入大量水時(shí)，配合物分子可快速聚集成團(tuán)，內(nèi)部的分子與外界環(huán)境隔離，形成了一種非極性的環(huán)境，使得分子內(nèi)扭轉(zhuǎn)的電荷轉(zhuǎn)移被抑制，因而熒光重新增強(qiáng)[11].當(dāng)含水量超過80 %時(shí)，配合物1的熒光強(qiáng)度出現(xiàn)降低的現(xiàn)象，可能是由于當(dāng)含水量增加到一定程度時(shí)，溶液中的配合物迅速聚集并沉淀下來，使得溶液中的發(fā)光物質(zhì)減少，最終導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低，這種現(xiàn)象其他課題組也有報(bào)道[12-13].

圖4 配合物1在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇/水混合溶液中的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of complex 1 in ethanol/H2O mixture solutions圖5 配合物1的熒光強(qiáng)度與水體積分?jǐn)?shù)(fw)之間的關(guān)系Fig.5 Plot of fluorescence intensity values of complex 1 in different water fraction

2.3 細(xì)胞毒性及細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步探索配合物1作為生物熒光探針的可能性，首先采用MTT法測(cè)試了配合物1的細(xì)胞毒性，具體的測(cè)試條件見參考文獻(xiàn)[14].從圖6中得知，當(dāng)配合物1與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，在濃度為4—25 μmol/L范圍內(nèi)下，細(xì)胞存活率均達(dá)到85%以上，表明配合物1具有較低的生物毒性，可進(jìn)一步應(yīng)用于細(xì)胞成像研究.

圖6 配合物1與HepG2共培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞毒性測(cè)試Fig.6 Thecytotoxicity experiment of complex 1 after incubation with HepG2 for 24 h標(biāo)尺為20 μm.圖7 配合物1在活的HepG2細(xì)胞和固定的HepG2細(xì)胞中的激光共聚焦顯微成像圖Fig.7 The confocal images of complex 1 in living and fixed HepG2 cells

圖7是配合物1與活的HepG2細(xì)胞和固定的HepG2細(xì)胞共同培養(yǎng)30 min后共聚焦顯微成像圖.由圖可知，配合物1在活的HepG2細(xì)胞中僅表現(xiàn)出微弱熒光，從疊加圖中可以看出，熒光來源主要集中在細(xì)胞膜區(qū)域，可能是由于配合物分子較大，不利于其進(jìn)入活體細(xì)胞.將配合物1作用于固定的HepG2細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞中展現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光，而且可全部著色細(xì)胞，可能是由于細(xì)胞被多聚甲醛固定后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，有利于配合物進(jìn)入細(xì)胞.此結(jié)果表明配合物1可對(duì)固定后的細(xì)胞進(jìn)行顯影.

3 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)合成了一種新型的鄰菲啰啉釕配合物1，借助紫外可見吸收光譜、熒光光譜和理論計(jì)算，研究了配合物1的光學(xué)性質(zhì)及AIE性質(zhì).結(jié)果表明，配合物1展現(xiàn)出明顯的AIE性質(zhì)，當(dāng)含水量達(dá)到80%時(shí)，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，其發(fā)射波長(zhǎng)在600 nm，屬于紅光區(qū).細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明配合物1具有較低的細(xì)胞毒性，可在固定細(xì)胞中全部著色.本研究為設(shè)計(jì)合成具有AIE性質(zhì)的釕配合物提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).