孟 克，白偉琴，卡楚拉，烏志勇，苗 苗，格日勒圖

（1.伊金霍洛旗動物疫病預防控制中心，內(nèi)蒙古 伊金霍洛旗 017200；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010018）

豬 流 行 性 腹 瀉 （porcine epidemic diarrhea，PED） 是由冠狀病毒豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的高度接觸性腸道傳染?。?］。 該病最早發(fā)現(xiàn)于歐洲，后期擴散至養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達的亞洲東部地區(qū)， 造成的危害比原發(fā)地歐洲嚴重［2］。 PEDV 能感染各個年齡段的豬，被感染豬會出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、脫水、厭食等癥狀，引起哺乳仔豬近100%的死亡率，給世界各國的養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失［3］。 控制PEDV 有效方法是疫苗接種［4］。 PEDV 的spike（S）蛋白是一種Ⅰ型膜糖蛋白，由1 383～1 386 個氨基酸（aa）組成［5］。根據(jù)與其他冠狀病毒S 蛋白的同源性，S 蛋白可分為S1（1～735aa）和S2（736～1 383aa）結構域［6］。 與其他冠狀病毒S 蛋白一樣，PEDV 的S 蛋白在介導病毒進入宿主體內(nèi)并誘導產(chǎn)生中和抗體時［7］，能與細胞受體相互作用。 2011 年以來， 傳統(tǒng)的PEDV 減毒疫苗對新出現(xiàn)的PEDV 毒株的血清抗體滴度通常較低， 表明經(jīng)典PEDV 毒株疫苗只能對部分毒株產(chǎn)生交叉免疫［8］，不能誘導特異性IgA抗體產(chǎn)生黏膜免疫［9］。 該試驗旨在利用軟件分析PEDV S2 基因B 細胞表位，并通過免疫小鼠、細胞融合等方法制備單克隆抗體， 為表位肽疫苗研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 多肽抗原、細胞株

多肽抗原的合成及耦聯(lián)載體鑰孔血藍蛋白（KLH）由吉爾（上海）生化有限公司完成；小鼠骨髓瘤細胞（Sp2/0）由吉爾生化（上海）有限公司抗體部提供。

1.1.2 主要試劑

RPMI1640 培養(yǎng)基、 胎牛血清 （FBS） 購自GIBCO 公司； 辣根過氧化物酶標記驢抗鼠IgG 購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.1.3 實驗動物

5 只6 周齡的雌性BALB/c 小鼠，由上海第一人民醫(yī)院（松江）動物實驗中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 PEDV S2 基因B 細胞表位的篩選

利用CLC Sequence viewer 6.8 軟件和數(shù)據(jù)庫IEDB［http：//www.iedb.org/］，參考PEDV 國內(nèi)外分離株，篩選出PEDV S2 基因的保守序列。 結合在線數(shù)據(jù)庫IEDB 分析出能夠與主要組織相容性復合體（MHC）Ⅱ類分子結合的B 細胞表位，委托吉爾生化（上海） 有限公司進行多肽抗原的合成與KLH 的耦聯(lián)。

1.2.2 動物免疫及抗體效價測定

選取5 只6 周齡健康的雌性BALB/c 小鼠（分別標記A、B、C、D、E），篩選的表位合成后耦聯(lián)鑰孔血藍蛋白（KLH）以100 μg/只免疫BALB/c 小鼠，第1 次免疫后每隔2 周以50 μg/只免疫1 次，共進行5 次免疫。 第5 次免疫1 周后取小鼠血清，用ELISA 方法檢測血清的抗體效價，分別以未接受免疫的小鼠血清和抗體稀釋液作為陰性對照和空白對照。 選取抗體效價最高的小鼠加強免疫1 次。

1.2.3 雜交瘤細胞的建立

細胞融合前2 周內(nèi)將Sp2/0 細胞進行復蘇，置于5%CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)。用含有8-氮鳥嘌呤的培養(yǎng)基連續(xù)處理3 次，篩選出對HAT 培養(yǎng)基更敏感的Sp2/0 細胞， 用于細胞融合的Sp2/0 細胞在融合前1 天進行1 次傳代，可使融合當天的Sp2/0 細胞處于對數(shù)生長期。 細胞融合當天， 取8～10 周齡健康的BALB/c 小鼠腹腔巨噬細胞，調(diào)整細胞濃度至1×105～5×105個/mL，以100 μL/孔加入96 孔細胞培養(yǎng)板進行培養(yǎng)。 無菌操作摘取加強免疫小鼠的脾臟， 制備脾細胞懸液進行計數(shù)。 混勻的Sp2/0 細胞和脾細胞懸液經(jīng)聚乙二醇進行細胞融合，隨后轉入96 孔細胞培養(yǎng)板，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞融合后需要觀察雜交瘤細胞的生長，當細胞長到孔底1/4～1/3 的時候取細胞培養(yǎng)物上清液進行ELISA 檢測。 以未免疫小鼠血清作為陰性對照，用抗體稀釋液作為空白對照，試驗組OD450nm值（P）與陰性對照組OD450nm值（N）的比值大于2.1（P/N≥2.1）作為陽性判斷標準。采用有限稀釋法選擇克隆數(shù)少、OD450nm值高的陽性孔進行1～2 次的克隆化培養(yǎng)， 直到所有克隆化培養(yǎng)的細胞孔陽性率達到100%，即可獲得分泌特異單克隆抗體的細胞株。

1.2.4 雜交瘤細胞的培養(yǎng)及保存

經(jīng)克隆化培養(yǎng)的細胞孔陽性率達到100%時，將細胞從96 孔培養(yǎng)板轉入24 孔培養(yǎng)板，再由24孔培養(yǎng)板轉至細胞培養(yǎng)瓶進行擴大培養(yǎng)。 經(jīng)擴大培養(yǎng)的雜交瘤細胞一部分以腹腔注射的方式免疫小鼠，使其體內(nèi)產(chǎn)生腹水，一部分采用液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 抗體效價測定

用ELISA 方法測定被免疫小鼠腹水及單克隆細胞株培養(yǎng)物上清液的抗體效價。 以2 的倍數(shù)將腹水和細胞培養(yǎng)物上清液進行梯度稀釋，分別以未接受免疫的小鼠血清和稀釋液作為陰性對照和空白對照，抗體效價為P/N≥2.1 的最大稀釋倍數(shù)。

2 結果與分析

2.1 表位篩選結果

應用CLC Sequence viewer 6.8 軟件篩選出PEDV S2 基因的若干條保守序列，再通過IEDB 數(shù)據(jù)庫篩選出能與MHCⅡ類分子結合的B 細胞表位，篩選得到的表位基因序列為5′-ATGCAATATGTT（C）TATACACCTACCTACTACATGCTT-3′，國內(nèi)外分離株的區(qū)別為1 處堿基T 和C 的置換（見圖1A），但是翻譯后的肽段序列相同，表位肽序列為MQYVYTPTYYML（見圖1B）。 保守序列的選擇可以有效避免流行毒株在傳播過程中產(chǎn)生基因變異。 結合IEDB 數(shù)據(jù)庫篩選出的能與MHCⅡ類分子結合的表位，結果也能篩選出與圖1B 中對應的MQYVYTPTYYML 肽段（見圖1 C），由于MHCⅡ-Ag 更容易向輔助T 細胞呈遞抗原， 篩選能與MHCⅡ類分子結合的表位更有希望觸發(fā)細胞和體液免疫兼?zhèn)涞拿庖邞稹?/p>

2.2 融合前抗體效價的檢測

應用ELISA 方法測定第5 次免疫后1 周的小鼠血清抗體效價，結果顯示5 只小鼠中E 小鼠的血清抗體效價相比其他4 只小鼠較高， 約為1∶2 000（見圖2），因此，取E 小鼠進行1 次加強免疫，并于3 d 后摘取脾臟進行細胞融合。

圖2 細胞融合前血清抗體效價（k=1 000）

2.3 單克隆細胞株的篩選

進行細胞融合后， 取6 組雜交瘤細胞株培養(yǎng)物上清液經(jīng)ELISA 方法測定OD450nm值。 結果顯示，6 組細胞株中E-6 細胞株培養(yǎng)物上清液檢測值最高，達到0.526（見表1）。

表1 細胞培養(yǎng)物上清液OD450 nm 值

2.4 腹水抗體效價的檢測

腹腔注射單克隆細胞株后收集腹水用Protein G 純化抗體。 ELISA 結果顯示，腹水抗體效價約為1∶4 000（見表2）。

表2 單克隆抗體雜交瘤細胞（E-6 株）腹水效價

2.5 細胞培養(yǎng)物上清液抗體效價的檢測

細胞培養(yǎng)物上清液經(jīng)ELISA 方法測定， 結果顯示細胞上清液抗體效價達到1∶4 000 （見表3），與腹水抗體效價相同。

表3 單克隆抗體雜交瘤細胞（E-6 株）培養(yǎng)物上清液抗體效價

3 討論

PED 是威脅全球養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重大疫病之一，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的威脅。 PEDV 感染能力極強，主要傳播途徑為消化道和呼吸道［10］，該病主要多發(fā)于新生仔豬造成重大損失。 新生仔豬由于免疫系統(tǒng)還未發(fā)育完善， 通過免疫母豬經(jīng)初乳獲得被動免疫力［11］。近年來，國內(nèi)外研究者做了大量關于PEDV 疫苗的研究工作， 研制了不同種類的疫苗， 但是免疫保護效果不甚理想［12］， 因為PEDV 流行毒株在傳播過程中出現(xiàn)基因變異［13］，以及制備的疫苗抗原觸發(fā)的免疫應答特異性不強、中和抗體效率不佳。 PEDV 通常編碼4 個結構蛋白，分別為核蛋白（N）、膜蛋白（M）、糖蛋白（S）、小膜蛋白（sM）［14］，S 糖蛋白分子量最大。 目前，確定的多個抗原表位和中和表位多位于S1 蛋白區(qū)域，其結構與功能方面的研究最為深入［15］。已有的研究主要針對PEDV S 蛋白S1 區(qū)域的功能，而對PEDV S 蛋白S2 區(qū)域的抗原性等功能研究較少［16］。 該研究應用CLC Sequence Viewer 6.8 軟件分析若干個國內(nèi)外流行株的PEDV S2 基因保守肽段的同時， 利用IEDB 數(shù)據(jù)庫比對出與MHCⅡ類分子結合的肽段MQYVYTPTYYML 作為制備單克隆抗體的靶位肽序列， 雖然選定的MQYVYTPTYYML 肽序列經(jīng)軟件分析免疫原性不高，但是選定與MHCⅡ類分子有效匹配的肽序列尤為重要，因為MHCⅡ-Ag 容易向輔助T 細胞呈遞抗原， 從而有望觸發(fā)細胞和體液免疫兼?zhèn)涞拿庖邞稹?在該試驗中， 人工合成的表位肽純度為97.18%， 通過載體耦聯(lián)后免疫小鼠的抗體效價最高值可達到1:2 000，OD450nm值為0.309，雖然表現(xiàn)出了有限的抗原性， 但是能夠滿足制備單克隆抗體的需求。 取免疫小鼠脾臟制備脾細胞懸液進行瘤細胞融合，并制備單克隆抗體，在小鼠腹水和雜交瘤細胞培養(yǎng)物上清液中檢測到的抗體效價能達到1∶4 000，可以滿足檢測工作的要求。 備選多肽MQYVYTPTYYML 有限抗原性的原因之一是表位肽本身表位構象特征不夠強， 其二是與載體鑰孔血藍蛋白耦聯(lián)后其表位構象也受到一定影響，可解決方案為在其他靶基因序列上尋找理想的表位肽序列， 或作為載體蛋白， 篩選能夠提高免疫原性、具有佐劑活性的蛋白（如細菌S-層蛋白等）。

4 結論

通過生物學軟件和在線數(shù)據(jù)庫成功篩選出了PEDV S2 基因B 細胞表位：MQYVYTPTYYML，經(jīng)單克隆抗體制備技術成功制備B 細胞表位單克隆抗體，抗體效價達到1∶4 000，為今后表位肽疫苗的探索性研究提供了基礎數(shù)據(jù)。