孟 克，白偉琴，卡楚拉，烏志勇，苗 苗，格日勒?qǐng)D

（1.伊金霍洛旗動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 伊金霍洛旗 017200；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010018）

豬 流 行 性 腹 瀉 （porcine epidemic diarrhea，PED） 是由冠狀病毒豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的高度接觸性腸道傳染病［1］。 該病最早發(fā)現(xiàn)于歐洲，后期擴(kuò)散至養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的亞洲東部地區(qū)， 造成的危害比原發(fā)地歐洲嚴(yán)重［2］。 PEDV 能感染各個(gè)年齡段的豬，被感染豬會(huì)出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、脫水、厭食等癥狀，引起哺乳仔豬近100%的死亡率，給世界各國(guó)的養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［3］。 控制PEDV 有效方法是疫苗接種［4］。 PEDV 的spike（S）蛋白是一種Ⅰ型膜糖蛋白，由1 383～1 386 個(gè)氨基酸（aa）組成［5］。根據(jù)與其他冠狀病毒S 蛋白的同源性，S 蛋白可分為S1（1～735aa）和S2（736～1 383aa）結(jié)構(gòu)域［6］。 與其他冠狀病毒S 蛋白一樣，PEDV 的S 蛋白在介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主體內(nèi)并誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體時(shí)［7］，能與細(xì)胞受體相互作用。 2011 年以來(lái)， 傳統(tǒng)的PEDV 減毒疫苗對(duì)新出現(xiàn)的PEDV 毒株的血清抗體滴度通常較低， 表明經(jīng)典PEDV 毒株疫苗只能對(duì)部分毒株產(chǎn)生交叉免疫［8］，不能誘導(dǎo)特異性IgA抗體產(chǎn)生黏膜免疫［9］。 該試驗(yàn)旨在利用軟件分析PEDV S2 基因B 細(xì)胞表位，并通過(guò)免疫小鼠、細(xì)胞融合等方法制備單克隆抗體， 為表位肽疫苗研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 多肽抗原、細(xì)胞株

多肽抗原的合成及耦聯(lián)載體鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）由吉爾（上海）生化有限公司完成；小鼠骨髓瘤細(xì)胞（Sp2/0）由吉爾生化（上海）有限公司抗體部提供。

1.1.2 主要試劑

RPMI1640 培養(yǎng)基、 胎牛血清 （FBS） 購(gòu)自GIBCO 公司； 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記驢抗鼠IgG 購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5 只6 周齡的雌性BALB/c 小鼠，由上海第一人民醫(yī)院（松江）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PEDV S2 基因B 細(xì)胞表位的篩選

利用CLC Sequence viewer 6.8 軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)IEDB［http：//www.iedb.org/］，參考PEDV 國(guó)內(nèi)外分離株，篩選出PEDV S2 基因的保守序列。 結(jié)合在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)IEDB 分析出能夠與主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅱ類(lèi)分子結(jié)合的B 細(xì)胞表位，委托吉爾生化（上海） 有限公司進(jìn)行多肽抗原的合成與KLH 的耦聯(lián)。

1.2.2 動(dòng)物免疫及抗體效價(jià)測(cè)定

選取5 只6 周齡健康的雌性BALB/c 小鼠（分別標(biāo)記A、B、C、D、E），篩選的表位合成后耦聯(lián)鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）以100 μg/只免疫BALB/c 小鼠，第1 次免疫后每隔2 周以50 μg/只免疫1 次，共進(jìn)行5 次免疫。 第5 次免疫1 周后取小鼠血清，用ELISA 方法檢測(cè)血清的抗體效價(jià)，分別以未接受免疫的小鼠血清和抗體稀釋液作為陰性對(duì)照和空白對(duì)照。 選取抗體效價(jià)最高的小鼠加強(qiáng)免疫1 次。

1.2.3 雜交瘤細(xì)胞的建立

細(xì)胞融合前2 周內(nèi)將Sp2/0 細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，置于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用含有8-氮鳥(niǎo)嘌呤的培養(yǎng)基連續(xù)處理3 次，篩選出對(duì)HAT 培養(yǎng)基更敏感的Sp2/0 細(xì)胞， 用于細(xì)胞融合的Sp2/0 細(xì)胞在融合前1 天進(jìn)行1 次傳代，可使融合當(dāng)天的Sp2/0 細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。 細(xì)胞融合當(dāng)天， 取8～10 周齡健康的BALB/c 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105～5×105個(gè)/mL，以100 μL/孔加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)。 無(wú)菌操作摘取加強(qiáng)免疫小鼠的脾臟， 制備脾細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)。 混勻的Sp2/0 細(xì)胞和脾細(xì)胞懸液經(jīng)聚乙二醇進(jìn)行細(xì)胞融合，隨后轉(zhuǎn)入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合后需要觀察雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到孔底1/4～1/3 的時(shí)候取細(xì)胞培養(yǎng)物上清液進(jìn)行ELISA 檢測(cè)。 以未免疫小鼠血清作為陰性對(duì)照，用抗體稀釋液作為空白對(duì)照，試驗(yàn)組OD450nm值（P）與陰性對(duì)照組OD450nm值（N）的比值大于2.1（P/N≥2.1）作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。采用有限稀釋法選擇克隆數(shù)少、OD450nm值高的陽(yáng)性孔進(jìn)行1～2 次的克隆化培養(yǎng)， 直到所有克隆化培養(yǎng)的細(xì)胞孔陽(yáng)性率達(dá)到100%，即可獲得分泌特異單克隆抗體的細(xì)胞株。

1.2.4 雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)及保存

經(jīng)克隆化培養(yǎng)的細(xì)胞孔陽(yáng)性率達(dá)到100%時(shí)，將細(xì)胞從96 孔培養(yǎng)板轉(zhuǎn)入24 孔培養(yǎng)板，再由24孔培養(yǎng)板轉(zhuǎn)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。 經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞一部分以腹腔注射的方式免疫小鼠，使其體內(nèi)產(chǎn)生腹水，一部分采用液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 抗體效價(jià)測(cè)定

用ELISA 方法測(cè)定被免疫小鼠腹水及單克隆細(xì)胞株培養(yǎng)物上清液的抗體效價(jià)。 以2 的倍數(shù)將腹水和細(xì)胞培養(yǎng)物上清液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e以未接受免疫的小鼠血清和稀釋液作為陰性對(duì)照和空白對(duì)照，抗體效價(jià)為P/N≥2.1 的最大稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 表位篩選結(jié)果

應(yīng)用CLC Sequence viewer 6.8 軟件篩選出PEDV S2 基因的若干條保守序列，再通過(guò)IEDB 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出能與MHCⅡ類(lèi)分子結(jié)合的B 細(xì)胞表位，篩選得到的表位基因序列為5′-ATGCAATATGTT（C）TATACACCTACCTACTACATGCTT-3′，國(guó)內(nèi)外分離株的區(qū)別為1 處堿基T 和C 的置換（見(jiàn)圖1A），但是翻譯后的肽段序列相同，表位肽序列為MQYVYTPTYYML（見(jiàn)圖1B）。 保守序列的選擇可以有效避免流行毒株在傳播過(guò)程中產(chǎn)生基因變異。 結(jié)合IEDB 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的能與MHCⅡ類(lèi)分子結(jié)合的表位，結(jié)果也能篩選出與圖1B 中對(duì)應(yīng)的MQYVYTPTYYML 肽段（見(jiàn)圖1 C），由于MHCⅡ-Ag 更容易向輔助T 細(xì)胞呈遞抗原， 篩選能與MHCⅡ類(lèi)分子結(jié)合的表位更有希望觸發(fā)細(xì)胞和體液免疫兼?zhèn)涞拿庖邞?yīng)答。

2.2 融合前抗體效價(jià)的檢測(cè)

應(yīng)用ELISA 方法測(cè)定第5 次免疫后1 周的小鼠血清抗體效價(jià)，結(jié)果顯示5 只小鼠中E 小鼠的血清抗體效價(jià)相比其他4 只小鼠較高， 約為1∶2 000（見(jiàn)圖2），因此，取E 小鼠進(jìn)行1 次加強(qiáng)免疫，并于3 d 后摘取脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合。

圖2 細(xì)胞融合前血清抗體效價(jià)（k=1 000）

2.3 單克隆細(xì)胞株的篩選

進(jìn)行細(xì)胞融合后， 取6 組雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)物上清液經(jīng)ELISA 方法測(cè)定OD450nm值。 結(jié)果顯示，6 組細(xì)胞株中E-6 細(xì)胞株培養(yǎng)物上清液檢測(cè)值最高，達(dá)到0.526（見(jiàn)表1）。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)物上清液OD450 nm 值

2.4 腹水抗體效價(jià)的檢測(cè)

腹腔注射單克隆細(xì)胞株后收集腹水用Protein G 純化抗體。 ELISA 結(jié)果顯示，腹水抗體效價(jià)約為1∶4 000（見(jiàn)表2）。

表2 單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞（E-6 株）腹水效價(jià)

2.5 細(xì)胞培養(yǎng)物上清液抗體效價(jià)的檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)物上清液經(jīng)ELISA 方法測(cè)定， 結(jié)果顯示細(xì)胞上清液抗體效價(jià)達(dá)到1∶4 000 （見(jiàn)表3），與腹水抗體效價(jià)相同。

表3 單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞（E-6 株）培養(yǎng)物上清液抗體效價(jià)

3 討論

PED 是威脅全球養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重大疫病之一，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的威脅。 PEDV 感染能力極強(qiáng)，主要傳播途徑為消化道和呼吸道［10］，該病主要多發(fā)于新生仔豬造成重大損失。 新生仔豬由于免疫系統(tǒng)還未發(fā)育完善， 通過(guò)免疫母豬經(jīng)初乳獲得被動(dòng)免疫力［11］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者做了大量關(guān)于PEDV 疫苗的研究工作， 研制了不同種類(lèi)的疫苗， 但是免疫保護(hù)效果不甚理想［12］， 因?yàn)镻EDV 流行毒株在傳播過(guò)程中出現(xiàn)基因變異［13］，以及制備的疫苗抗原觸發(fā)的免疫應(yīng)答特異性不強(qiáng)、中和抗體效率不佳。 PEDV 通常編碼4 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核蛋白（N）、膜蛋白（M）、糖蛋白（S）、小膜蛋白（sM）［14］，S 糖蛋白分子量最大。 目前，確定的多個(gè)抗原表位和中和表位多位于S1 蛋白區(qū)域，其結(jié)構(gòu)與功能方面的研究最為深入［15］。已有的研究主要針對(duì)PEDV S 蛋白S1 區(qū)域的功能，而對(duì)PEDV S 蛋白S2 區(qū)域的抗原性等功能研究較少［16］。 該研究應(yīng)用CLC Sequence Viewer 6.8 軟件分析若干個(gè)國(guó)內(nèi)外流行株的PEDV S2 基因保守肽段的同時(shí)， 利用IEDB 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)出與MHCⅡ類(lèi)分子結(jié)合的肽段MQYVYTPTYYML 作為制備單克隆抗體的靶位肽序列， 雖然選定的MQYVYTPTYYML 肽序列經(jīng)軟件分析免疫原性不高，但是選定與MHCⅡ類(lèi)分子有效匹配的肽序列尤為重要，因?yàn)镸HCⅡ-Ag 容易向輔助T 細(xì)胞呈遞抗原， 從而有望觸發(fā)細(xì)胞和體液免疫兼?zhèn)涞拿庖邞?yīng)答。 在該試驗(yàn)中， 人工合成的表位肽純度為97.18%， 通過(guò)載體耦聯(lián)后免疫小鼠的抗體效價(jià)最高值可達(dá)到1:2 000，OD450nm值為0.309，雖然表現(xiàn)出了有限的抗原性， 但是能夠滿(mǎn)足制備單克隆抗體的需求。 取免疫小鼠脾臟制備脾細(xì)胞懸液進(jìn)行瘤細(xì)胞融合，并制備單克隆抗體，在小鼠腹水和雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中檢測(cè)到的抗體效價(jià)能達(dá)到1∶4 000，可以滿(mǎn)足檢測(cè)工作的要求。 備選多肽MQYVYTPTYYML 有限抗原性的原因之一是表位肽本身表位構(gòu)象特征不夠強(qiáng)， 其二是與載體鑰孔血藍(lán)蛋白耦聯(lián)后其表位構(gòu)象也受到一定影響，可解決方案為在其他靶基因序列上尋找理想的表位肽序列， 或作為載體蛋白， 篩選能夠提高免疫原性、具有佐劑活性的蛋白（如細(xì)菌S-層蛋白等）。

4 結(jié)論

通過(guò)生物學(xué)軟件和在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)成功篩選出了PEDV S2 基因B 細(xì)胞表位：MQYVYTPTYYML，經(jīng)單克隆抗體制備技術(shù)成功制備B 細(xì)胞表位單克隆抗體，抗體效價(jià)達(dá)到1∶4 000，為今后表位肽疫苗的探索性研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。