唐軍偉 彭洪 鄭和平 黃梅 龔磊 馬一丹 張燕

(南充市中心醫(yī)院 1.中西醫(yī)結合科；2.肛腸外科；3.胃腸外科，四川 南充 637000)

結直腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤，其早期癥狀并不明顯[1-2]。在全球范圍內(nèi)結直腸癌發(fā)病率僅次于肺癌和胃癌位居第三。結直腸癌從癌前病變(腺瘤)發(fā)展到惡性病灶有一個較長的過程，但是其具體發(fā)病機制尚不清楚，因此闡明結直腸癌的具體發(fā)病機制是一個亟待解決的問題[3-5]。肌球蛋白主要存在于平滑肌中，是肌原纖維粗肌絲的主要組成成分，其分子形態(tài)如豆芽狀，由多條重鏈和多條輕鏈構成[6]。肌球蛋白磷酸酶靶亞基1(Myosin phosphatase-targeting subunit 1，MYPT1)屬于哺乳動物MYPT家族，其功能是調(diào)控亞細胞定位和底物特異性[7-8]。MYPT家族成員有多個共同的保守結構域，包括與催化亞基PP1c結合的RVXF基序和多個錨蛋白重復序列，參與人體多種生理活動，并與腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移密切相關[9-11]。最近的研究發(fā)現(xiàn)MYPT1可能作為miR-30d的直接作用靶點促進前列腺癌的血管生成和腫瘤生長。體內(nèi)實驗也表明MYPT1可下調(diào)VEGF和CD31的表達，并可抑制小鼠微血管內(nèi)皮細胞增殖和腫瘤血管的形成[12]。但是MYPT1在結直腸癌組織中的表達及其與結直腸癌發(fā)生發(fā)展的關系鮮有報道。本研究檢測MYPT1在結直腸癌組織中的表達并分析其與結直腸癌惡性生物學行為的關系，探討MYPT1是否通過RhoA/ROCK信號通路調(diào)控細胞增殖和遷移，以期為結直腸癌的診斷和治療提供新的腫瘤標志物及藥物治療靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人結直腸癌細胞株HCT116、SW480、LOVO與正常人結腸上皮細胞株HCoEpiC購自中國科學院細胞庫(上海，中國)。細胞計數(shù)試劑盒8(CCK8)購自Beyotime公司(上海，中國)。酶標儀購自Bio-Rad公司(Hercules,CA,USA)。10%胎牛血清、TRIzol試劑購自Invitrogen公司(Carlsbad, CA,USA)。RIPA緩沖液購自Thermo Fisher 公司(Waltham, MA, USA)。Cat lgG二抗購自Sungene Biotech公司(上海，中國)。RHOA和ROCK1一抗購自Abcam公司(Cambridge, MA, USA)。Transwell小室購自Corning公司( Costar, CA, USA)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉染 細胞在含有10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)箱中含有5%的CO2，培養(yǎng)溫度為37℃。按照說明書，用慢病毒表達載體在細胞中轉染LV-MYPT1(MYPT1過表達組)、LV-MYPT1 NC(MYPT1陰性對照組)、LV-RhoA(RhoA過表達組)和LV-RhoANC(RhoA陰性對照組)。根據(jù)實驗方案不同進行不同分組。檢測MYPT1對細胞增殖和遷移的影響時分為空白對照組、陰性對照組(LV-MYPT1 NC)及MYPT1過表達組(LV-MYPT1)；檢測MYPT1對RhoA和ROCK1蛋白表達的影響時分為空白對照組和MYPT1過表達組；檢測RhoA對細胞增殖和遷移的影響時分為空白對照組、陰性對照組(LV-RhoA NC)及RhoA過表達組(LV-RhoA)組；檢測MYPT1通過負調(diào)控RhoA抑制ROCK1基因表達和結直腸癌細胞增殖和遷移時分為陰性對照組(LV-MYPT1 NC)、MYPT1過表達組(LV-MYPT1)、MYPT1過表達+RhoA空載組(LV-MYPT1+LV-RhoANC)和MYPT1過表達+RhoA過表達組(LV-MYPT1+LV-RhoA)。

1.2.2 CCK8檢測 采用CCK8法檢測細胞增殖活性。將對數(shù)生長期的細胞收集，消化后計數(shù)，制成密度為5×104cells/mL的細胞懸液，在96孔板上每孔加入100 μL細胞懸液。培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔添加10 μL CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后用酶標儀測量450 nm波長處OD值。

1.2.3 qRT-PCR檢測 根據(jù)說明書使用TRIzol試劑從結直腸癌細胞中提取總RNA,再用MiScript SYBR Green PCR試劑盒進行逆轉錄，使用ABI7500快速實時PCR系統(tǒng)檢測mRNA的相對表達水平，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。引物序列如下：MYPT1：5′-GAGCCTCCGGTGGTGAAG-3′(forward)，5′-GGCAGTGAGTCCGTCCAC-3′(reverse)；ROCK1：5′-AACATGCTGCTGGATAAATCTGG-3′(forward)，R: 5′-TGTATCACATCGTACCATGCC T-3′(reverse)。

1.2.4 Western blot檢測 采用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的放射免疫沉淀分析(RIPA)緩沖液進行蛋白質提取,根據(jù)說明書采用BCA法測量蛋白質濃度。用10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后轉移到PVDF膜上，室溫下用脫脂牛奶或BSA溶液(5%)封閉PVDF膜1 h,然后將膜與一抗在4℃下孵育過夜。第二天用TBST溶液(10 min/次)沖洗PVDF膜3次，然后在室溫下用二抗孵育1 h。使用增強化學發(fā)光底物試劑盒和ImageJ軟件(NIH, Bethesda, Maryland, USA)檢測蛋白表達。用Quantity One V4.6.2軟件(Bio-Rad，USA)分析蛋白灰度值。

1.2.5 Transwell 使用Transwell小室進行細胞遷移能力分析。Transwell小室含有明膠涂層聚碳酸酯膜過濾器(孔徑為8 μm)，將細胞以每孔40000個細胞的密度接種，24 h后用D-PBS沖洗，按照說明書進行細胞遷移能力的評估，考馬斯藍染色后在顯微鏡下觀察細胞并計數(shù)。

1.3 生物學數(shù)據(jù)庫的使用 使用蛋白質互作數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)分析可與MYPT1相互作用的蛋白質，并使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫分析基因在結直腸腫瘤組織中的表達及不同基因表達的相關性。

2 結果

2.1 MYPT1在結直腸癌患者中低表達 首先通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結直腸癌組織和癌旁正常組織中MYPT1的表達水平，結果顯示在結腸癌和直腸癌組織中MYPT1均呈低表達(P<0.05)，見圖1。

圖1 MYPT1在結直腸癌中的表達

2.2 MYPT1在結直腸癌細胞中低表達 通過qRT-PCR法檢測結直腸癌細胞株HCT116、SW480、LOVO與正常人結腸上皮細胞株HCoEpiC中MYPT1表達水平。結果顯示，與HCoEpiC細胞株(0.96±0.04)相比，MYPT1在結直腸癌細胞株HCT116(0.38±0.04，t=21.437，P<0.01)、SW480(0.42±0.05，t=19.31，P<0.01)、LOVO(0.58±0.05，t=13.14,P<0.01)中的表達水平均明顯降低，見圖2。選擇SW480進行后續(xù)實驗。

圖2 MYPT1在結直腸癌細胞株中的表達

2.3 過表達MYPT1抑制結直腸癌細胞增殖 為分析MYPT1對細胞增殖的影響，本研究構建了MYPT1過表達載體LV-MYPT1及空白載體LV-MYPT1 NC，CCK8檢測結果顯示，24 h時，各組間細胞增殖活性無明顯差異(P>0.05)；48、72 h時，與空白對照組及陰性對照組相比，MYPT1過表達組細胞增殖能力明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 MYPT1對細胞增殖的影響

2.4 過表達MYPT1抑制結直腸癌細胞遷移 Transwell結果顯示，與空白對照組(53.67±3.51,t=10.898,P=0.01)及陰性對照組(55.33±2.52,t=10.898,P<0.01)相比，MYPT1過表達組(26.00±2.65)細胞遷移能力明顯降低，見圖3。

圖3 MYPT1對結直腸癌細胞遷移能力影響

2.5 通過生物信息學數(shù)據(jù)庫分析MYPT1相互作用蛋白 為探尋MYPT1發(fā)揮作用的機制，我們通過蛋白質互作數(shù)據(jù)庫https://string-db.org分析可與MYPT1相互作用的蛋白，發(fā)現(xiàn)RhoA可與MYPT1基因編碼的蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞單位12A (Protein Phosphatase 1 Regulatory Subunit 12A，PPP1R12A)相互作用，見圖4。

圖4 篩選可與PPP1R12A相互作用的蛋白

2.6 MYPT1負調(diào)控RhoA和ROCK1蛋白表達 為分析MYPT1對RhoA及其下游信號通路關鍵蛋白ROCK1表達的影響，通過Western blot檢測過表達MYPT1后RhoA和ROCK1蛋白表達水平，結果顯示與空白對照組相比，MYPT1過表達組中RhoA(t=29.942,P<0.01)和ROCK1(t=50.278，P<0.01)蛋白表達水平均明顯降低，見圖5。

圖5 MYPT1對RhoA和ROCK1蛋白表達的影響

2.7 RhoA和ROCK1表達呈正相關 通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結直腸癌中RhoA和ROCK1表達的相關性，結果發(fā)現(xiàn)RhoA和ROCK1表達呈正相關，見圖6。

圖6 RhoA和ROCK1表達的相關性

2.8 過表達RhoA促進結直腸癌細胞增殖 進一步分析RhoA對結直腸癌SW480細胞增殖能力的影響，結果顯示，24 h時，各組細胞增殖活性無明顯差異(P>0.05)；48、74 h時，與空白對照組及陰性對照組相比，RhoA過表達組中SW480細胞增殖能力明顯增強(P<0.05)，見表2。

表2 過表達RhoA對細胞增殖的影響

2.9 過表達RhoA促進結直腸癌細胞遷移 本研究分析了RhoA對結直腸癌SW480細胞遷移能力的影響，結果顯示與空白對照組(32.67±3.06，t=-6.682,P=0.003)及陰性對照組(34.33±4.04，t=-5.128,P=0.007)相比，RhoA過表達組(49.33±3.06)中SW480細胞遷移能力明顯增強，見圖7。

圖7 RhoA對結直腸癌細胞遷移能力的影響

2.10 MYPT1通過負調(diào)控RhoA抑制ROCK1基因表達 本研究接下來分析了MYPT1是否通過抑制RhoA的表達從而負調(diào)控ROCK1的表達。使用qRT-PCR法檢測ROCK1的表達，結果顯示與陰性對照組(0.95±0.06)相比，MYPT1過表達組(0.56±0.05,t=11.99,P<0.01)及MYPT1過表達+RhoA空載組(0.59±0.05,t=10.583,P<0.01)中ROCK1表達水平明顯降低；與MYPT1過表達組(t=-6.624,P<0.01)及MYPT1過表達+RhoA空載組(t=-5.786,P<0.01)相比，MYPT1過表達+RhoA過表達組(0.74±0.03)中ROCK1表達水平則有所增高，證實MYPT1通過負調(diào)控RhoA抑制ROCK1基因表達,見圖8。

圖8 MYPT1通過負調(diào)控RhoA抑制ROCK1基因表達

2.11 MYPT1通過負調(diào)控RhoA抑制結直腸癌細胞增殖 為驗證MYPT1通過負調(diào)控RhoA抑制結直腸癌細胞增殖，使用CCK8法檢測細胞增殖能力，結果顯示，24 h時，各組細胞增殖能力無明顯差異(P>0.05)，48、72 h時，與陰性對照組相比，MYPT1過表達組及MYPT1過表達+RhoA空載組中細胞增殖能力明顯降低，但是與MYPT1過表達組及MYPT1過表達+RhoA空載組相比，MYPT1過表達+RhoA過表達組中細胞增殖能力則有所增高(均P<0.05)，證實RhoA可逆轉MYPT1對細胞增殖活性的抑制作用，見表3。

表3 MYPT1通過負調(diào)控RhoA抑制結直腸癌細胞增殖

2.12 MYPT1通過負調(diào)控RhoA抑制結直腸癌細胞遷移 通過拯救實驗本研究驗證MYPT1是否通過負調(diào)控RhoA抑制結直腸癌細胞遷移，通過Transwell法檢測細胞遷移能力，結果顯示與陰性對照組(93.33±3.06)相比，MYPT1過表達組(59±3.00,t=13.889,P<0.001)及MYPT1過表達+RhoA空載組(61.67±2.52,t=13.857,P<0.001)中細胞遷移能力明顯降低；與MYPT1過表達組(t=-6.054,P=0.004)及MYPT1過表達+RhoA空載組(t=-5.353,P=0.006)相比，MYPT1過表達+RhoA過表達組(72.67±2.52)中細胞遷移能力則有所增高，證實MYPT1對細胞遷移能力的抑制作用至少部分是通過負調(diào)控RhoA實現(xiàn)的，見圖9。

圖9 MYPT1通過負調(diào)控RhoA抑制結直腸癌細胞遷移

3 討論

腫瘤細胞的增殖失控、侵襲和遷移是惡性腫瘤最基本的生物學特征。腫瘤細胞的遷移和侵襲可由多種化學物質誘導，這些化學誘導劑和相關的一些細胞因子可與腫瘤細胞表面的受體結合，激活細胞內(nèi)的信號轉導通路并調(diào)節(jié)細胞骨架的重組，從而促進腫瘤細胞的增殖和轉移[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)肌球蛋白作為細胞骨架的重要組成部分，可通過對其輕鏈磷酸化和去磷酸化的調(diào)節(jié)影響肌球蛋白的活性，在腫瘤的增殖和遷移中發(fā)揮著重要作用[15]。還有研究表明由于細胞分裂依賴細胞骨架的活性，并且細胞的運動行為依賴于細胞骨架的動態(tài)變化，因此肌球蛋白輕鏈的磷酸化可通過調(diào)控肌球蛋白和肌動蛋白的相互作用影響細胞骨架的活性，進一步增強腫瘤細胞的增殖和遷移能力[16]。MYPT1是蛋白磷酸酶1(Protein phosphatase 1，PP1)的調(diào)控亞單位，MYPT1和PP1的復合物可以通過去磷酸化肌球蛋白輕鏈調(diào)控腫瘤細胞增殖和轉移。既往研究發(fā)現(xiàn)MYPT1在多種惡性腫瘤中低表達，過表達MYPT1可抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展和轉移，并且在卵巢癌細胞和動物模型中敲除MYPT1可促進腫瘤的生長及導致對鉑類藥物耐藥性的增加[17-18]。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫本研究發(fā)現(xiàn)MYPT1在結腸癌和直腸癌組織中的表達水平明顯降低，與正常人結腸上皮細胞株HCoEpiC相比，MYPT1在結直腸癌細胞株HCT116、SW480、LOVO中的表達水平也明顯降低，并且過表達MYPT1可抑制結直腸癌細胞株的增殖和遷移。結果表明MYPT1在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著抑癌基因的角色，與既往研究結果相符，證實MYPT1可作為結直腸癌新的腫瘤標志物及潛在的藥物作用靶點。

本研究探討了MYPT1發(fā)揮抑癌作用的分子機制。通過蛋白質互作數(shù)據(jù)庫分析了可與MYPT1編碼的PPP1R12A蛋白相互作用的蛋白，發(fā)現(xiàn)RhoA可與PPP1R12A相互作用。RhoA是Rho小G蛋白家族的一員，參與調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架重排[19-21]。越來越多的數(shù)據(jù)表明RhoA信號通路通過肌動蛋白細胞骨架重排參與腫瘤細胞的增殖、轉移和侵襲。RhoA可誘導應力纖維的形成并可將細胞外信號傳遞給肌動蛋白和微管細胞骨架。ROCK1是ROCK家族之一,也是RhoA蛋白的下游激酶，其可增加肌球蛋白磷酸化，促進細胞產(chǎn)生收縮力，而這種張力是細胞增殖所必需的。ROCK1還可以通過磷酸化肌球蛋白輕鏈增強肌動球蛋白的收縮能力[22]。研究表明RhoA/ROCK信號通路是癌癥進展的關鍵信號通路[23],Wang等[24]的研究發(fā)現(xiàn)激活RhoA/ROCK信號通路可以增加卵巢癌細胞的遷移和侵襲能力,Xia等[25]的研究證實RhoA/ROCK信號通路參與血管生成擬態(tài)的形成，抑制RhoA/ROCK信號通路可通過減少腫瘤血供抑制非小細胞肺癌的生長和轉移。因此靶向RhoA/ROCK信號通路可能是抑制腫瘤細胞增殖和遷移的有效策略。本研究發(fā)現(xiàn)過表達MYPT1可抑制RhoA和ROCK1蛋白的表達，RhoA和ROCK1表達呈正相關，并且過表達RhoA可促進結直腸癌細胞的增殖和遷移，提示MYPT1可能通過RhoA信號通路發(fā)揮抑癌作用。進一步通過功能回復實驗發(fā)現(xiàn)與陰性對照組相比，MYPT1過表達組及MYPT1過表達+RhoA空載組中ROCK1表達水平明顯降低，細胞增殖和遷移能力明顯降低，但是與MYPT1過表達組及MYPT1過表達+RhoA空載組相比，MYPT1過表達+RhoA過表達組中ROCK1表達水平、細胞增殖和遷移能力有所增高，表明RhoA可逆轉MYPT1對ROCK1基因表達的下調(diào)作用和對細胞增殖和遷移能力的抑制作用，證實MYPT1通過RhoA/ROCK信號通路抑制結直腸癌細胞的增殖和遷移。

4 結論

MYPT1通過調(diào)控RhoA/ROCK信號通路抑制結直腸癌細胞的增殖和遷移，為阻斷結直腸癌的發(fā)生發(fā)展提供了潛在的治療靶點。但是MYPT1的上游調(diào)控基因及其在動物實驗中的作用還需要進一步的研究。