金 鹿，桑 丹，張崇志，李勝利，張春華，張俊麗，施 安，孫海洲，李聚才

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院動物營養(yǎng)與飼料研究所/內(nèi)蒙古自治區(qū)草食動物營養(yǎng)科學重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.寧夏農(nóng)林科學院動物科學研究所，寧夏 銀川 750002）

胃腸道功能對于反芻動物的機體健康、 生產(chǎn)潛能的發(fā)揮至關重要。 微生物群落是維系胃腸道正常功能的關鍵因素， 胃腸道的微生態(tài)平衡與宿主的健康［1］和營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收［2］息息相關。對于反芻動物而言， 胃腸道不同部位的微生物發(fā)揮的作用不同， 如瘤胃中的優(yōu)勢微生物群落主要由纖維素降解菌組成， 例如絲狀桿菌屬（Filamentous）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）等，腸道中的優(yōu)勢菌群主要為可利用乳糖的微生物， 例如柔嫩梭菌（Clostridium tender）、擬球梭菌屬（Clostridium）、直腸真桿菌（Eubacterium rectale）等，胃腸道不同部位的微生物在反芻動物疾病防控以及腸道健康方面起到關鍵作用［3-5］。 以前，通常以部分瘤胃或糞便樣品反映整個胃腸道微生物的結構和組成［6-9］，進而評估宿主的健康和營養(yǎng)狀態(tài)。 近年來越來越多的研究表明，盡管在同一個體中，動物胃腸道不同部位的微生物群落多樣性也存在較大差異［10-12］。 由此可見，利用反芻動物瘤胃和糞便微生物反映整個胃腸道微生物結構與組成具有片面性。 目前，豬［13］、肉雞［14］、兔［15］等單胃動物和牛［16］、山羊［17］等反芻動物的胃腸道微生物多樣性的研究取得了重要發(fā)現(xiàn)， 但是對灘羊斷奶羔羊胃腸道微生物群落多樣性的研究較少。該研究以寧夏灘羊作為研究對象，采用16S rDNA 高通量測序技術對羔羊瘤胃和小腸中的微生物群落進行測定， 探討不同部位菌群特征及差異， 以期為通過營養(yǎng)干預手段調(diào)控胃腸道微生物定植、促進羔羊健康發(fā)育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗試劑

DNA 提取試劑盒（QIAGEN）購自天根生化科技(北京)有限公司；2G Robust Hot Start Ready Mix（KAPA， KK5701） 和 文 庫 定 量 試 劑 盒（KAPA，KK4824）購自上海易匯生物科技有限公司；核酸純化試劑盒（Beckman Coulter，A63882）購自貝克曼庫爾特商貿(mào) （中國） 有限公司；DL 2 000 DNA Marker（TaKaRa，3427）購自大連寶生物工程有限公司；DNA 文庫制備試劑盒（NEB，E7645S）購自南京賽泓瑞生物科技有限公司；MiSeqReagent Kit v3（600 cycle）（Illumina，15067874）購自上海生物工程技術有限公司。

1.1.2 試驗儀器

PCR 儀 （ABI9700，USA）、Nanodrop 微量分光光度計（ND-1000 型，Thermo Scientific），美國生物分 析 儀 （2100，Agilent）、 生 物 大 分 子 分 析 儀（PerkinElmer）、高通量二代測序儀（PE300 平臺，Illumina）。

1.1.3 試驗動物及樣品采集

選取體重18 kg 左右、65 日齡的斷奶灘羊公羔12 只，屠宰后采集瘤胃、十二指腸、空腸和回腸內(nèi)容物各12 管置于5 mL 的無酶無菌凍存管中，－80 ℃冰箱保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣本DNA 提取

瘤胃和小腸內(nèi)容物樣本DNA 提取采用DNA提取試劑盒的標準方法， 采用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA 分子質(zhì)量，用紫外分光光度計（Nanodrop）檢測DNA 濃度和純度。

1.2.2 16S rDNA 高可變區(qū)引物設計及PCR 擴增

以V3 和V4 為目標區(qū)域進行引物設計，引物序列見表1。PCR 反應體系見表2。PCR 擴增程序如下：94 ℃模板DNA 預變性5 min；94 ℃模板DNA 變性30 s，50 ℃模板DNA 與引物退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30 個循環(huán)；72 ℃保持7 min；4 ℃保存。

表1 引物信息

表2 PCR 反應體系

1.2.3 測序

PCR 擴增后， 正反向引物兩端分別加上不同的barcode 區(qū)分不同的腸道樣本。 PCR 產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用PCR 純化試劑盒對PCR 擴增產(chǎn)物進行純化，并按測序要求混合。測序在北京奧維森基因科技有限公司提供的Mixed PE300 平臺進行。

1.2.4 測序信息分析流程

對于MiSeq 測序獲得的雙端數(shù)據(jù)， 首先利用Trimmomatic、Pear 對Fastq 數(shù)據(jù)進行質(zhì)控。 利 用Flash、Pear 根據(jù)PE 的overlap 關系對兩端序列進行拼接（merge）處理，根據(jù)已知數(shù)據(jù)庫用uchime方法比對去除Fasta 序列的嵌合體，對于未知數(shù)據(jù)庫使用自比對（denovo）方法進行去除，同時去除不合要求的短序列。 對最終獲得有效數(shù)據(jù)（clean data）進行OTU 聚類分析和物種分類學分析，數(shù)據(jù)分析程序見表3。

表3 數(shù)據(jù)分析程序列表

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.0 軟件提供的One-Way ANOVA程序進行單因素方差分析，用Duncan 氏新復極差法（SSR 法）進行多重比較。 試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標準差” 的形式表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 操作分類單位（OTU）數(shù)量

韋恩圖（Venn）用于分析環(huán)境樣品的OTU 數(shù)目組成相似性及重疊情況。 利用胃腸道細菌群落共享和獨特的OTU 豐度進行分析。 由圖1 可知，4個部位共產(chǎn)生2 147 個OTU， 瘤胃產(chǎn)生872 個OTU，十二指腸產(chǎn)生1 197 個OTU，空腸產(chǎn)生655 個OTU， 回腸產(chǎn)生1 277 個OTU，4 個部位共享了364 個OTU，占總OTU 數(shù)目的16.95%。十二指腸、回腸、瘤胃、空腸獨有的OTU 類別和數(shù)目分別為450、445、278、28 個， 分 別 占 總OTU 數(shù) 目 的20.96%、20.73%、12.95%和1.30%，說明十二指腸、回腸和瘤胃增加了特有微生物的種類和多樣性。

圖1 胃腸道菌群Venn 圖

2.2 Alpha 多樣性分析

2.2.1 稀釋曲線和Shannon 曲線

稀釋曲線可以反映樣品的測序深度，Shannon曲線反映各樣品在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性， 即在97%相似度OTU 水平下的微生物多樣性。 由圖2 可知，隨著測序深度的增加，曲線逐漸趨于平坦，說明此時的測序數(shù)據(jù)量合理。當測序深度較小時，Shannon 曲線迅速增加， 當測序深度達到5 000 reads 時，Shannon 曲線變緩，逐漸接近飽和狀態(tài)，表明當測序深度達到5 000 reads 時，該數(shù)據(jù)量已足夠進行樣品菌群多樣性分析（見圖3）。

圖2 樣品的稀釋曲線

圖3 樣品的Shannon 曲線

2.2.2 Alpha 多樣性分析

Alpha 多樣性分析與群落豐富度（community richness）和群落多樣性（community diversity）有關，群落豐富度指數(shù)包括Chao1 指數(shù)， 群落多樣性指數(shù)包括Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)。Chao1 指數(shù)用來估計OTU 數(shù)目，Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)為衡量微生物多樣性的指數(shù)，Shannon 值越高、灘羊胃腸道微生物群落多樣性越高。由表4 可知，瘤胃、十二指腸、空腸、回腸樣品的Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)差異均不顯著 （P＞0.05），但十二指腸樣品中Chao1 指數(shù)高于其他部位， 說明十二指腸中細菌群落總數(shù)高于其他腸道部位。瘤胃樣品中Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均高于十二指腸、空腸和回腸，說明瘤胃樣品中細菌的多樣性最豐富。每組測序覆蓋率均高于99%，表明測序數(shù)據(jù)量是合理的， 并且能夠反映灘羊羔羊胃腸道微生物群落情況。

表4 Alpha 多樣性指數(shù)

2.3 細菌組成和群落結構分析

2.3.1 門水平的結構分析

十二指腸、回腸、瘤胃和空腸菌群在門水平上的組成和相對豐度見表5 和圖4， 檢測結果包含21 個門，如厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放 線 菌 門（Actinobacteria）、螺 旋 菌 門（Spirochaetae）、變形菌門（Proteobacteria）、糖細菌門（Saccharibacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、藍藻菌門 （Cyanobacteria） 等。 4 個部位中厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria） 為優(yōu)勢類群， 占總細菌數(shù)目的90%以上。瘤胃液中擬桿菌門（Bacteroidetes）、螺旋菌門（Spirochaetae）、絲狀桿菌門（Fibrobacteres）的相對豐度顯著（P＜0.05）高于十二指腸、空腸和回腸，十二指腸中廣古菌門（Euryarchaeota）的相對豐度與瘤胃相比有升高的趨勢（0.05＜P＜0.10），空腸和回腸中厚壁菌門（Firmicutes） 的相對豐度顯著（P＜0.05）高于十二指腸。

圖4 門水平上胃腸道菌群分布圖

表5 灘羊羔羊胃腸道菌群在門水平的相對豐度（＞1%）

2.3.2 屬水平的結構分析

瘤胃、十二指腸、空腸和回腸菌群在屬水平上的組成和相對豐度見表6 和圖5。 從分析結果可知，4 個部位總共包含397 個屬。 有19 個屬的相對比例占到了總數(shù)的1%以上， 包括普雷沃菌屬_1（Prevotella_1）、 克 里 斯 滕 森 菌 屬 _R -7（Christensenellaceae_R-7_group）、 奧 爾 森 菌 屬（Olsenella）、 理 研 菌 屬 _RC9（Rikenellaceae_RC9_gut_group）、 毛 螺 菌 屬_NK3A20（Lachnospiraceae_NK3A20_group）、密 螺旋 體 屬 _2 （Treponema_2）、 糖 酵 菌 屬（Saccharofermentans）、 雙 歧 桿 菌 屬（Bifidobacterium）、 瘤 胃 球 菌 屬 _gauvreauii（Ruminococcus_gauvreauii_group）、瘤胃球菌屬_UCG-014 （Ruminococcaceae_UCG-014）、 瘤胃球菌屬_NK4A214 （Ruminococcaceae_NK4A214_group）、夏 普 菌 屬 （Sharpea）、 毛 螺 旋 菌 屬（Acetitomaculum）、互營球菌屬（Syntrophococcus）、瘤胃球菌屬_UCG-005 （Ruminococcaceae_UCG-005）、鐮孢菌屬（Catenisphaera）、產(chǎn)糞甾醇真細菌屬（Eubacterium_co prostanoligenes_group）、Family_ⅩⅢ_AD3011_group 等。 瘤 胃 中 理 研 菌 屬_RC9（Rikenellaceae_RC9_gut_group）、 密螺旋體 屬_2（Treponema_2）、 瘤 胃 球 菌 屬 _NK4A214（Ruminococcaceae_NK4A214_group）、普雷沃菌屬_UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）相對豐度顯著（P＜0.05）高于十二指腸、空腸和回腸。 空腸中Family_ⅩⅢ_AD3011_group 相對豐度顯著（P＜0.05）高于其他部位。

圖5 屬水平上胃腸道菌群分布圖

表6 灘羊羔羊胃腸道菌群在屬水平的相對豐度（＞1%）

3 討論

反芻動物胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)是機體最重要的微生態(tài)系統(tǒng)， 反芻動物胃腸道內(nèi)的大量微生物有提供營養(yǎng)、抵御外界病原生物侵害、促進機體生長和生物屏障等作用，它們與機體互相制約，互相依存構成了動態(tài)、統(tǒng)一的平衡體。當機體處于健康狀態(tài)時， 動物胃腸道內(nèi)的微生物是相對平衡的微生態(tài)環(huán)境，對于宿主來說是一種有益的狀態(tài)。健康的胃腸道微生物系統(tǒng)是動物內(nèi)環(huán)境必不可少的組成部分［17］。目前，利用高通量測序技術研究綿羊瘤胃和糞便微生物， 尤其有關灘羊胃腸道微生物多樣性的研究報道較少。 該試驗采用二代測序技術分析灘羊羔羊胃腸道微生物組成及其豐度， 根據(jù)稀釋曲線和Coverage 指數(shù)分析結果， 各組測序數(shù)據(jù)的覆蓋率均高于99%， 能夠真實全面反映胃腸道菌群組成情況。 根據(jù)Alpha 多樣性分析可知，不同部位的細菌微生物多樣性及相對豐度存在差異，瘤胃細菌的多樣性最豐富。

動物胃腸道中的優(yōu)勢菌門是擬桿菌門和厚壁菌門［18-19］。 厚壁菌門能將飼料中纖維降解為揮發(fā)性脂肪酸，促進飼料消化和動物生長發(fā)育，而擬桿菌門能降解非纖維類物質(zhì)［20-21］。 厚壁菌門和擬桿菌門可以促進機體吸收能量，因此，厚壁菌門與擬桿菌門細菌的比值可以反映機體的肥胖狀況［22-23］。腸道中擬桿菌門的相對豐度與宿主的體脂含量呈顯著負相關［24-25］，擬桿菌門數(shù)量越多，機體對脂肪的分解和脂肪酸氧化的能力越高，因此，一定數(shù)量的擬桿菌有利于降低宿主的脂肪含量。王繼文等［26］研究表明，在門水平上，厚壁菌門和擬桿菌門是山羊瘤胃微生物中的優(yōu)勢菌門， 且擬桿菌門豐度高于厚壁菌門。 Jesus-Laboy 等［27］研究表明，在山羊糞便微生物中， 厚壁菌門的相對豐度高于擬桿菌門。該試驗結果表明，灘羊羔羊瘤胃中的微生物相對豐度最高的是厚壁菌門， 其次為擬桿菌門和放線菌門，3 種細菌占到總量的90%以上；灘羊羔羊十二指腸中的優(yōu)勢菌群依次為放線菌門、 厚壁菌門、變形菌門和糖細菌門；空腸和回腸中的優(yōu)勢菌群相似，均為厚壁菌門和放線菌門，且厚壁菌門所占比例高于放線菌門。 該研究結果與前人研究有所不同， 其原因可能是細菌的定植時間與動物日齡相關， 從不同日齡的動物中取到的微生物群落可能會有差異； 試驗動物品種的選取、 飼糧的結構、 采樣的部位和方式以及測序的區(qū)域?qū)τ谖⑸锶郝錅y定也會產(chǎn)生一定影響［20，28］。 在屬水平上，灘羊羔羊瘤胃液中相對豐度較高的菌屬為普雷沃菌屬；十二指腸、空腸和回腸中相對豐度較高的菌屬為奧爾森菌屬，這與以往在其他反芻動物如奶牛［29］、肉牛［30］、綿 羊［31］以 及 山 羊［26］中 的 研 究 結 果 存 在 差異。 研究發(fā)現(xiàn)，同一品種的動物，不同腸段微生物組成存在特異性［32-33］， 因為不同腸道部位的pH值、食糜蠕動、分泌物和氧化還原電位均不相同。奧爾森菌屬是分布于健康牛瘤胃中的一種革蘭陽性細菌，最終代謝產(chǎn)物主要是乙酸和乳酸［34］。普雷沃菌屬是擬桿菌門的主要細菌， 可以獨立降解蛋白質(zhì)、糖類和碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)，由于該菌屬微生物種型多、遺傳多樣性豐富、底物寬泛，所以能在瘤胃中處于優(yōu)勢地位［26］。由試驗結果可知，利用反芻動物部分瘤胃和糞便微生物反映整個胃腸道微生物結構與組成具有片面性， 并不能反映真實情況。Frey 等［35］研究表明，在胃腸道進行食糜消化的全過程中，微生物結構在不斷發(fā)生變化，所以食糜在胃腸道中消化的過程是導致胃腸道不同部位微生物組成存在差異的原因。

瘤胃球菌屬是普遍存在于草食動物胃腸道的主要纖維降解菌， 包括黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌，這2 種菌能夠產(chǎn)生纖維水解酶，對粗飼料中纖維素和半纖維素的降解起著重要作用［36］，但該研究發(fā)現(xiàn)瘤胃球菌屬在瘤胃的豐度僅有6%左右，在小腸的豐度為4%～7%。 Girija 等［37］有關牛糞微生物的研究發(fā)現(xiàn)， 該菌屬在瘤胃的豐度僅為2%，表明其在瘤胃中的占比很小， 說明以往借助傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術得到的試驗結果也許夸大了瘤胃球菌屬在瘤胃中的作用?；诋斍凹毦鷶?shù)據(jù)庫，該研究發(fā)現(xiàn)在灘羊羔羊瘤胃、腸道（十二指腸、空腸、回腸）內(nèi)還檢測到大量未被分類鑒定的菌屬（Unidentified），提示在特定生態(tài)環(huán)境條件下形成的地方優(yōu)良特色裘皮品種灘羊羔羊胃腸道可能存在特有的微生物菌群。

4 結論

灘羊羔羊瘤胃中細菌的多樣性最豐富。 瘤胃微生物與十二指腸、 空腸和回腸的細菌區(qū)系顯著不同，可能與其特定的功能差異有關。