羅榮榮，陳 磊，徐文鎬，宋星星，張 鑫，左劍雨，2，胡 文，石 艷，韓冬洋，曹雅潔，李 珣

（1. 廣西大學動物科學技術學院， 廣西 南寧 530004；2. 廣西東盟經濟技術開發(fā)區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所， 廣西 南寧530105）

促性腺激素抑制激素（gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH）是Tsutsui 等［1］于2000 年首次在鵪鶉下丘腦內分離鑒定到的一種由12 個氨基酸構成的神經肽， 該神經肽能夠抑制促性腺激素釋放激素的分泌。后續(xù)研究表明，在哺乳動物中也存在與GnIH 結構相似的神經肽， 其中，RF 酰胺相關肽-3 （RF amide-related peptide 3，RFRP-3）與GnIH 的生理功能一致，二者均通過G 蛋白耦聯(lián)受體147（G-protein coupled receptor 147，GPR147）參與動物生殖以及內分泌、 免疫和攝食等生理過程的調控［2-4］。隨著對GnIH 研究的不斷深入，其在能量代謝方面的調控作用逐漸展現(xiàn)。有研究表明，下丘腦作為神經中樞關鍵腦區(qū)也參與了動物的采食行為和糖代謝調控［5］。 哺乳動物的GnIH 神經元主要分布于下丘腦、室旁核、弓狀核和腹內側核等能量調控區(qū)域［6］。 同時，Johnson 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，對大鼠側腦室注射GnIH 可導致注射后2 h 內食物的攝取量顯著增加。 上述試驗結果有力地證明了GnIH 有可能直接作用于中樞神經系統(tǒng)食欲和能量代謝調控區(qū)域， 從而參與動物的采食行為和代謝的調控。綿羊和獼猴腦室注射GnIH 增加了食物攝入量，但不影響能量消耗以及動物性行為［8-9］。Clarke 等［10］發(fā)現(xiàn)GnIH 會在限飼條件下被激活，此時動物食欲增加，繁殖行為減少，體內GnIH 免疫反應細胞數(shù)量也減少。 Huo 等［11］進一步研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腹腔注射GnIH， 激光共聚焦結果顯示：GnIH及其受體GPR147 在胰島均有分布，GnIH 在胰島α 細胞和β 細胞上均有表達， 且與胰高血糖素存在共定位。 葡萄糖耐量試驗是評估血糖調節(jié)能力的重要試驗， 胰島素耐量試驗是評價動物胰島素敏感性的重要試驗。 該試驗對雄性昆明小鼠腹腔注射GnIH，考查其葡萄糖耐量、胰島素分泌功能和胰島素敏感性是否受到影響， 并探究該神經肽對小鼠生長性能及胰島素轉錄因子基因（NeuroD1）、胰島素基因（Ins）、胰高血糖素基因（Gcg）、胰島素轉錄調控因子基因 （Pdx1） 表達水平的影響，為豐富動物能量代謝理論提供基礎研究數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物

昆明系小白鼠20 只， 雄性，6 周齡， 體重（26.1±0.3）g，購自廣西中醫(yī)藥大學動物實驗中心。對飼養(yǎng)環(huán)境的溫度（25±2）℃、濕度（55±5）%和光照（12 L∶12 D，每天7：00 開燈）進行嚴格控制。

1.1.2 試劑與儀器

Trizol、 反轉錄酶、DNAMarker、 核苷酸（Oligo dT18）、dNTPs、rTaq DNA 聚 合 酶、Golden View 核酸染料，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；1 mL注射器和葡萄糖購自南寧吉運生物科技有限公司；舒泰（Zoletil 50）購自法國維克公司；胰島素購自諾和諾德公司；血糖試紙、輔理善越佳型至新血糖儀， 購自英國雅培糖尿病護理公司； 羅氏LightCycler96 實時熒光定量PCR 儀為Roche 公司產品。

胰島素轉錄因子基因（NeuroD1）、胰島素基因（Ins）、胰高血糖素基因（Gcg）、胰島素轉錄調控因子基因（Pdx1）及β-actin 基因實時熒光定量PCR（qPCR） 分析引物均由深圳華大基因科技有限公司設計及合成。 引物信息見表1。

表1 qPCR 引物信息

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

20 只小鼠適應性飼養(yǎng)1 周后， 隨機分為2組，每組10 只，分別為對照組［腹腔注射生理鹽水100 μL/（次·只）］和試驗組［腹腔注射20 μg/100 μL GnIH，100 μL/（次·只）］， 每組10 只， 每天注射2次（8：00 和20：00 各1 次），連續(xù)注射21 d。

1.2.2 生長性能指標測定

從試驗開始的第1 天對鼠糧及體重進行稱量、記錄。 每天分別于8：00 和20：00 準時對小鼠的體重及剩余鼠糧進行稱重并記錄，在此期間小鼠可自由采食及飲水。計算平均日增重和平均日采食量。平均日增重=（試驗結束時體重-試驗開始時體重）/試驗天數(shù)，平均日采食量=總采食量/天數(shù)［12］。

1.2.3 空腹血糖、葡萄糖耐量及胰島素耐量的檢測

1.2.3.1 空腹血糖檢測

空腹血糖檢測方法參考已有文獻報道［13］，試驗第8 天22：00 對所有小鼠禁食10 h 處理，試驗第9 天8：00 對所有實驗小鼠進行麻醉，當其處于穩(wěn)定狀態(tài)時， 使用快速血糖儀檢測尾靜脈血糖濃度，之后立即進行1 次腹腔注射，即對照組注射生理鹽水100 μL/只， 試驗組注射20 μg/100 μL 的GnIH 100 μL/只，此時記為T=0 min，在T=15、30、45、75、135 min 對血糖進行測定。

1.2.3.2 葡萄糖耐量檢測

葡萄糖耐量檢測方法參考已有文獻報道［13］，試驗第12 天22：00 對所有小鼠禁食10 h 處理，試驗第13 天8：00 對所有實驗小鼠進行麻醉，當其處于穩(wěn)定狀態(tài)時， 使用快速血糖儀檢測尾靜脈血糖濃度，接著每只小鼠按照2 g/（kg·BW）的劑量腹腔注射0.5 g/mL 的葡萄糖溶液1 次， 此時記為T=0 min。 在T=15 min 血糖測定結束后，進行1 次腹腔注射， 即對照組注射生理鹽水100 μL/只、試驗組注射20 μg/100 μL 的GnIH 100 μL/只， 并在T=30、45、75、135 min 時對小鼠的血糖進行測定。

1.2.3.3 胰島素耐量檢測

胰島素耐量檢測方法參考已有文獻報道［13］，試驗第16 天22：00 對所有小鼠禁食10 h 處理，試驗第17 天8：00 對所有實驗小鼠進行麻醉，當其處于穩(wěn)定狀態(tài)時， 使用快速血糖儀檢測尾靜脈血糖濃度，此時記為T=0 min；接著每只小鼠按照2.7 U/（kg·BW） 的劑量腹腔注射0.5 U/mL 的胰島素1 次。 在T=15 min 血糖測定結束后，進行1 次腹腔注射， 即對照組注射生理鹽水100 μL/只、試驗組注射20 μg/100 μL 的GnIH 100 μL/只， 并在T=30、45、75、135 min 時對小鼠的血糖進行測定。

血糖曲線下面積計算方法參考已有文獻報道［14］：血糖曲線下面積（min·mg/dL）=15 min×［1/2×（BG0＋BG135）＋1×（BG15＋BG30＋BG45＋BG75＋BG135）］，使用梯形規(guī)則法。

1.2.4 實時熒光定量PCR 檢測胰腺中Gcg、Ins、Pdx1、NeuroD1 基因mRNA 表達水平

試驗結束后解剖小鼠，分離胰腺，經液氮速凍處理后轉至-80 ℃冰箱保存，按照Trizol 試劑的說明書在無RNA 酶的環(huán)境下提取總RNA， 按照試劑盒說明書進行反轉錄并獲得cDNA。實時熒光定量PCR 反應體系20 μL：rTaq DNA 聚合酶10 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板1 μL，ddH2O 8.2 μL；反應程序：95 ℃酶激活2 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

使用Graphad prism 6.0 和Adobe illustrator 2019 軟件作圖。對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗后符合正態(tài)分布， 使用SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件進行獨立樣本t 檢驗。 數(shù)據(jù)表示形式為 “平均值±標準誤（Mean±SEM）”。

2 結果與分析

2.1 腹腔注射GnIH 對小鼠平均日增重、平均日采食量的影響

由表2 可知，與對照組相比，腹腔注射GnIH可使小鼠平均日增重極顯著（P＜0.01）升高；腹腔注射GnIH 可使小鼠平均日采食量極顯著 （P＜0.01）升高。

表2 腹腔注射GnIH 對小鼠生長性能的影響 單位：g

2.2 腹腔注射GnIH 對小鼠空腹血糖的影響

空腹血糖測定結果如圖1 所示， 小鼠禁食10 h 腹腔注射GnIH 能夠促進小鼠血糖的升高，與對照組相比，腹腔注射GnIH 在T=15 min 時血糖升高并達到最高值（P＜0.001）；隨后在T=30～135 min時段血糖逐漸下降， 但試驗組的血糖仍然顯著高于對照組。 此外，如圖2 所示，在禁食10 h 后腹腔注射GnIH 能夠極顯著（P＜0.01）增加小鼠空腹血糖曲線下面積。

圖1 慢性腹腔注射GnIH 對雄性小鼠空腹血糖的影響

圖2 慢性腹腔注射GnIH 后雄性小鼠空腹血糖曲線下面積

2.3 腹腔注射GnIH 對小鼠葡萄糖耐量的影響

葡萄糖耐量試驗是評價動物血糖代謝功能的重要試驗，結果如圖3 所示。 與對照組相比，腹腔注射GnIH 后的第15 分鐘時（T=30 min）血糖顯著（P＜0.05）升高；此外，如圖4 所示雄性小鼠葡萄糖耐量的血糖曲線下面積極顯著（P＜0.01）增加。

圖3 慢性腹腔注射GnIH 對雄性小鼠葡萄糖耐量的影響

圖4 慢性腹腔注射GnIH 后雄性小鼠葡萄糖耐量的血糖曲線下面積

2.4 腹腔注射GnIH 對小鼠胰島素耐量的影響

胰島素耐量試驗是評價動物胰島素敏感性的重要試驗，結果如圖5 所示。 與對照組血糖相比，腹腔注射GnIH 能夠減緩小鼠血糖的降低， 并在T=30 min 時有顯著差異（P＜0.05）；此外，如圖6 所示雄性小鼠胰島素耐量的血糖曲線下面積極顯著（P＜0.01）增加。

圖5 慢性腹腔注射GnIH 對小鼠胰島素耐量的影響

圖6 慢性腹腔注射GnIH 后雄性小鼠胰島素耐量的血糖曲線下面積

2.5 腹腔注射GnIH 對小鼠胰腺Gcg 基因mRNA 相對表達量的影響

結果如圖7 所示，慢性腹腔注射GnIH 后雄性小鼠胰腺Gcg 基因mRNA 的相對表達量顯著（P＜0.05）高于對照組。

圖7 慢性腹腔注射GnIH 對雄性小鼠胰腺Gcg 基因mRNA 相對表達量的影響

2.6 腹腔注射GnIH 對小鼠胰腺Ins 基因mR-NA 相對表達量的影響

結果如圖8 所示，慢性腹腔注射GnIH 后雄性小鼠胰腺Ins 基因mRNA 的相對表達量顯著 （P＜0.05）低于對照組。

圖8 慢性腹腔注射GnIH 對雄性小鼠胰腺Ins 基因mRNA 相對表達量的影響

2.7 腹腔注射GnIH 對小鼠胰腺pdx1 基因mRNA 相對表達量的影響

結果如圖9 所示，慢性腹腔注射GnIH 后雄性小鼠胰腺Pdx1 基因mRNA 的相對表達量顯著（P＜0.05）低于對照組。

圖9 慢性腹腔注射GnIH 對雄性小鼠胰腺Pdx1 基因mRNA 相對表達量的影響

2.8 腹腔注射GnIH 對小鼠胰腺NeurD1 基因mRNA 相對表達量的影響

由圖10 可知， 慢性腹腔注射GnIH 后雄性小鼠胰腺NeuroD1 基因mRNA 的相對表達量顯著（P＜0.05）低于對照組。

圖10 慢性腹腔注射GnIH 對雄性小鼠胰腺NeurD1 基因mRNA 相對表達量的影響

3 討論

自發(fā)現(xiàn)GnIH 以來，關于GnIH 的研究主要集中在生殖調控方面。 隨著研究的不斷深入，GnIH已經被證明是能夠影響采食并可能參與能量代謝的神經內分泌因子［15］。 該試驗通過對昆明小鼠進行慢性腹腔注射GnIH，探究該神經肽對動物生長性能及能量代謝的影響， 以期為在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中提高生產性能提供新思路和基礎理論依據(jù)。

Tsutsui 及其同事研究了GnIH 是否將代謝信息傳遞到HPG 軸并調節(jié)神經饋送回路［4］。 在鳥類中，側腦室注射抗GnIH 抗血清可抑制禁食誘導的食欲，支持GnIH 在進食中的刺激作用。Fraley 等［16］還報道了GnIH 的側腦室注射降低了成年北京鴨的血漿LH 黃體生成素（luteinizing hormone,LH）濃度并增加了攝食量。 此外，Tachibana 等［17］研究了向雛雞側腦室內注射GnIH 會刺激食物攝入，揭示了GnIH 在雛雞中誘導的中樞促食欲機制。在哺乳動物中，GnIH 的側腦室給藥也增加了大鼠［7］和綿羊［10］的食物攝入量。以上研究與該試驗結果一致。

該研究結果表明小鼠腹腔注射GnIH 具有快速升血糖的作用。 當機體血糖升高時會刺激胰島β 細胞中胰島素分泌增加， 而胰島素可促進體細胞對血糖的吸收和利用， 并促進糖原合成和抑制糖異生，進而發(fā)揮其維持血糖平衡的生理功能［18］。此外， 慢性腹腔注射GnIH 小鼠在注射葡萄糖后，其血糖與對照組相比顯著升高，GnIH 可能降低了機體對胰島素的敏感性，導致葡萄糖清除率顯著下降。 胰島素抵抗的特征是機體對胰島素的不敏感以及對血液中葡萄糖的攝取能力下降， 當機體處于胰島素抵抗狀態(tài)時會引起血糖濃度的升高。 該研究表明慢性腹腔注射GnIH 會引起小鼠血糖代謝的紊亂。 胰島素是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能夠直接降低機體血糖的激素，在靶器官的代謝影響了整個機體的血糖平衡， 而胰島素抵抗（insulin resistance，IR）即機體細胞對胰島素的反應表現(xiàn)為不敏感，這將直接影響體內血糖的吸收和糖原的分解［19］。 因此， 胰島素抵抗被認為是引起能量代謝紊亂發(fā)展過程中的一個重要因素。

研究表明，GnIH 在動物的中樞及外周組織器官均有不同程度的表達和分布［20-21］。 而在該研究中，對慢性腹腔注射GnIH 小鼠胰腺中的Gcg、Ins、Pdx1、NeuroD1 基因mRNA 相對表達量進行了檢測，結果表明，與對照組相比慢性腹腔注射GnIH小鼠胰腺Gcg 基因mRNA 的相對表達量顯著（P＜0.05）升高，Ins、Pdx1、NeuroD1 基因mRNA 的相對表達量顯著（P＜0.05）降低。2 種β 細胞特異性轉錄調節(jié)因子Pdx1 和NeuroD1 已被證明在葡萄糖誘導的胰島素基因轉錄和胰腺β 細胞功能中起關鍵作用［22-23］。 在2 型糖尿病中，由于不能再分泌足夠的胰島素維持正常的血糖水平， 胰島素分泌率總體上有所下降［24］。 這與該試驗結果一致。

綜上所述，猜測腹腔注射GnIH 可能降低了機體對胰島素的敏感性， 導致葡萄糖清除率顯著下降。這一生理功能的改變推測是由于GnIH 在引起胰島素分泌下降的同時誘導了胰島素抵抗的發(fā)生所致。

4 結論

該研究探討了腹腔注射GnIH 對小鼠采食、體重和血糖穩(wěn)態(tài)的影響，結果顯示腹腔注射GnIH 具有促進雄性小鼠采食量和體重增加進而提高其生長性能的作用。腹腔注射GnIH 具有快速升血糖的作用，促進胰高血糖素的分泌和合成，抑制胰島素轉錄調控因子、 胰島素轉錄因子和胰島素的分泌和合成，進而引起機體血糖紊亂。