徐秋玲 郭 冉 王以寧 孫 衛(wèi) 張緒東 鄭學(xué)芝▲

1.牡丹江醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，牡丹江黑龍江 157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，牡丹江黑龍江 157011

心臟纖維化由駐留的心臟成纖維細(xì)胞激活介導(dǎo)，成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞以應(yīng)對(duì)損傷或壓力，肌成纖維細(xì)胞的形成是一個(gè)對(duì)急性損傷的生理反應(yīng)[1]，研究發(fā)現(xiàn)炎癥損傷參與糖尿病心肌病病理過(guò)程[2]，α-平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle cell actin，α-SMA） 是心肌成纖維細(xì)胞分化為肌樣成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物。 miR-146a 異常表達(dá)參與縮窄性心肌炎纖維化病理過(guò)程[3]。 在糖尿病心肌纖維化病理過(guò)程中microRNA-146a（miR-146a）與α-SMA 表達(dá)相關(guān)性報(bào)道較少。 中藥黃芩的活性成分黃芩苷具有抗炎、抗氧化、抗纖維化作用[4]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷參與糖尿病鼠心肌纖維化，本實(shí)驗(yàn)主要研究黃芩苷參與糖尿病心肌纖維化與miR-146a 和α-SMA 表達(dá)相關(guān)性，為糖尿病心肌病的治療提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24 只健康雄性SD 鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006]，飼養(yǎng)于SPF/VAF 級(jí)動(dòng)物室， 室溫18～25℃， 相對(duì)濕度50%～80%，每日光照12 h，自由攝食、飲水。 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)牡丹江醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 主要儀器與試劑

血糖儀（美國(guó)強(qiáng)生公司，20202221732）；熒光定量PCR 儀（美國(guó)Invirtogen 公司，A43162）；黃芩苷（Sigma公司，MFCD00134418）；生理鹽水配制藥液，鏈脲佐菌素（美國(guó)Sigma 公司，MFCD00006607）；qPCR 試劑盒（美國(guó)Invirtogen 公司，F(xiàn)455XL）；抗α-SMA 抗體（博士德生物工程有限公司，A03744）；抗GAPDH 抗體（博士德生物工程有限公司，A00227-3）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)法先將24 例健康雄性SD 鼠從01～24 編號(hào)， 在隨機(jī)數(shù)字表中任一位置開(kāi)始按行選擇，選取雄性8 例作為對(duì)照組，余16 例建立糖尿病模型：采用尾靜脈注射鏈脲佐菌素45 mg/kg（溶于0.1 mmol/L 枸櫞酸緩沖液），72 h 后連續(xù)2 次空腹血糖大于或等于16.7 mmol/L 為糖尿病造模成功。 然后將造模成功的鼠再按照隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)法分為模型組和治療組，每組各8 例。

治療組普通飼料飼養(yǎng)，同時(shí)腹腔注射黃芩苷藥液每天每千克15 μmol/L。 對(duì)照組和模型組同樣普通飼料飼養(yǎng)，同時(shí)腹腔注射與黃芩苷等容積的生理鹽水，連續(xù)用藥8 周后， 動(dòng)物禁食12 h， 用10%水合氯醛（3.5 ml/kg）腹腔麻醉，然后在冰上快速取心臟組織，稱(chēng)重記錄，心臟剪成大小約為1 mm3的組織塊，加入胰酶心肌細(xì)胞消化液，攪拌3 次，每次10 min；3000 g離心，離心半徑10 cm，5 min；棄去懸液，加入PBS 重懸細(xì)胞；3000 g 離心，離心半徑10 cm，5 min；去懸液，PBS 重懸細(xì)胞后置于培養(yǎng)瓶中，因心肌細(xì)胞較心臟成纖維細(xì)胞貼壁速度慢，所以利用差速貼壁法將心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞分離，收集心臟的成纖維細(xì)胞[5]。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1 基線資料 測(cè)各組血糖、心臟重量、體重，計(jì)算心臟重量指數(shù)（心臟重量/體重）。

1.4.2 RT-PCR 檢測(cè)miR-146a 表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA，6000 g 離心，離心半徑10 cm，5 s。70℃干浴3 min。加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl，37℃水浴，60 min。 85℃干浴5 min失活處理，進(jìn)行定量PCR 實(shí)驗(yàn)。 miR-146a 正向引物5′-CAGCTGCATTGGATTTACCA-3′，miR-146a 反 向引物5′-GCCTGAGACTCTGCCTTCTG-3′，內(nèi)參U6 正向引物5′-TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG-3′，內(nèi)參U6 反向引物5′-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3′。qPCR 反應(yīng)體系：SYBR Green 9 μl，cDNA 2 μl， 正向引物2 μl，反向引物2 μl。反應(yīng)條件：95℃10 min 預(yù)變性，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)。 用2-△△CT法計(jì)算目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量[6-7]。

1.4.3 Western-blot 檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞 α-SMA、GAPDH 蛋白PBS 沖洗細(xì)胞3 次， 加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，4℃離心棄上清，加入適量細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃，13 000 g，15 min，離心半徑10 cm。吸取上清，蛋白定量分裝，10 μg/管。 Western-blot 步驟：十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）電泳，轉(zhuǎn)膜；分別加入抗α-SMA 和抗GAPDH抗體孵育（封閉液稀釋1∶500），4℃過(guò)夜，TBST 洗2次，每次5 min，加入二抗（封閉液稀釋1∶1000），室溫10 min，TBST 洗3 次，每次5 min。濾膜于顯色液中反應(yīng)1 min。拍照并計(jì)算灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血糖、心臟重量指數(shù)的比較

治療組血糖、心臟重量指數(shù)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療組血糖、心臟重量指數(shù)均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 三組血糖、心臟重量指數(shù)的比較（±s）

表1 三組血糖、心臟重量指數(shù)的比較（±s）

注 與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 血糖（mmol/L） 心臟重量指數(shù)模型組（n=8）治療組（n=8）對(duì)照組（n=8）24.6±1.01a 11.4±2.12ab 5.60±0.02 0.0038±0.00013a 0.0022±0.00024ab 0.0016±0.00021

2.2 三組miR-146a、α-SMA 的比較

治療組miR-146a 高于模型組，a-SMA 低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療組miR-146a 低于對(duì)照組，α-SMA 高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2、圖1）。 蛋白相對(duì)表達(dá)水平：α-SMA 灰度值/GAPDH 灰度值。

圖1 三組α-SMA 的比較

表2 三組miR-146a、α-SMA 的比較（±s）

表2 三組miR-146a、α-SMA 的比較（±s）

注 與對(duì)照組比較，aP＜0.05； 與模型組比較，bP＜0.05；α-SMA：α-平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白；miR-146a：microRNA-146a

組別 miR-146a α-SMA模型組（n=8）治療組（n=8）對(duì)照組（n=8）0.93±0.04a 1.34±0.01ab 1.63±0.02 1.68±0.03a 1.32±0.01ab 0.61±0.04

3 討論

心肌纖維化是糖尿病心肌病的特征性病理表現(xiàn)[8]。高血糖刺激細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，血管代償性增殖，導(dǎo)致心肌纖維化[9]。本實(shí)驗(yàn)使用鏈脲佐菌素一次性較大劑量靜脈注射的給藥方法建立與人類(lèi)1 型糖尿病表現(xiàn)相似的糖尿病模型[10]。

黃芩苷是干燥黃芩根部的生物活性形式，具有抗炎、抗氧化等功效。 研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷能夠減輕氧化應(yīng)激相關(guān)的損傷，減輕炎癥反應(yīng)，黃芩苷通過(guò)減少轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）表達(dá)參與博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[11]。 黃芩苷具有抗炎作用，黃芩苷通過(guò)抑制toll 樣受體4/核轉(zhuǎn)錄因子（toll-like receptors 4/nuclear factor-kappa B，TLR4/NF-κB）信號(hào)通路激活來(lái)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥[12]。 本研究結(jié)果顯示，模型組血糖高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）， 提示糖尿病模型造模成功。模型組與治療組、治療組與對(duì)照組血糖比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示黃芩苷影響血糖的代謝，具有降低糖尿病鼠血糖的功能；模型組心臟重量指數(shù)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示高血糖刺激心肌組織增生，使心肌代償性肥大，心臟重量增加，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[13]。 模型組與治療組、治療組與對(duì)照組心臟重量指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示黃芩苷對(duì)心肌有影響，黃芩苷參與糖尿病心肌重構(gòu)。

microRNAs（miRNAs）是一類(lèi)非編碼小RNA，高度保守，長(zhǎng)度21～25 個(gè)堿基，miRNAs 通過(guò)抑制mRNA翻譯、 誘導(dǎo)mRNA 降解來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，miRNAs 參與多個(gè)靶點(diǎn)上游調(diào)控因子的調(diào)控[14]。 1 型糖尿病是一種慢性自身免疫性疾病，炎癥介質(zhì)在1 型糖尿病的病變過(guò)程中起到重要作用，炎癥有助于早期誘導(dǎo)和放大針對(duì)胰腺β 細(xì)胞的免疫攻擊，抑制β 細(xì)胞功能，參與β 細(xì)胞凋亡[15]。 miR-146a 是miR-146 家族中的成員，參與免疫和炎癥反應(yīng)的反向調(diào)節(jié)[16-17]。 慢性炎癥是糖尿病的病理基礎(chǔ)，降低miR-146a 表達(dá)，加重炎癥[18]。本研究結(jié)果顯示，模型組miR-146a 表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示高血糖抑制miR-146a 表達(dá)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，使細(xì)胞外基質(zhì)的合成及分解代謝紊亂。模型組與治療組、治療組與對(duì)照組miR-146a 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示黃芩苷干預(yù)心肌炎癥反應(yīng)， 可以改善糖尿病鼠心肌炎性損傷，參與1 型糖尿病心肌炎性變化的病理過(guò)程。

心臟成纖維細(xì)胞分化為肌樣成纖維細(xì)胞，是心肌纖維化的關(guān)鍵因素。肌樣成纖維細(xì)胞收縮力、遷移力和合成膠原能力增強(qiáng)，加劇心肌重構(gòu)，降低心臟功能[19]，α-SMA 是肌樣成纖維細(xì)胞的表面標(biāo)志物， 是成纖維細(xì)胞分化為肌樣成纖維細(xì)胞關(guān)鍵蛋白[20]。 本研究發(fā)現(xiàn)模型組α-SMA 高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示高血糖刺激下，心肌成纖維細(xì)胞向肌樣成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化， 加劇糖尿病心肌纖維化的病理進(jìn)程。模型組與治療組、治療組與對(duì)照組α-SMA 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示黃芩苷參與心肌纖維化過(guò)程，通過(guò)抑制α-SMA 表達(dá)抑制心肌成纖維細(xì)胞向肌樣成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制糖尿病鼠心肌纖維化，調(diào)控心臟重塑過(guò)程，對(duì)糖尿病心肌具有保護(hù)作用。

綜上所述， 黃芩苷能夠提高糖尿病鼠心肌成纖維細(xì)胞中miR-146a 表達(dá)， 抑制高糖對(duì)心肌炎性傷害；抑制α-SMA 表達(dá)，降低糖尿病鼠心肌纖維化的進(jìn)程， 為運(yùn)用黃芩苷治療糖尿病心肌纖維化提供理論依據(jù)。