馬利節(jié)， 朱曉駿， 林佳成， 王 芳， 孫學(xué)華， 高月求

1 上海中醫(yī)藥大學(xué) 曙光臨床醫(yī)學(xué)院， 上海 201203； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 肝炎科， 上海 201203

慢性乙型肝炎(CHB)目前仍然是全球性公共衛(wèi)生問題[1-2]。中草藥及其活性成分在治療CHB方面發(fā)揮著重要作用，具有廣闊的應(yīng)用前景[3]。靈貓方是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病科治療CHB的有效驗方。前期研究[4-8]發(fā)現(xiàn)，靈貓方可有效改善CHB患者的臨床證候，提高患者的生化和病毒學(xué)應(yīng)答，增強免疫應(yīng)答。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過預(yù)測中草藥活性成分的作用靶點，揭示中草藥多成分、多靶點的作用關(guān)系；通過構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，初步分析中草藥成分、作用靶點及相關(guān)通路[9]。為此本研究聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與動物實驗，探尋靈貓方治療CHB的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制，為靈貓方治療CHB的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1.1 靈貓方活性成分及靶點篩選 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)獲取仙靈脾、女貞子、黃芪、貓爪草、胡黃連、青皮化學(xué)組成成分[10]，根據(jù)口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18兩個屬性進行初步篩選；Genecards進行二次篩選并獲取作用靶點；Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行靶點驗證。

1.1.2 靈貓方-CHB靶點交集分析 Genecards數(shù)據(jù)庫獲取CHB相關(guān)靶點信息；Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行靶點驗證；Bioinformatics將靈貓方與CHB相關(guān)靶點取交集并繪制韋恩圖。

1.1.3 靈貓方-CHB靶點功能與通路富集分析 Bioinformatics數(shù)據(jù)庫獲取生物過程、細胞成分和分子功能3個參數(shù)進行基因本體(gene onotology,GO)富集分析；DAVID 6.8進行KEGG通路富集分析。

1.1.4 靈貓方-CHB免疫過程分析 CytoScape 3.8.0對交集靶點進行免疫過程分析，設(shè)定生物種類為“Homo sapiens”， ClueGO設(shè)定為“Immue System Process”，可信度設(shè)定為“P≤0.01”得到ClueGO免疫網(wǎng)絡(luò)。

1.2 動物實驗

1.2.1 動物 C57BL/6N雄性小鼠，3周齡，30只，SPF級，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司上海分公司。實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(浙)2019-0001，實驗動物使用許可證編號：SYXK(滬)2017-0014，實驗動物合格證編號：20211012Abzz0619000774。北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司上海分公司SPF級飼養(yǎng)室飼養(yǎng)、造模與觀察。所有實驗均遵照國家相關(guān)實驗動物的使用、福利和倫理學(xué)要求等規(guī)定。

1.2.2 藥物、試劑 實驗所用藥物為仙靈脾15 g、女貞子15 g、黃芪15 g、貓爪草15 g、胡黃連9 g、青皮9 g。參照既往實驗基礎(chǔ)，以人鼠劑量9.1倍換算，每只小鼠每次按照11.83 g/kg體質(zhì)量灌胃。所用藥物均為中藥配方顆粒，均由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(生產(chǎn)批號：仙靈脾20056134、女貞子21066074、黃芪20116104、貓爪草19076164、胡黃連20092211、青皮21046274)。IFNα試劑盒(GenXspan，貨號GXP557484)；IFNβ試劑盒(GenXspan，貨號GXP557388)；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(TIANGEN，貨號 DP117)；PrcccDNA ShB2m、pCMV-Cre質(zhì)粒為本實驗室所有；大腸桿菌DH5α為本實驗室保存。

1.2.3 質(zhì)粒準備 PrcccDNA ShB2m及pCMV-Cre質(zhì)粒均用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒制備，操作步驟大致如下：從轉(zhuǎn)染的細菌平板中挑取生長良好的單菌落，PrcccDNA ShB2m在含50 μg/mL氨芐、pCMV-Cre在含50 μg/mL卡那的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃搖菌(220 r/min)過夜。4 ℃離心棄上清后，依次加入溶液P1、P2、P3，QF緩沖液洗脫，異丙醇沉淀，100%乙醇清洗并溶于TE緩沖液，即獲取無內(nèi)毒素的高濃度質(zhì)粒。

1.2.4 HBV小鼠模型構(gòu)建及分組 采用水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)建立HBV小鼠模型。采用隨機數(shù)字表法分為3組，每組10只：模型及靈貓方組小鼠尾靜脈高壓水注射1.5 mL含6 μg PrcccDNA ShB2m及pCMV-Cre質(zhì)粒的生理鹽水，正常組注射等量生理鹽水。第3天采集小鼠眼眶靜脈血，ELISA分析血清中HBsAg、HBeAg的水平。靈貓方組小鼠按10 mL/kg體質(zhì)量灌胃，2次/d，正常組與模型組小鼠以等體積飲用水灌胃，共灌胃3 d。

1.2.5 血清ELISA檢測 結(jié)束后禁食12 h，用2%戊巴比妥鈉3 mL/kg腹腔注射麻醉，打開腹腔，經(jīng)下腔靜脈采血，3000 r/min離心15 min后吸取血清，-80 ℃低溫保存。按照ELISA試劑盒說明書檢測各樣本HBsAg、HBeAg、IFNα、IFNβ水平。

2 結(jié)果

2.1 靈貓方活性成分及靶點篩選 TCMSP顯示靈貓方含有488種化學(xué)成分，經(jīng)初步篩選后獲得75種活性成分，二次篩選后獲得30種活性成分，Uniprot數(shù)據(jù)庫驗證后獲得22種活性成分，包括槲皮素(quercetin)、淫羊藿苷(Icariin)、山柰酚(kaempferol)等(表1)。Genecards獲取靈貓方成分作用靶點8144個，合并后刪除重復(fù)項共得到靶點6078個，Uniprot數(shù)據(jù)庫驗證后獲得6059個作用靶點。

表1 靈貓方22種活性成分

2.2 靈貓方-CHB靶點交集分析 以“CHB”為搜索內(nèi)容，Genecards數(shù)據(jù)庫獲取530個疾病靶點，Uniprot數(shù)據(jù)庫驗證后獲得481個CHB相關(guān)靶點。靈貓方活性成分作用靶點與CHB相關(guān)靶點取交集，通過Bioinformatics繪制韋恩圖，得到靈貓方-CHB共同靶點387個(圖1)。

圖1 基于GeneCards數(shù)據(jù)庫預(yù)測的靈貓方-CHB靶點

2.3 靈貓方治療CHB生信分析 對387個靶點進行GO生物功能富集分析，獲取可信度最高的前5個數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示靈貓方主要參與的生物學(xué)過程包括：炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、固有免疫應(yīng)答、脂多糖細胞應(yīng)答、抗病毒反應(yīng)等；細胞成分涉及細胞外間隙、胞外區(qū)、質(zhì)膜外側(cè)面、細胞表面、漿膜等；分子功能包括：細胞因子活性、蛋白結(jié)合、抗原肽結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、同類蛋白結(jié)合等。KEGG信號通路分析獲取77個信號通路，主要靶點富集通路有乙型肝炎通路、Toll樣受體信號通路(圖2，表2)。

表2 KEGG通路富集結(jié)果

2.4 靈貓方-CHB免疫過程分析 CytoScape 3.8.0內(nèi)置ClueGO插件可視化呈現(xiàn)靈貓方與CHB 387個交集靶點的免疫過程網(wǎng)絡(luò)圖，以及由KEGG富集分析獲取的靈貓方治療乙型肝炎32個交集靶點的免疫過程網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。靈貓方治療乙型肝炎的免疫過程主要涉及Ⅰ型IFN信號通路，以及T淋巴細胞免疫相關(guān)過程。

注：a，靈貓方-CHB靶點基因GO分析圖；b，靈貓方-CHB靶點基因KEGG分析圖。

注：a，靈貓方-CHB免疫過程圖；b，靈貓方-乙型肝炎免疫過程圖。

2.5 動物實驗 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3 d后采集小鼠眼眶靜脈血，ELISA分析顯示：HBsAg滴度模型組與靈貓方組在治療前無明顯差異(P>0.05)；予以靈貓方干預(yù)3 d后，與模型組比較，靈貓方組HBsAg滴度明顯下降(P<0.05)，且HBsAg下降幅度較模型組亦有明顯提升(P<0.001)(表3)。HBeAg滴度模型組與靈貓方組在治療前無明顯差異(P>0.05)；予以靈貓方干預(yù)3 d后，與模型組比較，靈貓方組HBeAg滴度明顯下降(P<0.05)，且HBeAg下降幅度較模型組亦有明顯提升(P<0.05)(表3)。

表3 靈貓方對HBV模型鼠HBsAg、HBeAg的影響

靈貓方干預(yù)3 d后，正常組IFNα水平與模型組比較無明顯差異(P>0.05)，靈貓方組IFNα水平較正常組與模型組均顯著上升(P值均<0.001)；正常組IFNβ水平與模型組無明顯差異(P>0.05)，靈貓方組IFNβ水平較正常組與模型組均顯著上升(P值均<0.001)(表4)。

表4 靈貓方對HBV模型鼠Ⅰ型IFN的影響

3 討論

中醫(yī)學(xué)認為CHB病機特點是濕熱疫毒隱伏血分，郁久傷陰導(dǎo)致“肝腎陰虛”，久病“陰損及陽”或素體脾腎虧虛感受濕熱疫毒導(dǎo)致“脾腎陽虛”；本病的病性屬本虛標實，虛實夾雜。20世紀70年代上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病科率先提出補腎為主、清化為輔的治療原則，靈貓方便是在此基礎(chǔ)之上創(chuàng)立。前期研究表明，靈貓方可促進pHBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2 細胞的Ⅰ、Ⅲ型IFN表達，增強固有免疫功能[4]；提高CHB患者外周血NK細胞數(shù)量及其胞內(nèi)外TLR3的表達水平，調(diào)節(jié)機體免疫功能[7]。

本研究篩選出387個靈貓方治療CHB的作用靶點，GO富集分析發(fā)現(xiàn)靈貓方主要參與免疫應(yīng)答及抗病毒反應(yīng)等生物學(xué)過程；KEGG富集分析篩選出32個靈貓方治療乙型肝炎的作用靶點；對387個交集靶點及32個CHB相關(guān)靶點進行ClueGO分析發(fā)現(xiàn)，靈貓方主要通過調(diào)控Ⅰ型IFN信號通路及T淋巴細胞免疫應(yīng)答，從而實現(xiàn)治療CHB的作用。

CHB免疫發(fā)病機制十分復(fù)雜，至今尚未完全闡明[11-12]。IFN系統(tǒng)在HBV天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[13]。Ⅰ 型IFN通過與 Ⅰ 型IFN受體(IFNAR1)結(jié)合，激活JAK/STAT通路，誘導(dǎo)多種IFN刺激基因，從而抑制HBV的復(fù)制[14]。其中TRIM14通過阻斷DDB1-HBx-Smc復(fù)合物的形成來抑制HBV復(fù)制[15]，而APOBEC3A/B則在HBV cccDNA的核降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。

本研究從靈貓方對Ⅰ型IFN的調(diào)控作用，闡釋靈貓方治療CHB的機制，為臨床運用靈貓方治療CHB提供了依據(jù)。限于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法論的局限性以及中藥組分在煎煮時發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的復(fù)雜性，本研究未將靈貓方煎煮后的化學(xué)成分以及靈貓方活性成分在體內(nèi)的代謝物納入分析，后續(xù)將在此基礎(chǔ)上進一步篩選，進而明晰靈貓方治療CHB的主要調(diào)控靶點。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：馬利節(jié)、朱曉駿負責(zé)課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；林佳成、王芳參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；孫學(xué)華、高月求負責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。