何 宇,呂衛(wèi)光, 鄭憲清, 張翰林, 李雙喜, 張娟琴, 張海韻，白娜玲**

菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下施肥方式對(duì)土壤編碼堿性磷酸酶基因微生物群落的影響*

何 宇1,2,呂衛(wèi)光1,3,4,5, 鄭憲清1,3,4,5, 張翰林1,3,4, 李雙喜1,3,4,5, 張娟琴1,3, 張海韻1,4，白娜玲1,3,4,5**

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所，上海 201403；2.上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部上海農(nóng)業(yè)環(huán)境與耕地保育科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站，上海 201403；4.上海市農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)站，上海 201403；5.上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201403）

為明確菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下施肥方式對(duì)土壤編碼堿性磷酸酶基因的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響機(jī)制，通過Illumina MiSeq高通量測(cè)序手段，系統(tǒng)分析了4種不同施肥方式，即不施肥（CK）、施常規(guī)化肥（CF）、施有機(jī)肥（OF）、有機(jī)無機(jī)肥混施（MF）對(duì)花菜收獲時(shí)0?20cm土層土壤理化性質(zhì)、堿性磷酸酶（ALP）、微生物量磷（MBP）以及微生物群落的影響。結(jié)果表明：（1）與CK相比，OF處理可顯著提高土壤有機(jī)質(zhì)、總氮、速效磷和Ca含量47.83%、38.46%、104.81%和69.21%（P<0.05）；OF和MF處理均顯著提高ALP活性；CF和OF分別顯著增加MBP含量56.12%和195.16%，OF處理中MBP含量最高（105.40mg·kg?1）；（2）菜田種養(yǎng)結(jié)合模式不同施肥處理中假單胞菌屬（）為優(yōu)勢(shì)屬，CF和MF較CK顯著降低了假單胞菌屬相對(duì)豐度33.39%和45.52%；施肥降低土壤微生物Chao1指數(shù)，MF提高其多樣性（Simpson）和均勻度（Simpsoneven）；（3）影響微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)境因子為MBP、AP、ALP；微生物α多樣性指數(shù)與土壤性狀指標(biāo)無顯著相關(guān)性。因此，菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下，不同施肥處理改變了土壤理化和生物性質(zhì)，從而驅(qū)動(dòng)了土壤微生物群落組成、結(jié)構(gòu)和多樣性變化。

菜田種養(yǎng)結(jié)合；施肥方式；堿性磷酸酶；基因；高通量測(cè)序

傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)單一種植與養(yǎng)殖分離的生產(chǎn)方式，導(dǎo)致原本互補(bǔ)的種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)成為面源污染的首要來源，且降低了農(nóng)業(yè)綜合經(jīng)濟(jì)效益[1]。大量研究表明，立體生態(tài)種養(yǎng)能夠發(fā)揮生物群體組合的共同功能，實(shí)現(xiàn)物種層次、能量循環(huán)、物質(zhì)轉(zhuǎn)化和技術(shù)等要素的優(yōu)化，是提高農(nóng)業(yè)收入和改善生態(tài)環(huán)境的有效途徑，如稻-漁種養(yǎng)、稻-鴨種養(yǎng)、漁-菜共生等模式[2?4]。例如，將曝氣生物濾池與蔬菜栽培相結(jié)合的密閉循環(huán)水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)，蔬菜和羅非魚均生長(zhǎng)良好，且保證了95%以上水資源持續(xù)再生[5]。結(jié)合生物浮床技術(shù)的水培蔬菜和水產(chǎn)動(dòng)物共生為經(jīng)典的蔬菜種養(yǎng)結(jié)合模式，但該模式限制了蔬菜種植種類和生長(zhǎng)需求；而水旱共作的菜田種養(yǎng)模式防旱防澇，擴(kuò)大了作物和水產(chǎn)動(dòng)物選擇范圍，還有利于改善系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)地環(huán)境[6]，同時(shí)，仿野生養(yǎng)殖的水產(chǎn)動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量好、多訂單貿(mào)易[2,7]。

磷是植物必需的常量養(yǎng)分之一，更是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中至關(guān)重要的營(yíng)養(yǎng)元素，但中國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中磷當(dāng)季利用率僅為5%～25%[8]。土壤有機(jī)磷占磷素總量的30%～80%，但不能直接被植物利用，需先在磷酸酶作用下轉(zhuǎn)化為無機(jī)磷才可用于植物生長(zhǎng)代謝。堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase, ALP）是土壤有機(jī)磷水解為可供植物利用的無機(jī)磷的關(guān)鍵酶，其基因家族主要包括、、等。在陸地生態(tài)系統(tǒng)中出現(xiàn)頻率最高，可作為關(guān)鍵生物指示物用于研究土壤有機(jī)磷的轉(zhuǎn)化[9]。低磷條件下，誘導(dǎo)基因上調(diào)，增加磷酸鹽吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)的酶，共同構(gòu)成磷脅迫調(diào)節(jié)子，從而加速土壤有機(jī)磷的轉(zhuǎn)化過程；而在磷充足的條件下，基因表達(dá)受到抑制，ALP活性降低，有利于有機(jī)磷的穩(wěn)定積累[10]。Luo等[9]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期有機(jī)無機(jī)肥混施和無機(jī)肥單施分別顯著增加和降低了土壤中微生物豐度。長(zhǎng)期施化肥處理中速效磷（Available phosphorous, AP）含量提高，磷素充足，使得細(xì)菌群落豐度和多樣性指數(shù)均顯著降低[11]。但王靜等[12]指出，有機(jī)肥和有機(jī)無機(jī)配施處理中的土壤細(xì)菌、真菌、功能微生物的豐度和ALP活性都顯著高于不施肥對(duì)照和無機(jī)肥處理。環(huán)境因子如氣候、水分、土壤類型、pH、土地利用方式、農(nóng)藝措施和養(yǎng)分濃度均可影響ALP活性和微生物的豐度、多樣性和群落結(jié)構(gòu)[13]。

由于環(huán)境因子的變化，施肥方式對(duì)土壤微生物的影響尚不明確，目前關(guān)于草原或常規(guī)農(nóng)田的研究較多，但對(duì)水旱共作菜田種養(yǎng)結(jié)合系統(tǒng)的研究還鮮有報(bào)道。因此，本研究依托上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院菜田種養(yǎng)結(jié)合（花菜-芋艿輪作）定位試驗(yàn)站，以花菜季為研究對(duì)象，探究不同施肥方式（不施肥、施常規(guī)化肥、施有機(jī)肥和有機(jī)無機(jī)混施）對(duì)土壤理化性質(zhì)、ALP及微生物等指標(biāo)的影響，用于評(píng)價(jià)不同施肥方式的培肥與增產(chǎn)效果，揭示磷轉(zhuǎn)化過程中的重要功能菌類群，以期為菜田種養(yǎng)結(jié)合模式構(gòu)建科學(xué)合理的施肥制度提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行綜合試驗(yàn)站（30°53'N, 121°23'E）菜田種養(yǎng)結(jié)合試驗(yàn)小區(qū)開展，站內(nèi)年平均氣溫為15.8℃，年平均降水量為1178.0mm。土質(zhì)為黏壤土，作物種植模式為花菜（品種為“臺(tái)松”）-芋艿（品種為“崇明香酥芋”）輪作，已種植3a。試驗(yàn)地區(qū)土壤2015年初始理化指標(biāo)為，pH7.48，有機(jī)質(zhì)（SOM）20.08g·kg?1，總氮（TN）1.85g·kg?1，總磷（TP）2.64g·kg?1，速效氮（AN）77.44mg·kg?1，速效磷（AP）35.90mg·kg?1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

花菜種植和收獲時(shí)間分別為2018年9月28日和2019年4月2日。試驗(yàn)設(shè)置4處理，即不施肥（CK）；施常規(guī)化肥（CF）；施有機(jī)肥（OF）；有機(jī)無機(jī)混施（MF）。小區(qū)為完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。單個(gè)小區(qū)包括環(huán)形溝和種植區(qū)，種植區(qū)面積24.00m2，水域面積13.44m2（圖1）。投放水生動(dòng)物種類為黃鱔+泥鰍+鯽魚，其投放量為黃鱔75kg·hm?2，泥鰍15萬尾·hm?2，鯽魚75kg·hm?2。水產(chǎn)動(dòng)物以誘集燈捕獲飛蟲及水中營(yíng)養(yǎng)為食物，不額外投加餌料。作物收獲后將地上部秸稈及根茬移除，水產(chǎn)動(dòng)物也一并捕撈收集，農(nóng)田管理措施與當(dāng)?shù)馗弋a(chǎn)田一致。

施肥處理為等氮磷鉀處理，施用的N、P（P2O5）和K（K2O）肥分別約為402、118和285kg·hm?2。施肥主要分為基肥、蓮座肥、花球初期肥、花球中期肥等。OF中有機(jī)肥全部用作基肥，折算為每個(gè)小區(qū)施用有機(jī)肥48.22kg。MF處理中施入約25%有機(jī)肥作為基肥，其余部分用無機(jī)肥補(bǔ)足。具體肥料用量見表1。

1.3 項(xiàng)目觀測(cè)

1.3.1 土壤生物性質(zhì)和理化性質(zhì)的觀測(cè)

花菜收獲后，各小區(qū)種植區(qū)選取若干分布均勻且具代表性的采樣點(diǎn)，依據(jù)“S”形五點(diǎn)采樣法用直徑4cm不銹鋼采土器采集0-20cm土壤樣品，并去除土壤表層枯葉、石子及根系。將同小區(qū)樣品均勻混合后裝入聚乙烯封口袋中，做好標(biāo)記。土樣經(jīng)過自然風(fēng)干后研磨過0.25mm土壤篩，用于測(cè)定土壤酶活性。ALP活性采用磷酸苯二鈉比色法測(cè)定，加入硼酸鹽緩沖液，37℃下培養(yǎng)，以每克土每24h酶促反應(yīng)產(chǎn)生的酚的mg數(shù)表示。微生物量磷（MBP）指土壤中所有活體微生物中所含有的磷，主要成分是核酸、磷脂等易礦化有機(jī)磷及部分無機(jī)磷，是有效養(yǎng)分的儲(chǔ)備庫，測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[14]中的滅菌-NaHCO3法。土壤SOM測(cè)定采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法，土壤pH采用電位法（水:土=2.5:1）測(cè)定，TN含量采用凱氏定氮法-自動(dòng)定氮儀測(cè)定，TP（以P2O5計(jì)）采用酸溶-鉬銻抗比色法測(cè)定，AP采用0.5M NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定[15]。

圖1 菜田種養(yǎng)結(jié)合模式小區(qū)示意圖

表1 試驗(yàn)處理及肥料用量（kg·hm?2）

注：有機(jī)肥2-0.6-1.5；復(fù)合肥15-15-15；尿素中含氮量46%；過磷酸鈣中含磷量16%；硫酸鉀中含鉀量50%。CK：不施肥；CF：施常規(guī)化肥；OF：施有機(jī)肥；MF：有機(jī)無機(jī)混施。下同。

Note: Organic fertilizer: 2-0.6-1.5; compound fertilizer: 15-15-15; urea contains 46% nitrogen; superphosphate (SP) contains 16% phosphorus; potassium sulfate (PS) contains 50% potassium. In the treatments, CK: no fertilization; CF: conventional chemical fertilizer; OF: organic fertilizer; MF: organic-inorganic mixed fertilizer. The same as below.

1.3.2 土壤樣品DNA提取及高通量測(cè)序

將花菜收獲季所取土樣除去雜質(zhì)，分成兩部分，一部分用于測(cè)定土壤酶活性和理化性質(zhì)，另一部分存于-80℃用于土壤DNA提取。按照MiBio PowerSoil?DNA Isolation Kit試劑盒手冊(cè)的操作步驟提取土壤微生物總DNA，并使用超微量分光度計(jì)檢測(cè)總DNA濃度和質(zhì)量。利用引物序列ALPS-F730（5'-CAGTGGGACGACCACGAGGT-3'）和ALPS-1101（5'-GAGGCCGATCGGCATGTCG-3'）擴(kuò)增基因，片段長(zhǎng)度約371bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為PCR Mix 12.5μL，上下游引物（10mM）各1μL，DNA模板1μL，H2O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)參數(shù)為94℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。高通量測(cè)序送由上海某公司采用Illumina MiSeq平臺(tái)完成。

數(shù)據(jù)分析主要包括原始數(shù)據(jù)處理、操作分類單元（OTU）篩分與歸類、α多樣性、環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析等。經(jīng)質(zhì)控及數(shù)據(jù)處理后得到可用于后續(xù)分析的高質(zhì)量序列（Clean Data），按照相似度97%以上進(jìn)行OTU聚類，以豐度最大的序列為代表序列。比對(duì)數(shù)據(jù)庫為美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）本地核酸序列數(shù)據(jù)庫（Nucleotide Sequence Database，NT）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的整理與統(tǒng)計(jì)分析用Excel 2020和SPSS 16.0的one-way ANOVA法，采用ORIGIN 2019和R語言繪制柱形圖、扇形圖、韋恩圖（Venn）、基于距離的冗余分析（distance-based Redundancy Analysis，db-RDA）等。

2 結(jié)果與分析

2.1 種養(yǎng)結(jié)合模式下施肥方式對(duì)土壤微生態(tài)環(huán)境的影響

由表2可見，不同施肥方式對(duì)菜田種養(yǎng)結(jié)合模式的土壤理化性質(zhì)有一定影響。菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下，各處理花菜土壤均呈弱堿性，pH在7.96～8.69，處理間差異不顯著，說明土壤酸堿性未受到施肥方式的影響。施肥方式對(duì)土壤總磷（TP）含量也無顯著影響。施肥方式對(duì)土壤中SOM含量有一定影響，其中有機(jī)肥（OF）處理中SOM含量最高（2.72%），顯著高于其它處理（P<0.05），其它三個(gè)處理間差異不顯著。從數(shù)值看，有機(jī)無機(jī)混施（MF）處理中SOM含量次高（2.09%），常規(guī)化肥（CF）處理有機(jī)質(zhì)含量最低（1.62%），說明有機(jī)肥施入會(huì)使SOM含量提高，而化肥則降低SOM含量。土壤TN含量與SOM類似，在OF和MF處理中含量較高，相較于CK增幅為30.77%～38.46%，在CK和CF處理中含量較低。有機(jī)肥的施加提高了土壤速效磷（AP）和鈣（Ca）含量，OF處理最顯著（P<0.05），與對(duì)照CK相比分別提高了104.81%和69.21%；MF處理次之，增幅為51.53%和36.64%。

不同施肥方式對(duì)菜田種養(yǎng)結(jié)合模式土壤生物性質(zhì)的影響不同（圖2）。菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下，OF和MF處理均顯著提高了土壤ALP酶活（P<0.05），分別為14.60μg·min?1·g?1和12.06μg·min?1·g?1，二者無顯著差異，可見有機(jī)肥施用有利于提高土壤堿性磷酸酶活性。土壤微生物量是土壤有機(jī)磷最為活躍的部分，是植物磷素營(yíng)養(yǎng)非常重要的來源。施肥方式同樣顯著影響了土壤微生物量磷（MBP），與CK相比，常規(guī)施肥（CF）和有機(jī)肥（OF）處理顯著提高了MBP含量（P<0.05），且OF處理中MBP含量最高（105.40mg·kg?1）；但MF處理中MBP含量與CK處理無顯著差異。

表2 花菜收獲時(shí)不同施肥處理的土壤理化性質(zhì)比較

注：SOM：土壤有機(jī)質(zhì)；TN：總氮；TP：總磷；AP：速效磷；Ca：鈣。表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，小寫字母表示處理間在0.05水平上的差異顯著性。下同。

Note: SOM: soil organic matter; TN: total nitrogen; TP: total phosphorus; AP: available phosphorus; Ca: calcium. The bar is the mean data ± SD; lowercase indicates significant difference among treatments at 0.05 level. The same as below.

圖2 菜田種養(yǎng)結(jié)合模式不同施肥處理下土壤堿性磷酸酶和微生物量磷比較

2.2 菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下施肥方式對(duì)土壤phoD微生物群落組成及多樣性的影響

2.2.1微生物群落物種組成分析

由圖3a和表3可知，種養(yǎng)結(jié)合模式下不同施肥處理改變了微生物群落結(jié)構(gòu)，但未顯著影響其群落組成。對(duì)相對(duì)豐度超過1%的門水平物種分析發(fā)現(xiàn)，土壤中優(yōu)勢(shì)菌門包括變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes），占總細(xì)菌群落數(shù)的97.56%以上。其中變形菌門（Proteobacteria）的相對(duì)豐度為67.90%～85.56%，放線菌門（Actinobacteria）的相對(duì)豐度為9.35%～28.61%，芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的豐度范圍為1.89%～5.45%。此外，酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、浮霉菌門（Planctomycetes）和藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）的相對(duì)豐度也較高。相比于CK，OF處理顯著提高了變形菌門（Proteobacteria）相對(duì)豐度，增幅為13.13%，而CF和MF與對(duì)照無顯著差異。CF相較于CK顯著提高了放線菌門（Actinobacteria）的相對(duì)豐度，增幅為64.61%。CF和MF較CK處理顯著降低了芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）相對(duì)豐度96.51%和59.27%。對(duì)于浮霉菌門（Planctomycetes）而言，CF與OF處理間表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05）。不同處理間的酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）相對(duì)豐度差異并不顯著。

圖3 花菜收獲時(shí)不同施肥處理下phoD微生物門（a）、屬（b）水平群落相對(duì)豐度

表3 花菜收獲時(shí)不同施肥處理土壤phoD微生物門水平相對(duì)豐度（%）比較

由圖3b和表4可知，菜田種養(yǎng)結(jié)合模式不同施肥處理下屬水平相對(duì)豐度前10的微生物依次為假單胞菌（）、貪銅菌屬（）、鏈霉菌屬（）、慢生根瘤菌屬（）、多形單胞菌屬（）、溶桿菌屬（）、芽單胞菌屬（）、山崗單胞菌屬（）、游動(dòng)放線菌屬（）和變異桿菌屬（）。上述菌屬主要分布在變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）。假單胞菌屬（）為優(yōu)勢(shì)屬，豐度范圍為20.30%～37.26%。在菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下，不同施肥方式顯著影響了假單胞菌屬（）、鏈霉菌屬（）、多形單胞菌屬（）、芽單胞菌屬（）、山崗單胞菌屬（）的相對(duì)豐度（P<0.05）。與CK相比，CF和MF處理顯著降低了假單胞菌屬（）的相對(duì)豐度，降幅為33.39%和45.52%，芽單胞菌屬（）相對(duì)豐度降幅為64.14%和59.27%。對(duì)于有機(jī)肥施用而言，OF和MF顯著提高了多形單胞菌屬（）的相對(duì)豐度132.08%和83.02%；并顯著降低了山崗單胞菌屬（）的相對(duì)豐度，范圍為14.97%～70.05%。其他屬水平微生物各處理間差異不顯著。

表4 花菜收獲時(shí)不同施肥處理下土壤phoD相對(duì)豐度（%）前10屬水平物種比較

2.2.2 對(duì)微生物群落α多樣性的影響分析

Venn圖分析表明（圖4a），4個(gè)處理中共有的OTUs數(shù)目為617個(gè)，占總OTUs數(shù)目的8.14%。CK、CF、OF、MF處理中獨(dú)有的OTUs數(shù)分別為1748、1156、791和935，分別占總OTUs數(shù)目的23.06%、15.25%、10.43%和12.33%。CK、CF、OF、MF處理中所包含的總OTUs數(shù)分別為4068、2960、2717和2762。各處理所包含的OTUs數(shù)及獨(dú)有OTUs數(shù)均以CK最多，OF和MF最少。表明施肥減少了土壤微生物類群。共有的OTUs中，有15個(gè)OTUs數(shù)超過1%，主要分布在變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）（圖4b）。

表5表明，菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下，施肥方式顯著影響了土壤微生物豐富度（Chao1）、多樣性（Simpson）和均勻度（Simpsoneven）（P<0.05）。不管是施加無機(jī)肥還是有機(jī)肥均顯著降低了微生物的Chao1值，范圍為33.40%～35.80%。Simpson指數(shù)值越大，群落多樣性越低，MF處理中土壤樣本多樣性高于OF處理（P<0.05），但與CK相比，均無明顯差異。Simpsoneven指數(shù)為均勻度指標(biāo)，施肥處理（CF、OF、MF）提高了土壤微生物均勻度，其中MF處理最高，為0.05。而對(duì)于Shannon值，各處理間無顯著差異。因此，在菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下，肥料施用降低土壤微生物豐富度，且MF能夠增加微生物的多樣性和均勻度。

圖4 菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下不同施肥處理土壤中phoD微生物Venn圖(a)及共有OTUs分析(b)

表5 花菜收獲時(shí)不同施肥處理對(duì)土壤phoD微生物α多樣性的影響

2.3 菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下土壤phoD微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子關(guān)聯(lián)性分析

為避免較強(qiáng)多重共線性環(huán)境因子的影響，通過方差膨脹因子（variance inflation factor，VIF）分析，篩選去除VIF值>10的無用環(huán)境因子，篩選后的7個(gè)環(huán)境因子指標(biāo)用于進(jìn)行基于unweighted-unifrac距離的冗余分析（db-RDA）。由圖5可見，不同施肥處理對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，各環(huán)境因子均與CAP1軸正相關(guān)。CAP1和CAP2軸分別解釋了微生物群落組成變化的12.35%和9.91%，其中CAP1較好地將施加化肥處理（施常規(guī)化肥CF和有機(jī)無機(jī)混施MF）與未施加化肥處理（對(duì)照CK和施有機(jī)肥OF）區(qū)分開來，但有無有機(jī)肥施加處理間的區(qū)分度不明顯。從整體看來，環(huán)境因子對(duì)CF和MF處理影響更大。同時(shí)，影響微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)境因子為微生物量磷（MBP）（P=0.006）和速效磷（AP）（P=0.028），而堿性磷酸酶（ALP）次之，其P值為0.091。如表6所示，相關(guān)性分析表明，菜田種養(yǎng)結(jié)合條件下，花菜收獲季土壤中ALP活性與除pH外的土壤理化性狀（SOM、TN、TP、AP和Ca）和MBP呈顯著正相關(guān)；但微生物α多樣性指數(shù)與土壤性狀無顯著相關(guān)性。Ca作為基因合成的ALP酶活性的輔酶因子，可間接影響群落組成[9]，Ca與磷相關(guān)指標(biāo)（TP、AP、MBP、ALP）呈顯著正相關(guān)，但與微生物α多樣性指數(shù)無明顯相關(guān)關(guān)系。

圖5 菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下不同施肥處理phoD微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的db-RDA關(guān)聯(lián)分析

表6 土壤性狀與phoD微生物群落α多樣性的Pearson相關(guān)分析

注：*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）。MBP：微生物量磷，ALP：堿性磷酸酶。

Note:*is P<0.05;**is P<0.01. MBP: microbial biomass phosphorus; ALP: alkaline phosphatase.

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

3.1.1 菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下不同施肥處理對(duì)土壤理化和生物性狀的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下，施有機(jī)肥處理（OF）顯著增加了土壤有機(jī)質(zhì)（SOM）、總氮（TN）、速效磷（AP）和鈣（Ca）含量（P<0.05），有機(jī)無機(jī)混施（MF）中養(yǎng)分含量增幅次之，這與前人研究結(jié)果一致[12]。施常規(guī)化肥處理（CF）則降低了土壤SOM含量，蔣太明等[16]在黃壤土中也發(fā)現(xiàn)了同樣趨勢(shì)。鄔奇峰等[17]以杭嘉湖平原典型稻麥輪作區(qū)長(zhǎng)期定位施肥試驗(yàn)土壤為對(duì)象，發(fā)現(xiàn)所有施肥處理均降低土壤pH、提高SOM和TN/TP/TK含量，且秸稈與化肥配施、有機(jī)肥、有機(jī)無機(jī)混施等處理效果更顯著。該結(jié)果的不同可能是由于作物種類、土壤質(zhì)地、土地利用方式等原因的影響。本次試驗(yàn)也同樣觀察到，OF處理組養(yǎng)分釋放慢，導(dǎo)致花菜產(chǎn)量低，MF的花菜產(chǎn)量是OF的4.56倍?；瘜W(xué)肥料可及時(shí)為作物提供所需速效養(yǎng)分；有機(jī)肥不僅為土壤微生物提供碳源，還間接提高養(yǎng)分累積的供應(yīng)能力；有機(jī)無機(jī)配施則在避免單施有機(jī)肥養(yǎng)分釋放慢、速效養(yǎng)分含量不足的同時(shí)，也避免了化肥引起的土壤有機(jī)質(zhì)水平偏低的問題[18]。

土壤酶活性受施肥等因素影響較大，磷酸酶活性高低直接影響著土壤中有機(jī)磷的分解轉(zhuǎn)化及其生物有效性[19]。本試驗(yàn)中，CF處理中速效養(yǎng)分無機(jī)磷的釋放抑制了ALP活性（8.46μg·min?1·g?1），而有機(jī)磷肥料的施用（OF和MF處理）則促進(jìn)了ALP活性（12.06～14.60μg·min?1·g?1），可見有機(jī)肥添加有利于提高土壤酶活性，從而有利于養(yǎng)分循環(huán)與周轉(zhuǎn)，與前人報(bào)道一致[11,20]。有機(jī)肥施用主要增加土壤有機(jī)磷，有機(jī)磷需在微生物參與下逐步礦化為植物可直接利用的磷[21]，因此，ALP活性在OF和MF處理中顯著提高。花菜收獲時(shí)，OF處理中土壤MBP值最高，可能原因在于有機(jī)肥養(yǎng)分釋放緩慢，此時(shí)磷素充足，含磷微生物可在生物量中儲(chǔ)存磷素[22]。在土壤可利用磷含量較低時(shí)，微生物為了獲得更多磷素，加速其編碼蛋白的功能[23?25]，即堿性磷酸酶（ALP）活性增加。但在本研究中，ALP活性與土壤性狀（SOM、TN、TP、AP、MBP和Ca）呈顯著正相關(guān)，且MBP含量與SOM、AP、ALP和Ca呈顯著正相關(guān)。已有研究報(bào)道ALP與土壤pH、TN、SOM等指標(biāo)呈正相關(guān)，與總磷（TP）和生物可利用的速效磷（AP）呈負(fù)相關(guān)[9]，本試驗(yàn)中結(jié)果不一致的主要原因可能是與菜田種養(yǎng)結(jié)合模式的水旱微環(huán)境、土壤微生物群落的數(shù)量及活性有關(guān)[6,14]。因此，后續(xù)研究應(yīng)注重花菜不同生長(zhǎng)時(shí)期的節(jié)點(diǎn)分析，進(jìn)一步闡明土壤中ALP和MBP的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。

3.1.2 菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下不同施肥處理對(duì)土壤微生物群落及多樣性的影響

微生物群落對(duì)磷肥投入的反應(yīng)在不同環(huán)境地點(diǎn)和試驗(yàn)條件下有所不同。本試驗(yàn)表明，變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）是優(yōu)勢(shì)菌門，所占豐度為93.01%～96.85%，這與前人的研究結(jié)果一致[26]，但廖梓鵬[13]對(duì)珠三角農(nóng)田土壤微生物分析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)門為未培養(yǎng)細(xì)菌（uncultured_Bacteria），其次為變形菌門（Proteobacteria），這可能與土壤類型及種植模式不同有關(guān)。假單胞菌（）為不同施肥處理的優(yōu)勢(shì)屬，相對(duì)豐度最高（20.30%～37.26%）。而在常規(guī)草地或耕地中的優(yōu)勢(shì)微生物主要為鞘氨醇單胞菌（）、芽孢桿菌（）、甲基桿菌（）和慢生根瘤菌（）等[21,27]，可見菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下的微生物群落組成有別于其他農(nóng)田或種植模式。豐度前10物種中有顯著差異的屬為假單胞菌（）、鏈霉菌（）、多形單胞菌（）、芽單胞菌（）和山崗單胞菌（）。假單胞菌（）在對(duì)照處理（CK）中含量最高，可能在貧磷條件下的有機(jī)磷礦化中發(fā)揮重要作用[11]。鏈霉菌（）為環(huán)境中常見的生防益生菌，能夠產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[28]；其在本試驗(yàn)中的豐度變化推測(cè)可能與花菜的長(zhǎng)勢(shì)情況有關(guān)。多形單胞菌（）為固氮菌，在OF和MF處理中豐度的增加，推測(cè)該種微生物可能將磷礦化與氮固定相耦合[29]。而與氮素循環(huán)相關(guān)的芽單胞菌（）和以真菌菌絲體為食的山崗單胞菌（）的相對(duì)豐度均由于肥料施用呈現(xiàn)一定程度的降低，具體原因尚不明確[30]。此外，豐度較低且與氮、磷元素循環(huán)相關(guān)的慢生根瘤菌、中華根瘤菌、黃桿菌和節(jié)桿菌[9,31?32]，也受到了施肥的影響。因此，考慮到種養(yǎng)結(jié)合模式能夠顯著提高肥料養(yǎng)分利用效率[7]，該系統(tǒng)下的固氮、解磷相關(guān)功能菌在土壤氮循環(huán)和磷周轉(zhuǎn)間的耦合關(guān)系需加強(qiáng)研究。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下，肥料施用降低了土壤微生物豐富度（Chao1），但MF增加了微生物的多樣性（Simpson）和均勻度（Simpsoneven），說明有機(jī)無機(jī)混施有利于重塑微生物結(jié)構(gòu)?；趗nweighted-unifrac距離的冗余分析（db-RDA）表明，微生物群落結(jié)構(gòu)與pH、AP、ALP、Ca、TN、TP、MBP存在相關(guān)性，表明這些土壤理化和生物性質(zhì)在編碼堿性磷酸酶基因的微生物群落變化中發(fā)揮重要作用。其中MBP、AP、ALP的作用要強(qiáng)于其他土壤指標(biāo)，它們都是影響含土壤編碼堿性磷酸酶基因的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素[11]，涉及有機(jī)磷與無機(jī)磷之間轉(zhuǎn)運(yùn)、礦化和同化等過程。磷細(xì)菌對(duì)磷肥的不同反應(yīng)表現(xiàn)可能是由于磷肥的不同形式、土壤類型和試驗(yàn)條件造成的[33]。Pearson相關(guān)分析表明，微生物的α多樣性與任何環(huán)境因素均無顯著相關(guān)性，說明其對(duì)施肥方式的變化響應(yīng)不敏感，與Liu等的研究結(jié)果一致[33]。綜上所述，菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下，不同施肥處理改變了土壤理化和生物性質(zhì)，從而驅(qū)動(dòng)了土壤微生物群落組成、結(jié)構(gòu)和多樣性變化，有助于為種養(yǎng)結(jié)合模式合理施肥提供科學(xué)依據(jù)。

3.2 結(jié)論

（1）菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下，不同施肥處理影響了土壤理化性質(zhì)。其中施有機(jī)肥處理（OF）顯著提高了土壤有機(jī)質(zhì)（SOM）、總氮（TN）、土壤速效磷（AP）和鈣（Ca）含量，增幅分別為47.83%、38.46%、104.81%和69.21%（P<0.05）。有機(jī)無機(jī)混施處理（MF）則分別提高了SOM、TN、AP和Ca含量13.59%、30.77%、51.53%和36.64%。與對(duì)照處理（CK）相比，OF和MF均顯著提高了土壤堿性磷酸酶（ALP）活性67.05%和37.99%（P<0.05），二者無顯著差異。土壤微生物量磷（MBP）表現(xiàn)為CF和OF較CK分別顯著增加了56.12%和195.16%，且OF處理中MBP含量最高（105.40mg·kg?1）。

（2）菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下，土壤微生物優(yōu)勢(shì)菌門包括變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes），占總?cè)郝鋽?shù)的97.56%以上。相比于CK，OF處理顯著提高了變形菌門（Proteobacteria）的相對(duì)豐度13.13%；CF顯著提高了放線菌門（Actinobacteria）的相對(duì)豐度64.61%；CF和MF顯著降低了芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）相對(duì)豐度96.51%和59.27%。假單胞菌屬（）為優(yōu)勢(shì)屬，CF和MF處理較CK顯著降低了假單胞菌屬的相對(duì)豐度33.39%和45.52%。肥料施用降低土壤微生物豐富度（Chao1），MF增加了微生物的多樣性（Simpson）和均勻度（Simpsoneven）。

（3）菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下，施肥方式影響微生物群落結(jié)構(gòu)，影響微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)境因子為MBP、AP、ALP。微生物α多樣性指數(shù)與土壤性狀無顯著相關(guān)性；ALP與土壤SOM、TN、TP、AP、MBP和Ca等含量顯著正相關(guān)。

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Effects of Fertilization Regimes on Soil Alkaline Phosphatase Gene Encoding Microbial Community under the Integrated Planting and Breeding System in the Vegetable Field

HE Yu1,2, LV Wei-guang1,3,4,5, ZHENG Xian-qing1,3,4,5, ZHANG Han-lin1,3,4, LI Shuang-xi1,3,4,5,ZHANG Juan-qin1,3, ZHANG Hai-yun1,4, BAI Na-ling1,3,4,5

(1. Eco-environmental Protection Research Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403; 2. Faculty of Marine Ecology and Environment, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Shanghai Agri-environmental and Cultivated Land Conservation of Scientific Observation and Experiment Station, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shanghai 201403; 4. Shanghai Agri-environmental Protection Monitoring station, Shanghai 201403; 5. Shanghai Key Laboratory of Protected Horticulture Technology, Shanghai 201403)

A field experiment was systematically conducted, using Illumina MiSeq high-throughput sequencing, to analyze the impact of four different fertilizer application regimes (CK, no fertilization; CF, conventional chemical fertilizer; OF, organic fertilizer; MF, organic-inorganic mixed fertilizer) on the soil physicochemical properties, alkaline phosphatase (ALP), microbial biomass phosphorus (MBP), and(gene encoding alkaline phosphatase) microbial community in 0-20cm soil layer at cauliflower harvest season, thus identifying the underlying mechanism of effects of different fertilization regimes on the structure and diversity ofmicrobe under integrated planting and breeding system in vegetable field. The results showed that: (1) compared to CK, OF significantly increased the contents of soil organic matter, total nitrogen, available phosphorus and Ca by 47.83%, 38.46%, 104.81% and 69.21%, respectively (P<0.05); both OF and MF significantly increased ALP activity. The MBP content in CF and OF was improved by 56.12% and 195.16%, respectively, compared with CK; the MBP content in OF was the highest (105.40mg·kg?1). (2)was the dominant genus under different fertilization treatments. CF and MF significantly reduced the relative abundance ofby 33.39% and 45.52%, respectively, compared with CK. Fertilization decreased the Chao1 index, and MF increased both the diversity (Simpson index) and evenness (Simpsoneven index) of soilmicroorganisms. (3) MBP, AP, and ALP were the key environmental factors affecting themicrobial community structure. There was no significant correlation betweenmicrobial α diversity indexes and soil properties. Therefore, under the integrated planting and breeding system in vegetable field, different fertilization treatments changed soil physicochemical and biological properties, and thus drove the changes of composition, structure and diversity of soilmicrobial community.

Integrated planting and breeding system in the vegetable field; Fertilization regimes; Alkaline phosphatase;gene; High-throughput sequencing

10.3969/j.issn.1000-6362.2022.07.003

何宇,呂衛(wèi)光,鄭憲清,等.菜田種養(yǎng)結(jié)合模式下施肥方式對(duì)土壤編碼堿性磷酸酶基因微生物群落的影響[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)氣象,2022,43(7):538-550

2021?09?18

上海市科技興農(nóng)推廣項(xiàng)目[滬農(nóng)科推字（2021）第2-2號(hào)]；國(guó)家農(nóng)業(yè)環(huán)境奉賢觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站項(xiàng)目（NAES035AE03）；上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院卓越團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目[農(nóng)科創(chuàng)卓2022(008)]

白娜玲，副研究員，博士，主要從事微生物生態(tài)研究，E-mail：bainaling@saas.sh.cn

何宇，E-mail：646747331@qq.com