宋 浩,張 麗,張交兒,仇華吉,羅玉子 (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由ASF病毒(ASFV)引起的一種豬急性、熱性、廣泛出血性傳染病，病死率高達100%[1]。鑒于ASF對國家生豬生產(chǎn)及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)的嚴(yán)重危害，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物傳染病。該病可以通過多種途徑傳播，如通過感染的家豬、野豬、軟蜱、豬肉及其制品、受污染的車輛、人員、設(shè)施等傳播到其他地區(qū)[2-3]。ASFV感染豬可能表現(xiàn)出高熱、沉郁、厭食、皮膚發(fā)紺、嘔吐、鼻出血和便血等臨床癥狀，類似于豬瘟(classical swine fever，CSF)和豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and syndrome，PRRS)等其他豬病，需要通過實驗室診斷進行區(qū)分[4-5]。

2018年8月，ASF首次傳入我國遼寧省，隨后迅速蔓延至全國33個省市，嚴(yán)重威脅我國的生豬健康和穩(wěn)定生產(chǎn)，造成直接經(jīng)濟損失達數(shù)百億元。由于目前尚無商品化的ASF疫苗和治療手段，因此該病的防控主要依靠快速早期診斷和撲殺感染豬群。隨著ASFV在我國的長期流行和傳播，感染豬出現(xiàn)了非典型臨床癥狀，死亡率降低，具有很大的隱蔽性，給ASF防控帶來了挑戰(zhàn)。因此，可靠的早期診斷技術(shù)和流行病學(xué)監(jiān)測對ASF防控和凈化至關(guān)重要。本文從ASF的病原學(xué)、流行病學(xué)、最新的實驗室診斷技術(shù)研究進展進行綜述，以期提高人們對該病的認(rèn)識，掌握其流行趨勢，為其診斷及防控提供借鑒和思路。

1 病原學(xué)

ASFV是非洲豬瘟相關(guān)病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfivirus)的成員[6]。ASFV是一種胞質(zhì)雙鏈DNA(double-stranded DNA，dsDNA)病毒，具有線性的、無節(jié)段的基因組，長度為170～194 kb[7]，包含151～167個開放閱讀框(open reading frames,ORFs)；病毒基因組由中間的125 kb 保守區(qū)域和緊鄰末端的2個編碼多基因家族(multigene families，MGFs)的可變末端組成，MGFs包括MGF100、MGF110、MGF300、MGF360、MGF505/530等基因[8]。MGFs多與ASFV逃避宿主免疫系統(tǒng)有關(guān)，其長達20 kb的區(qū)域可以發(fā)生基因的缺失和插入，這些突變可能有助于病毒產(chǎn)生抗原變異，從而使病毒逃逸宿主免疫系統(tǒng)的攻擊[9-11]。ASFV病毒粒子結(jié)構(gòu)復(fù)雜(圖1)，有多層膜和蛋白質(zhì)層[12]，從內(nèi)到外依次是基因組(genome)、內(nèi)核心殼(core shell)、內(nèi)膜(inner envelope)、衣殼(capsid)、囊膜(outer envelope)。其最外層的蛋白外殼是一個二十面體的衣殼，主要由病毒基因B646L編碼的蛋白p72組成，基于B646L基因末端核苷酸的差異，可以將ASFV分為24種基因型[13]。

圖1 ASFV結(jié)構(gòu)示意圖

ASFV在不同溫度和pH下存活時間不同。在高溫環(huán)境下，56℃ 70 min或60℃ 20 min可滅活病毒。ASFV在pH值為4～10的無血清培養(yǎng)基中保持穩(wěn)定，但pH值低于4或者高于11.5，幾分鐘內(nèi)即會滅活病毒。ASFV對乙醚和氯仿敏感，此類有機溶劑可以通過破壞囊膜使病毒失活，但ASFV能夠抵抗蛋白酶和核酸酶的降解作用[14]。一些消毒劑，如2%～3%次氯酸鈉、2%氫氧化鈉、過硫酸氫鉀、0.3%福爾馬林作用30 min，均可滅活該病毒。

2 流行病學(xué)

2.1 ASF流行分布ASF最早于1921年在肯尼亞首次被發(fā)現(xiàn)，隨后在非洲大多數(shù)國家流行，并于20世紀(jì)中葉傳入歐洲[15]。1957年從非洲西南部安哥拉傳入葡萄牙，1959年再次傳入葡萄牙，然后經(jīng)過貿(mào)易往來傳播到西班牙。此后，疫情到達加勒比地區(qū)的一些國家(古巴、多米尼加共和國和海地)以及巴西，對這些國家的生豬行業(yè)以及鄉(xiāng)村零散養(yǎng)豬戶造成災(zāi)難性影響。1960年ASF傳入伊比利亞半島，并在30年后被根除。目前，ASF在意大利撒丁島的一些地區(qū)以及大多數(shù)撒哈拉以南的非洲國家仍然是地方流行病。

2007年，隨著疫情傳入歐洲高加索地區(qū)(格魯吉亞)，ASF在世界的流行分布發(fā)生了重大變化，歐洲各個地區(qū)都開始受到疫情波及，全球ASF疫情防控局勢惡化，疫情在2008年蔓延至亞美尼亞、俄羅斯和阿塞拜疆[16]，2012年傳入烏克蘭，2013年傳入白俄羅斯，2014年傳入拉脫維亞、波蘭、立陶宛和愛沙尼亞，2016年傳入摩爾多瓦，2017年傳入捷克共和國和羅馬尼亞[15,17]。2017年3月，俄羅斯聯(lián)邦伊爾庫茨克報告了ASF疫情，此地與之前報告疫情的地區(qū)相距數(shù)千公里，距離中國邊境僅約1 000 km。這標(biāo)志著該病首次從中東歐傳播到俄羅斯聯(lián)邦東部，距離中國邊境相對較近[18]。2018年6-7月，中國遼寧省沈陽市附近某豬場暴發(fā)ASF，這是我國首次暴發(fā)ASF疫情[19]。自此，ASF在中國迅速傳播，并在許多省市暴發(fā)，導(dǎo)致大量生豬死亡[20-21]；同年，歐洲部分國家(匈牙利、保加利亞和比利時)報告ASF疫情。2019年，蒙古、越南、柬埔寨、朝鮮、老撾、緬甸、東帝汶、菲律賓、韓國和印度尼西亞等我國臨近國家相繼暴發(fā)ASF；同年，該病傳入斯洛伐克和塞爾維亞。2020年，希臘、巴布亞新幾內(nèi)亞、印度、德國等無疫區(qū)國家接連被OIE通報首次發(fā)生ASF疫情。2021年7月，美國農(nóng)業(yè)部 (USDA)報告，從多米尼加共和國采集的豬樣本中發(fā)現(xiàn)了ASFV。自1921年ASF被確認(rèn)以來，全球數(shù)十個國家/地區(qū)暴發(fā)了ASF疫情(表1)。雖然ASFV不會對人類健康構(gòu)成風(fēng)險，但它嚴(yán)重威脅食品安全，并限制疫區(qū)國家的生豬生產(chǎn)，造成重大的經(jīng)濟損失。中國作為世界上最大的豬肉生產(chǎn)和消費國，豬肉需求占全球的1/2，ASF對中國的影響尤其嚴(yán)重。

表1 ASF流行過程

2.2 分子流行病學(xué)

2.2.1ASFV基因型分布多樣性 分子流行病學(xué)已被證明有助于調(diào)查ASF的流行病學(xué)模式，以及當(dāng)這種疾病引入新的地區(qū)時可能的原因?；诩t細(xì)胞吸附抑制(hemadsorption inhibition，HAI)試驗可以將32株ASFV分成8個血清群[22]?；诰幋ap72蛋白的單一基因序列可以確定24個具有多個亞型的地理相關(guān)基因型，這說明了ASF流行病學(xué)的復(fù)雜性[13]。

過去，研究人員通過酶切位圖繪制，對不同的基因組區(qū)域進行測序來分析ASFV的遺傳變異。當(dāng)前研究ASFV分子流行病學(xué)的方法是對編碼p72蛋白的B646L基因的3′端進行序列分析，至少可區(qū)分24種基因型[13]。但是，該分型不能區(qū)分病毒毒力的差異?；谝陨戏中停M一步對編碼內(nèi)膜蛋白p54的E183L基因的全長序列進行分析，可以辨別中等毒力的毒株。此外，對其他基因組區(qū)域如編碼p30蛋白的CP204L基因、位于I73R和I329L基因之間的串聯(lián)重復(fù)序列和B602L基因內(nèi)的中央可變區(qū)(CVR)進行分析，可以區(qū)分密切相關(guān)的毒株[23]。

ASFV基因型分布具有多樣性，其中基因Ⅰ和Ⅱ型流行最廣。在撒哈拉以南的非洲地區(qū)，有24種已知的ASFV基因型都已經(jīng)被鑒定出[23]。而基因Ⅰ型ASFV自2006年以來廣泛流行于部分歐洲地區(qū)，已有文獻證明基因Ⅰ型ASFV來自西非。2007年，在歐洲整個高加索地區(qū)檢測到來自非洲東南部的基因Ⅱ型ASFV。此后，基因Ⅱ型ASFV開始從格魯吉亞向周邊國家傳播。2018年，中國暴發(fā)了ASF疫情，ZHAO等[24]對從中國分離的ASFV進行序列分析，結(jié)果表明，傳入我國的ASFV屬于基因Ⅱ型，與格魯吉亞、俄羅斯、波蘭公布的毒株全基因組序列同源性約為99.95%。隨后，其他亞洲國家，如越南、韓國、老撾等相繼暴發(fā)了ASF疫情，有科研人員對分離株進行分析，證實了ASFV流行株為基因Ⅱ型?；谝陨系牧餍胁W(xué)分析，ASFV跨國境傳入的途徑有以下幾點：一是生豬及其產(chǎn)品的國際貿(mào)易和走私；二是國際旅客攜帶的豬肉及其產(chǎn)品；三是國際運輸工具上的餐廚剩余物；四是野豬遷徙。因此，面對ASF疫情的發(fā)生，有必要加強病毒溯源調(diào)查，并采用分子流行病學(xué)方法分析，以進一步查明來源途徑，更好地防控ASF。

2.2.2ASFV的基因重組 ASFV基因組包含1個約125 kb的保守中心區(qū)域和2個可變末端，可變區(qū)導(dǎo)致不同毒株基因組大小存在差異[25]。ASFV的基因組因發(fā)生點突變或者插入/缺失(indel)會導(dǎo)致表型的多樣性。例如，MGF成員的缺失，可能會降低病毒的復(fù)制或毒力，這可能有助于軟壁虱的病毒感染[26]。

基因重組是指控制不同性狀的基因重新組合，產(chǎn)生大量的變異類型，但只產(chǎn)生新的基因型，不產(chǎn)生新的基因。據(jù)報道，同源重組經(jīng)常發(fā)生在這幾類病毒中，如皰疹病毒、禽流感病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和冠狀病毒，同源重組在病毒進化中發(fā)揮了重要作用[27]。DIXON等[12]對幾個ASFV基因組進行了研究，結(jié)果表明ASFV在進化過程中發(fā)生了同源重組。然而，目前在基因組水平上缺乏對ASFV同源重組的全面研究，這種重組對病毒遺傳多樣性和進化的作用尚不清楚。最近，湖南大學(xué)研究團隊通過生物信息學(xué)方法分析了數(shù)據(jù)庫中已有的39個ASFV基因組，發(fā)現(xiàn)病毒基因組片段的indel對于基因組多樣性的貢獻遠(yuǎn)大于點突變(圖2)[28]。該研究證實了ASFV基因組存在的大量重復(fù)元件有利于基因重組的發(fā)生，導(dǎo)致了病毒基因組的多樣性以及病毒表型(如抗原/致病性等)的多樣性。

圖2 ASFV基因重組(A)和遺傳多樣性(B)[35]

ASFV在流行過程中，為了能夠在不同環(huán)境下生存，其基因組會發(fā)生一些突變和重組，導(dǎo)致變異株的出現(xiàn)。最近，我國國家ASF專業(yè)實驗室發(fā)現(xiàn)了低致死率的ASFV基因Ⅱ型變異株[29]。張艷艷等[30]從主動監(jiān)測的樣品中分離到1株源自湖北某地的ASFV變異株，經(jīng)基因組測序發(fā)現(xiàn)，其EP402R基因(CD2v)和上游相鄰的EP153R基因出現(xiàn)部分缺失，導(dǎo)致病毒血吸附特性喪失。動物感染試驗表明，變異株毒力低但傳播性強。病毒變異給ASF早期診斷帶來了阻礙，警示我們必須加強ASF流行病學(xué)監(jiān)測及流行株的基因組變異分析。

3 非洲豬瘟的實驗室診斷

開展ASF流行病學(xué)監(jiān)測，可對病原溯源，為該病流行趨勢提供預(yù)測、預(yù)警，更好地指導(dǎo)ASF防控。在進行流行病學(xué)調(diào)查過程中，快速準(zhǔn)確的診斷是前提。

當(dāng)前，ASFV實驗室診斷方法主要分為兩類，第一類為病原學(xué)診斷，包括針對病毒本身的檢測方法(病毒分離和紅細(xì)胞吸附試驗)以及針對病毒核酸的分子生物學(xué)檢測技術(shù)；第二類為血清學(xué)診斷，主要依靠檢測機體由于暴露于病毒而產(chǎn)生的抗體或感染個體中的病毒抗原。

3.1 病原學(xué)診斷

3.1.1病毒分離和紅細(xì)胞吸附試驗 病毒分離或紅細(xì)胞吸附(haemadsorption，HAD)試驗是檢測ASFV的“金標(biāo)準(zhǔn)”之一。ASFV可感染原代豬骨髓細(xì)胞、原代白細(xì)胞或肺泡巨噬細(xì)胞，并且在感染的細(xì)胞中進行復(fù)制，產(chǎn)生致細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)和HAD現(xiàn)象，這是ASFV感染細(xì)胞特有的特征，可用于診斷。HAD指的是感染ASFV的豬外周血單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞會吸附在豬紅細(xì)胞表面，而呈現(xiàn)出特征性的“玫瑰花環(huán)”，該方法是由MALMQUIST等[31]在1960年建立。但是，并非所有ASFV毒株都具有HAD特性，ASFV在流行過程中，會出現(xiàn)一些非紅細(xì)胞吸附毒株[32]。如果需要進一步確診，可采用PCR或者熒光抗體試驗(fluorescent antibody test，F(xiàn)AT)等方法進行驗證。通過檢測活病毒進行診斷有一定局限性，因為ASFV在我國屬于一類動物疫病病原，涉及活病毒操作有嚴(yán)格限制，必須在生物安全3級(P3)及以上實驗室開展。因此，病毒分離多用于病毒的分子生物學(xué)研究。

3.1.2病毒核酸檢測 病毒核酸檢測方法具有特異性強、靈敏度高和快速的特點，已成為ASFV檢測的主要方法[33]。目前，ASFV核酸檢測方法包括熒光定量PCR(qPCR)、全基因組測序、等溫核酸擴增法等。其中，qPCR是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的方法，也被OIE作為ASF早期診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”技術(shù)[34]。

(1)qPCR法:目前ASFV核酸檢測針對的位點主要是基因組中的高度保守區(qū)域，即以編碼p72蛋白的B646L基因作為檢測靶標(biāo)，也有少數(shù)使用9GL基因作為靶標(biāo)檢測ASFV。

qPCR比基于凝膠的普通PCR速度更快，靈敏度更高。在普通PCR的反應(yīng)體系基礎(chǔ)上加入熒光化學(xué)物質(zhì)，將熒光信號與DNA擴增聯(lián)系起來，最后通過機器讀取結(jié)果。常見的qPCR法有熒光染料法和探針法。以SYBR GreenⅠ為代表的核酸染料法通用性好，成本低，游離狀態(tài)下，SYBR GreenⅠ發(fā)出的熒光較弱，但是結(jié)合到雙鏈DNA的雙螺旋小溝區(qū)域后，熒光信號顯著增強。探針法主要是在PCR反應(yīng)中利用標(biāo)記熒光染料的特異性寡核苷酸探針來檢測產(chǎn)物，從而大大減少了假陽性的發(fā)生，專一性更高。目前，qPCR使用最廣泛的是TaqMan探針。為了及時控制突如其來的ASF疫情，2018-2019年，中國動物疫病預(yù)防控制中心對符合要求的ASFV檢測試劑盒先后進行2次評審，以快速應(yīng)對ASF診斷需求。2020年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布公告，要求所有未參加或未通過中國動物疫病預(yù)防控制中心比對試驗的ASFV診斷制品，以及通過比對試驗但目前未申請注冊的ASFV診斷制品，一律停止生產(chǎn)銷售。目前，已有多個ASFV檢測試劑盒通過農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)并取得文號，包括中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所聯(lián)合哈爾濱國生生物科技股份有限公司等單位研制的ASFV熒光PCR檢測試劑盒(表2)[35]。國外批準(zhǔn)的ASFV檢測試劑盒也以qPCR居多，ELISA試劑盒次之(表2)，其中qPCR中的VetMAXTMASFV Detection Kit經(jīng)過歐盟ASF參考實驗室(CISA-INIA)驗證。自2015年起在東歐和亞洲疫情爆發(fā)中廣泛使用，應(yīng)用于臨床確診以及家豬和野豬中ASFV感染的篩查。

表2 國內(nèi)外已批準(zhǔn)使用的非洲豬瘟檢測試劑盒

基因缺失減毒疫苗(例如MGF 360、MGF 505和CD2v基因缺失)可能是目前最有前途的候選ASF疫苗之一[36]。LIN等[37]在2020年開發(fā)了一種三重qPCR法檢測ASFV基因組的B646L、MGF 360-14L和CD2v基因，用于鑒定ASFV基因缺失毒和野毒，該方法不與豬的其他病毒DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。GUO等[38]建立了基于B646L和MGF 505-2R基因的雙重TaqMan qPCR方法，該方法可單獨或同時特異性檢測B646L和MGF 505-2R基因，用以區(qū)分野毒和MGF基因缺失毒株。

(2)多重PCR:由于ASF臨床癥狀與CSF、PRRS等其他豬病癥狀表現(xiàn)相似，臨床上難以區(qū)分。因此，有必要開發(fā)一種多重PCR方法同時檢測這些癥狀相似的疾病。LIU等[39]于2020年建立了針對ASFV、CSFV和豬非典型瘟病毒(atypical porcine pestivirus，APPV)的多重PCR方法，結(jié)果表明，該方法具有特異性強、靈敏度高和穩(wěn)定等特點。

(3)數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR):dPCR是近幾年發(fā)展起來的一種核酸定量分析技術(shù)。與qPCR不同，dPCR對結(jié)果的判定不依賴于擴增曲線循環(huán)Ct值，不受擴增效率的影響，能夠直接讀出DNA的分子個數(shù)，進而實現(xiàn)對起始樣本核酸分子的絕對定量。在此基礎(chǔ)上，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)利用密封芯片分割樣本到數(shù)千個反應(yīng)井中進行獨立的PCR擴增，開發(fā)了另外一種dPCR，該方法稱為納米流體芯片數(shù)字PCR (cdPCR)。JIA等[40]于2020年通過對ASFV B646L基因的部分序列設(shè)計特異性引物和探針利用cdPCR技術(shù)檢測ASFV，并與OIE推薦的VetMAXTMASFV qPCR檢測試劑盒進行對比。結(jié)果表明，cdPCR的敏感性不及qPCR，但這也是cdPCR首次成功用于ASFV檢測。

(4)等溫核酸擴增法:等溫核酸擴增技術(shù)是近年來發(fā)展起來的基于恒溫擴增的新型核酸擴增技術(shù)，主要包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification，RPA)、重組酶介導(dǎo)等溫擴增(recombinase aided amplification，RAA)。該技術(shù)不需要昂貴的熱循環(huán)儀，只需要恒溫設(shè)備即可完成擴增反應(yīng)，具有操作簡便、性價比高等特點，且具有較高的敏感性和特異性。

3.2 血清學(xué)診斷

3.2.1酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) ELISA的原理是利用酶標(biāo)抗原或抗體來檢測相對應(yīng)的抗原或抗體的免疫學(xué)技術(shù)，具有特異性強、敏感性高、重復(fù)性好、檢測速度快等優(yōu)點，并且ELISA使用96孔板來檢測，因此非常適用于“群體”檢測。ELISA種類很多，包括用來檢測抗體的間接ELISA和阻斷ELISA、檢測抗原的雙抗體夾心ELISA等。表2展示了部分經(jīng)過驗證的ASFV ELISA檢測試劑盒，其中，ID Screen?ASF Indirect是基于多種抗原(p72、p30和pp62)的間接ELISA抗體檢測試劑盒；INGENASA公司的INGEZIM PPA COMPAC K3是基于p72蛋白的競爭ELISA抗體檢測制品，是歐盟區(qū)域使用最廣泛的試劑盒。

過去已經(jīng)開發(fā)出許多針對ASFV蛋白的抗原ELISA方法，包括直接、間接和夾心ELISA。一般認(rèn)為ASFV抗原ELISA的敏感性不如PCR[41]。首次用于檢測ASFV的直接ELISA可以檢測到50～500 HAD50/mL的ASFV[42]。后來建立了一種基于針對p72蛋白的單克隆抗體(monoclonal antibody，MAb)的夾心ELISA對同源抗原的檢測高度敏感。HUTCHINGS等[43]建立了2種間接夾心ELISA用于檢測ASFV抗原，一種是使用多克隆抗體，另一種是使用MAb和多克隆抗體的組合。2種檢測方法均檢測到了來自多種現(xiàn)場分離株的抗原，但是發(fā)現(xiàn)使用多克隆抗體的檢測方法比使用MAb的方法敏感性更高。

3.2.2化學(xué)發(fā)光免疫分析法(chemiluminescent immunoassay，CLIA) CLIA是由HALMAN等[44]將化學(xué)發(fā)光與抗原抗體免疫反應(yīng)相結(jié)合建立的一種方法。CLIA結(jié)合了高度敏感的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)和高度特異性的免疫反應(yīng)，是目前使用最廣泛的免疫分析技術(shù)。CLIA分為3種類型：酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA)、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析。CLELA是以酶標(biāo)記抗原或抗體進行免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測定，酶標(biāo)抗體或抗原的濃度決定了化學(xué)發(fā)光的強度(圖3)。辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)為CLEIA常用的標(biāo)記酶，發(fā)光底物以魯米諾(luminol)、AMPPD為代表，相較于傳統(tǒng)免疫技術(shù)(放射免疫技術(shù)、酶免疫技術(shù)、熒光免疫技術(shù)等)，CLIA具有自動化程度高、特異性好、精確度高、檢測范圍廣等優(yōu)勢，在檢驗醫(yī)學(xué)中有多方面的應(yīng)用，但是在獸醫(yī)學(xué)中的臨床應(yīng)用相對較少。近年來關(guān)于化學(xué)發(fā)光法檢測技術(shù)在動物疫病診斷中的應(yīng)用只有偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒、圓環(huán)病毒等幾篇報道[45-46]。

圖3 基于化學(xué)發(fā)光法的間接ELISA原理圖

3.2.3側(cè)向流動免疫層析法(lateral flow immunoassay，LFA) LFA試紙條是一種定性色譜分析方法，體積小、攜帶方便，適合于疾病現(xiàn)場診斷。該技術(shù)已開發(fā)出多種檢測方法，如膠體金免疫層析試紙條和熒光免疫層析試紙條。目前，膠體金試紙條檢測存在一定的不足，如敏感性和特異性低、缺乏定量能力。因此，高敏感性和具有定量能力的熒光免疫層析技術(shù)在人類和動物疫病診斷中更受歡迎。熒光免疫層析技術(shù)主要由納米顆粒熒光微球(圖4A)和LFA試紙條組成，其基本原理為：用熒光微球標(biāo)記特異的MAb，將另一種特異的MAb預(yù)先固定于硝酸纖維素膜的檢測區(qū)(T線)，將抗鼠IgG抗體固定于硝酸纖維素膜的質(zhì)控區(qū)(C線)；加入待測樣品后，基于側(cè)向流動免疫層析原理，樣品中的抗原與熒光微球標(biāo)記抗體結(jié)合后，流經(jīng)檢測區(qū)，與另一種特異性MAb結(jié)合，形成抗體-抗原-熒光微球標(biāo)記抗體復(fù)合物；同時剩余的熒光微球標(biāo)記抗體在質(zhì)控區(qū)與抗鼠IgG結(jié)合，形成抗體-熒光微球標(biāo)記抗體復(fù)合物；在紫外光激發(fā)下，檢測區(qū)出現(xiàn)熒光條帶為陽性結(jié)果，未出現(xiàn)熒光條帶為陰性結(jié)果(圖4B)。近年來，已開發(fā)出許多基于熒光微球的試紙條用于定量或半定量檢測[47]，但是常規(guī)的熒光染料并不理想，因為它們易于發(fā)生光漂白并且穩(wěn)定性差或量子產(chǎn)率低。摻雜鑭系元素的聚苯乙烯納米顆粒熒光微球可以克服這些問題，同時具有簡單、快速、易于生產(chǎn)的優(yōu)勢，已應(yīng)用在多種疾病的診斷[48-49]。

圖4 熒光微球抗原檢測試紙條原理圖

血清學(xué)檢測技術(shù)因簡便、成本低和無需特殊的儀器設(shè)備，而成為最常用的檢測手段。由于沒有商業(yè)化的ASF疫苗，因此抗體檢測尤其重要，ASFV抗體陽性意味著動物當(dāng)前或者曾經(jīng)發(fā)生了感染。此外，ASFV抗體在感染早期即可出現(xiàn)，并且可持續(xù)長達數(shù)月甚至數(shù)年。然而，在特急性和急性感染中，豬通常在抗體轉(zhuǎn)為陽性前已死亡。因此，基于抗體的監(jiān)測對于檢測存活的動物，闡明ASF的流行病學(xué)特征(即自病毒引入豬場以來的時間)以及檢測涉及低毒力ASFV分離株的傳播至關(guān)重要[50-51]，對于實施ASF根除計劃也是不可缺少的[52]。

4 小結(jié)與展望

在過去的100年中，ASF一直是世界上最危險的動物傳染病之一，盡管許多國家投入了大量時間、精力和經(jīng)費，但仍缺乏有效的疫苗和治療方法。過去的研究工作表明，基于物理或化學(xué)滅活的ASF疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗和基于病毒載體的疫苗都無法誘導(dǎo)保護性免疫[53-54]。減毒ASFV分離株已被證明可以對同源毒株提供免疫保護，但由于野毒和疫苗毒之間可能會發(fā)生重組，產(chǎn)生新毒株，具有安全隱患，阻礙了疫苗的研發(fā)進程[55]。目前防控ASF入侵和傳播只能依靠流行病學(xué)監(jiān)測、早期診斷和嚴(yán)格的生物安全措施。

目前，我國的ASF形式已由急性型轉(zhuǎn)為亞急性型，流行趨勢逐漸放緩，感染豬出現(xiàn)低死亡率、臨床癥狀不明顯等弱毒株感染特征。2020年以來，在我國各地區(qū)主動監(jiān)測的樣品中發(fā)現(xiàn)了ASFV變異株，分離株的基因組序列發(fā)生了不同程度的變化，包括核苷酸突變、插入、缺失或替換等。其中，CD2v基因相對于其它基因突變頻率更高，導(dǎo)致部分毒株血吸附特性喪失，毒力減弱，感染動物臨床癥狀不明顯，給ASF防控帶來了挑戰(zhàn)。另外，據(jù)有關(guān)媒體報道，在我國一些豬場鑒定出新形式的ASFV，即所謂人工改造的非法疫苗株，該病毒缺失MGF和/或CD2v基因，毒力減弱。同時，我國現(xiàn)地出現(xiàn)了基因Ⅰ型弱毒株，全基因組序列分析顯示，與葡萄牙的弱毒分離株NH/P68和OURT 88/3具有高度的同源性，基因組左可變區(qū)的MGF基因存在大片段缺失。目前我國ASFV毒株類型多樣化，基因Ⅱ型野毒株和人工改造的非法疫苗株(基因缺失毒株)之間，基因Ⅰ型弱毒株與基因Ⅱ型野毒株之間都存在重組的可能性。因此，有必要定期對我國各地區(qū)進行ASF流行病學(xué)監(jiān)測，以快速掌握ASFV的流行趨勢和遺傳變異規(guī)律，更好地應(yīng)對變異株所帶來的復(fù)雜情況。

變異株的出現(xiàn)有多種原因，第1個可能是因為我國生豬養(yǎng)殖規(guī)模大，提高了病毒的流行范圍和頻率；第2個可能是由于病毒在我國長期流行，為了適應(yīng)環(huán)境而做出一些改變，包括病毒毒力減弱、感染豬臨床癥狀不明顯等。早期的急性型ASF致死率高，而當(dāng)前出現(xiàn)的變異株毒力減弱、潛伏期延長，死亡率降低，更容易向外界散播病毒，病毒也更容易在豬群中生存。還有一部分原因在于非法的ASFV疫苗株在豬場中流行，可能導(dǎo)致病毒加速變異。非法ASFV疫苗的使用使我國ASF流行病學(xué)更加復(fù)雜，防控難度加大。ASFV弱毒株感染隱蔽性更強、臨床癥狀出現(xiàn)更晚、不易被察覺，目前的病原學(xué)及血清學(xué)檢測技術(shù)亟待升級，以便更快、更準(zhǔn)確地進行ASF監(jiān)測。

當(dāng)前開發(fā)的檢測技術(shù)大多是基于qPCR的診斷方法，需要較長的樣本準(zhǔn)備和分析時間以及昂貴的儀器，不適合現(xiàn)地快速檢測。血清學(xué)檢測技術(shù)，如ELISA抗體檢測適合于群體檢測，但由于感染后抗體的產(chǎn)生是滯后的，因此通過抗體檢查也很難篩查出處于潛伏期內(nèi)的豬只，并且ELISA抗體檢測敏感性和準(zhǔn)確性存在著一定的不足。膠體金試紙條雖然適合現(xiàn)地檢測，并且在十幾分鐘內(nèi)就可判定結(jié)果，但同樣存在著敏感性和準(zhǔn)確性不足的問題。隨著ASF持續(xù)傳播，迫切需要開發(fā)敏感、特異、適合現(xiàn)場檢測的快速診斷方法。在ASF流行之際，人類的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)也正在發(fā)生大流行，許多國內(nèi)外學(xué)者開發(fā)出新的快速檢測技術(shù)用于防控該病，諸如免疫IgM/IgG抗體檢測[56]、納米孔測序技術(shù)[57]、化學(xué)發(fā)光法[58]等檢測方法。另外，CRISPR基因編輯技術(shù)也被應(yīng)用于COVID-19診斷，利用Cas9、Cas12、Cas13等核酸酶開發(fā)出一系列新的檢測技術(shù)，可以快速準(zhǔn)確地檢測病毒[59-61]。ASF診斷技術(shù)也正朝向這些領(lǐng)域發(fā)展，相信會有更多可靠便捷的診斷技術(shù)和產(chǎn)品問世，推動ASF的有效防控。