姜 尚,李心慰，王 哲，劉國文，宋玉祥 (吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062)

圍產(chǎn)期奶牛處于能量負(fù)平衡(NEB)狀態(tài)，導(dǎo)致脂肪過度動員，使得循環(huán)中游離脂肪酸(FFAs)濃度增加[1]。過量的FFAs在肝臟中蓄積，經(jīng)不完全氧化生成酮體(主要為β-羥基丁酸，BHB)，引發(fā)酮病。其中亞臨床酮病的平均發(fā)病率約為24.1%，高于臨床酮病[2]。酮病奶牛存在全身系統(tǒng)性炎癥，其特征是促炎細(xì)胞因子和急性期蛋白(APP)在血液中的水平升高[3]。酮病奶牛的系統(tǒng)性炎性反應(yīng)會增加乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎和蹄葉炎等其他炎癥性疾病的發(fā)病率，進(jìn)一步加劇其帶來的經(jīng)濟(jì)損失[4]。然而，酮病奶牛發(fā)生全身系統(tǒng)性炎癥的潛在原因尚不清楚。

中性粒細(xì)胞(PMN)是固有免疫的第一道防線，在血液白細(xì)胞中的占比最大，并且最先募集到局部炎癥部位發(fā)揮作用。PMN在炎性反應(yīng)放大中起著重要作用，其過度活化會導(dǎo)致局部和系統(tǒng)性炎性反應(yīng)[5]。PMN富含多種包裹著豐富的生物酶的顆粒，其中髓過氧化物酶(MPO)是嗜天青顆粒(AGs)中含量最高的蛋白酶，其通過AGs脫顆粒釋放到細(xì)胞外后作為一種多功能促炎因子發(fā)揮作用，促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展[6-7]。

因此，本試驗(yàn)通過對比健康和酮病奶牛血液PMN的AGs的脫顆粒水平，并分析其與系統(tǒng)性炎性反應(yīng)的相關(guān)性，嘗試解釋酮病奶牛系統(tǒng)性炎性反應(yīng)的發(fā)生原因，為圍產(chǎn)期奶牛酮病及其繼發(fā)的炎癥性疾病的防治提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與樣品采集所有實(shí)驗(yàn)動物來自于吉林省長春市某奶牛養(yǎng)殖場。選取胎次(2～4胎次)，泌乳時間(產(chǎn)后3周內(nèi))相近的奶牛。所有篩查的奶牛都接受常規(guī)體檢，確保沒有臨床癥狀。根據(jù)牛奶酮粉檢測陽性結(jié)果篩選疑似酮病奶牛。隨后檢測血液BHB濃度，選擇15頭酮病(BHB>3 mmol/L)奶牛和15頭對照(BHB<1.2 mmol/L)奶牛。所有被選中的奶牛都被安置在一個氣候可控的谷倉內(nèi)，并有單獨(dú)的鐵欄，以減少環(huán)境干擾。每天在08:00 和15:30時擠奶，根據(jù)連續(xù)3 d的數(shù)據(jù)計算每頭奶牛的平均產(chǎn)奶量。奶?？梢噪S意獲得同樣的食物，淡水也可以持續(xù)供應(yīng)。根據(jù)連續(xù)3 d內(nèi)喂食和剩余的飼料計算各組的平均干物質(zhì)采食量(DMI)[8]。喂食前(6:30～07:30)從頸靜脈采集血樣，連續(xù)5 d。為了獲得血清，血樣在室溫下保存30 min，然后4℃，3 000 r/min離心10 min，收集血清，立即儲存于-80℃。

1.2 主要儀器與試劑D-37520低溫高速離心機(jī)購自德國Thermo Fisher公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)恒溫箱購自日本三洋公司；通用型電泳儀購自美國Bio-Red公司；流式細(xì)胞儀購自美國Becton Dickinson公司；使用日立7170自動分析儀及商用試劑盒(FFAs：目錄號FA115；BHB：目錄號RB1008；GLU：目錄號GL3815；Randox Laboratories)測定采集血清中FFAs、BHB和葡萄糖濃度；外周血PMN提取試劑盒(目錄號：LZS1094)購自天津?yàn)笊锕?；RPMI-1640培養(yǎng)基(目錄號：SH30809.01)購自美國Hyclone Laboratories公司；MPO抗體(目錄號：LS-C663612-100)購自美國LifeSpan BioSciences公司；β-actin抗體(目錄號：Ab8226)購自英國Abcam公司；CH138A抗體(目錄號：WSC0608B-100)購自美國Kingfisher Biotech公司；CD63抗體(目錄號：ABIN6254234)購自德國Antibodies online GmbH公司；PE熒光二抗購自美國United States Biological公司；Alexa Fluor?488熒光二抗購自美國Thermo Fisher Scientific公司；FITC CD11b熒光抗體購自美國Novus Biologicals公司。

1.3 血清炎性因子檢測以下使用的ELISA試劑盒均購自美國LifeSpan BioSciences公司。嚴(yán)格按照說明書操作，使用牛特異性ELISA試劑盒(HP：目錄號LS-F13229；SAA：目錄號LS-F12552)測定血清中結(jié)合珠蛋白(HP)和血清淀粉樣蛋白A(SAA)的質(zhì)量濃度。試劑盒對HP和SAA的敏感性分別為7.8，3.12 μg/L。使用牛特異性ELISA試劑盒(IL-1β：目錄號LS-F7588；IL-6：目錄號LS-F9752；IL-8：目錄號LS-F6143；TNF-α：目錄號LS-F5014)測量血清中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的質(zhì)量濃度。IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的試劑盒敏感性分別為6.5，0.46，26.1，3.1 ng/L。使用牛特異性ELISA試劑盒(MPO：目錄號LS-F6445)測定血清中MPO的質(zhì)量濃度。MPO試劑盒靈敏度為0.64 μg/L。

1.4 外周血PMN分離試驗(yàn)應(yīng)用商用試劑盒分離外周血PMN，其分離原理為密度梯度離心。嚴(yán)格按照說明書操作，在離心管中依次緩慢加入2種不同懸浮密度的A液和C液，體積比為2∶1，使其形成分離液面，然后加入相同體積的新鮮抗凝血液，在室溫下800×g離心30 min，取PMN層加入到無菌離心管中，加入洗滌液，搖勻后，1 000×g離心10 min，棄掉上清后加入紅細(xì)胞裂解液重懸， 5 min后， 1 000×g離心10 min，棄掉上清，用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸洗滌PMN 2次。獲得的PMN純度約為97.5%，細(xì)胞活力約為95%(臺盼藍(lán)染色法)。提取出PMN后進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)或流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)。

1.5 蛋白質(zhì)的提取和蛋白免疫印跡使用商用蛋白質(zhì)提取試劑盒(目錄號：C510003，生工生物技術(shù)有限公司)，嚴(yán)格按照說明書操作，從PMN中提取蛋白質(zhì)。通過BCA試劑盒(目錄號：P1511，普利萊有限公司)測量所提蛋白的質(zhì)量濃度。計算調(diào)整蛋白的質(zhì)量濃度后，加入蛋白上樣緩沖液， 95℃加熱5 min 使蛋白變性；每孔上樣30 μg總蛋白質(zhì)到12%的SDS-PAGE分離膠中，80 V電泳30 min，然后120 V電泳60 min；根據(jù)所需蛋白的相對分子質(zhì)量切取膠條，通過濕轉(zhuǎn)法(120 V，45 min)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到0.45 μm PVDF膜上；將PVDF膜置于3%的BSA中，在搖床上常溫封閉3 h，把封閉后PVDF膜浸沒于用TBST溶液 1∶1 000稀釋的一抗中，4℃孵育過夜；將一抗孵育后的PVDF膜用TBST溶液清洗3次，每次6 min。然后加入二抗，常溫孵育45 min；將二抗孵育后的PVDF膜用TBST溶液清洗3次，每次6 min；將PVDF膜放在顯影儀中，膜上均勻滴涂ECL顯影液，曝光，檢測蛋白含量。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)測定PMN AGs脫顆粒在室溫下用4%多聚甲醛固定PMN 20 min，洗去固定液，將細(xì)胞與稀釋濃度均為1∶100的CH138A抗體(一種特定的奶牛PMN標(biāo)記物)和CD63抗體(一種特定的奶牛AGs標(biāo)記物)一起孵育30 min；然后用4℃ PBS沖洗2次；將細(xì)胞與PE標(biāo)記的抗小鼠熒光二抗、Alexa Fluor?488標(biāo)記的抗山羊熒光二抗和FITC標(biāo)記的CD11b抗體一同孵育30 min；用4℃的PBS沖洗細(xì)胞2次；最后，使用流式細(xì)胞術(shù)通過測量PMN膜CD63的水平來檢測AGs的脫顆粒水平。

2 結(jié)果

2.1 對照組奶牛和酮病奶牛臨床參數(shù)和能量代謝指標(biāo)的比較如表1所示，與對照組相比，酮病組奶牛的DMI和產(chǎn)奶量較低(P<0.01)。酮病奶牛血清BHB和FFAs升高(P<0.01)。相反，酮病奶牛的血糖(GLU)較低(P<0.01)。表明酮病奶牛存在能量負(fù)平衡，表現(xiàn)為血清高FFAs、高BHB和低GLU。

表1 健康和酮病奶牛臨床參數(shù)和能量代謝指標(biāo)比較

2.2 對照組奶牛和酮病奶牛炎癥指標(biāo)的比較與對照組相比，酮病組奶牛血清中HP和SAA的濃度更高(P<0.01)(圖1A，B)。酮病奶牛血清促炎細(xì)胞因子質(zhì)量濃度增加(P<0.01)，包括IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α(圖1C～F)，同時血清中MPO質(zhì)量濃度升高(P<0.01)(圖1G)。

A，B.血清中HP和SAA的含量；C～F.血清中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的含量；G.血清中MPO的含量。**P<0.01圖1 對照組(n=15)和酮病(n=15)奶牛的血清炎癥指標(biāo)

并且，HP、SAA、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α與血清MPO均呈強(qiáng)正相關(guān)(表2)，表明酮病奶牛存在系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，且血清MPO與血清中的炎性因子呈現(xiàn)正相關(guān)。

表2 炎性因子與血清MPO的相關(guān)性分析

2.3 對照組奶牛和酮病奶牛PMN AGs脫顆粒作用的比較與對照組相比，酮病奶牛血液中分離的PMN內(nèi)MPO蛋白含量較低(P<0.01，圖2A，B)。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，酮病奶牛的CH138A+/CD63highPMN百分比較高(P<0.01)，圖2C，D)。同樣，酮病奶牛PMN中CD63(AGs脫顆粒標(biāo)志物)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)升高(P<0.01，圖2E)，表明酮病奶牛PMN AGs脫顆粒作用增強(qiáng)。

A.對照組和酮病奶牛PMN內(nèi)MPO的蛋白質(zhì)水平(每組的3條帶分別代表來自各組的3個奶牛樣本)；B.A中MPO蛋白水平的量化；C.流式細(xì)胞術(shù)分析正常和酮病奶牛PMN膜CD63水平；D.PMN中CH138A+/CD63high細(xì)胞百分比定量分析結(jié)果；E.對照組和酮病奶牛PMN中CD63 MFI的定量分析結(jié)果。**P<0.01圖2 對照組(n=15)和酮病組(n=15)奶牛PMN中AGs的脫顆粒

3 討論

圍產(chǎn)期奶牛的酮癥是一種核心能量代謝紊亂疾病，伴有系統(tǒng)性炎性反應(yīng)[9]。然而這種系統(tǒng)性炎性反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制尚不清楚。本研究確證了酮病奶牛的系統(tǒng)性炎性反應(yīng)的發(fā)生。酮病奶牛出現(xiàn)血清促炎細(xì)胞因子(包括IL-1β和IL-6)以及急性期蛋白APP(包括HP和SAA)質(zhì)量濃度的增加[3, 10]。這些系統(tǒng)性促炎介質(zhì)可以降低食欲，引起肝損傷，增加免疫系統(tǒng)的能量消耗，從而加重奶牛的NEB狀態(tài)[11-12]。系統(tǒng)性炎性反應(yīng)也會增加奶?；计渌装Y性疾病的風(fēng)險，包括乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎和蹄葉炎[13]。例如，與健康奶牛相比，酮病奶牛的子宮內(nèi)膜炎和層黏連炎的發(fā)病率分別高出2倍和5倍[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，酮病奶牛的血清MPO及其他促炎介質(zhì)IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、HP和SAA水平均顯著升高。MPO是PMN AGs脫顆粒的特異性標(biāo)記物，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)奶牛血清MPO含量與HP、SAA、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的含量均呈正相關(guān)。在已有的小鼠試驗(yàn)中，MPO的大量釋放會導(dǎo)致炎性小體的過度激活從而導(dǎo)致嚴(yán)重的系統(tǒng)性炎性反應(yīng)，通過添加脫顆粒抑制劑能有效抑制因MPO引起的系統(tǒng)性炎性反應(yīng)[15]。MPO敲除小鼠與皮膚中IL-1β含量降低有關(guān)[16]。在體外用TNF-α刺激奶牛PMN，細(xì)胞上清液中分泌出更多的MPO[17]，表明MPO和促炎細(xì)胞因子之間可能存在相互放大網(wǎng)絡(luò)。綜上所述，酮病奶牛PMN的AGs脫顆粒增強(qiáng)導(dǎo)致MPO等促炎介質(zhì)向胞外釋放增多與其系統(tǒng)性炎性反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)。

相比健康奶牛，酮病奶牛具有高FFAs血癥特征。FFAs具有脂毒性，其可通過激活NF-κB和NLRP3等炎性信號通路導(dǎo)致局部和系統(tǒng)性炎癥[18-20]。在免疫水平上，F(xiàn)FAs可損害先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的功能[21]，并且與酮病奶牛血液促炎細(xì)胞因子水平升高有關(guān)[22]。靜脈輸注FFAs可使人血漿MPO水平增加2倍[23]，這一事實(shí)表明FFAs與PMN的AGs脫顆粒之間存在潛在關(guān)系。因此酮病奶牛血液高濃度的FFAs可能是誘發(fā)PMN的AGs脫顆粒增強(qiáng)的原因之一，然而該假設(shè)尚需進(jìn)一步的研究來證實(shí)。

總之，本研究表明，酮病奶牛存在系統(tǒng)性炎性反應(yīng)，該系統(tǒng)性炎性反應(yīng)與PMN的AGs脫顆粒增強(qiáng)有關(guān)。本研究為圍產(chǎn)期酮病奶牛全身系統(tǒng)性炎癥的發(fā)生機(jī)制提供了新視野，為其防治提供了一定的理論基礎(chǔ)。