崔亮亮，蘇娜瑛，陳永林，呂志凱，孫秀秀，王璐夢(mèng)，劉曉麗，張萬(wàn)坡，胡薛英，谷長(zhǎng)勤，程國(guó)富 (華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

我國(guó)一直以來(lái)都是豬肉消費(fèi)大國(guó)，近年來(lái)生豬養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，但由于應(yīng)激對(duì)豬的福利和生產(chǎn)性能產(chǎn)生不良影響，集約化養(yǎng)豬場(chǎng)的應(yīng)激問(wèn)題日益引起人們的關(guān)注。由各種應(yīng)激原(免疫、運(yùn)輸、高溫、低溫、微生物感染等)引起的應(yīng)激使機(jī)體發(fā)生代謝紊亂，甚至出現(xiàn)損傷及死亡，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著動(dòng)物福利的普及和養(yǎng)殖水平的提高，生產(chǎn)過(guò)程中所面臨的應(yīng)激原也越來(lái)越少。但是，異地育肥的養(yǎng)殖模式導(dǎo)致豬在生產(chǎn)過(guò)程中至少被運(yùn)輸1次，接種的疫苗種類與次數(shù)更是繁多，使運(yùn)輸應(yīng)激和免疫應(yīng)激仍是現(xiàn)代養(yǎng)殖中不可避免的問(wèn)題，對(duì)養(yǎng)殖生產(chǎn)造成了很大的負(fù)面影響。在應(yīng)激反應(yīng)中，機(jī)體的神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)激活，同時(shí)免疫系統(tǒng)也被激活。細(xì)胞因子可作為一種介質(zhì)調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，使機(jī)體能夠在一定限度內(nèi)維持平衡[1]。其中，IL-1β、IL-6、TNF-α 3種促炎細(xì)胞因子在應(yīng)激領(lǐng)域中的研究最多[2-4]。急性期反應(yīng)是機(jī)體的一種非特異性反應(yīng)，合成的急性期蛋白對(duì)機(jī)體有廣泛防御意義(殺死感染微生物、修復(fù)受損組織、恢復(fù)機(jī)體平衡等)[5]。正常情況下，機(jī)體血液中的急性期蛋白濃度很低，而在應(yīng)激原的刺激下，濃度會(huì)發(fā)生顯著改變，這就使得急性期蛋白易于檢測(cè)。在應(yīng)激反應(yīng)中，研究最多的有CRP、HP、SAA、AGP、Apo-A1、pig-MAP等。因此，本試驗(yàn)以現(xiàn)代豬場(chǎng)中最常見的運(yùn)輸應(yīng)激與免疫應(yīng)激為研究對(duì)象，研究了應(yīng)激時(shí)細(xì)胞因子與急性期蛋白的變化規(guī)律，期望能夠找到合適的指標(biāo)用來(lái)檢測(cè)豬的應(yīng)激。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物 35日齡左右的二元雜交(大白×長(zhǎng)白)仔豬購(gòu)自廣西貴港市某規(guī)?；i場(chǎng)。

1.1.2主要儀器 核酸/蛋白質(zhì)濃度測(cè)定儀(型號(hào)：DU-640)購(gòu)于美國(guó)Beckman公司；高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)：5424R)購(gòu)于德國(guó)EPPENDORF公司；熒光定量PCR儀(型號(hào)：Step One Plus)購(gòu)于美國(guó)ABI公司；酶標(biāo)儀(型號(hào)：MK3)購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.3主要試劑 豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(WH株)購(gòu)于武漢科前生物股份有限公司；RNA isolater(商品號(hào)：R401-01)購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(商品號(hào)：R223-01)購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(商品號(hào)：Q711-02)購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；Pig IL-6 ELISA Kit(商品號(hào)：CSB-E06786p)購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司；Pig SAA ELISA Kit(商品號(hào)：CSB-E13309p)購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司；Pig Apo-A1 ELISA Kit(商品號(hào)：CSB-E06834p)購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司；Pig-MAP ELISA Kit(商品號(hào)：CSB-E13425p)購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司；Pig AGP ELISA Kit購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.1.4引物設(shè)計(jì)及合成 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站中獲取β-actin、CRP、HP、SAA、AGP、Apo-A1、pig-MAP序列并設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1，由武漢生工生物工程公司合成。

表1 熒光定量PCR引物相關(guān)信息

1.2 方法

1.2.1試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 將仔豬分為3組，分別為對(duì)照組(3頭)、免疫應(yīng)激組(4頭)、運(yùn)輸應(yīng)激組(4頭)。首先從健康豬群中隨機(jī)選擇7頭仔豬作為對(duì)照組和運(yùn)輸應(yīng)激組。隨后給欄內(nèi)剩余仔豬注射2 mL 豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(WH株)，部分仔豬迅速出現(xiàn)了明顯的應(yīng)激癥狀(呼吸急促、皮膚發(fā)紅、驚厥等)，從中隨機(jī)選取4頭作為免疫應(yīng)激組，4 h 內(nèi)剖殺；運(yùn)輸應(yīng)激組仔豬參照文獻(xiàn)[6]，采用敞篷車模擬公路運(yùn)輸4 h后剖殺，時(shí)速約為30 km/h，環(huán)境溫度約為12℃；對(duì)照組不做任何處理，直接剖殺。剖檢前用滅菌離心管采集豬血液備用，剖殺后迅速采集肝組織樣品液氮速凍后保存于-80℃保存。

1.2.2肝組織RNA提取、cDNA合成、熒光定量PCR檢測(cè) 使用TRIzol法提取肝組織總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒分兩步進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，第1步加入4× gDNA wiper Mix 4 μL， Total RNA 1 μg，加RNase Free H2O補(bǔ)齊至16 μL，42℃水浴2 min。第2步在第1步的反應(yīng)液中加入5×HiScriptⅡqRT SuperMixⅡ4 μL，混勻后置于PCR儀，50℃反應(yīng)15 min，85℃反應(yīng)5 s，獲得cDNA，將cDNA置于-20℃ 保存。熒光定量PCR采用SYBR GreenⅠ嵌合熒光染料法進(jìn)行，反應(yīng)體系：2× ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.6 μL。避光混合反應(yīng)體系，短暫離心后將樣品置于Applied Biosystems StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s和72℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.3血清分離及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 待血液常溫凝固2 h后于3 000 r/min室溫離心15 min，取上清，分裝后保存于-80℃ ，用于后續(xù)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫法測(cè)定IL-6；采用酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定SAA、Apo-A1、AGP、pig-MAP，具體試驗(yàn)時(shí)嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)輸應(yīng)激組肝組織細(xì)胞因子與急性期蛋白轉(zhuǎn)錄水平變化利用qPCR技術(shù)檢測(cè)運(yùn)輸應(yīng)激組肝組織細(xì)胞因子與急性期蛋白轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果如圖1所示，與對(duì)照組相比，運(yùn)輸應(yīng)激組肝組織IL-6表達(dá)量顯著下降(P<0.05)；IL-1β、TNF-α相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性改變；CRP、HP、SAA、pig-MAP表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，其中CRP、SAA、pig-MAP表達(dá)量的增加極顯著(P<0.01)；AGP相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性改變；Apo-A1相對(duì)表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)。

圖1 運(yùn)輸應(yīng)激組仔豬肝組織細(xì)胞因子與急性期蛋白轉(zhuǎn)錄水平分析

2.2 運(yùn)輸應(yīng)激組血清中細(xì)胞因子與急性期蛋白含量變化通過(guò)ELISA技術(shù)檢測(cè)運(yùn)輸應(yīng)激組血清中IL-6、SAA、AGP、Apo-A1、pig-MAP含量。結(jié)果如圖2所示，同對(duì)照組相比，運(yùn)輸應(yīng)激組血清中IL-6含量極顯著降低(P<0.01)；SAA、pig-MAP含量顯著升高(P<0.05)，其中pig-MAP含量的極顯著升高(P<0.01)；Apo-A1濃度顯著降低(P<0.05)；AGP濃度無(wú)顯著性變化。

圖2 運(yùn)輸應(yīng)激組血清中細(xì)胞因子與急性期蛋白的濃度測(cè)定

2.3 免疫應(yīng)激組肝組織細(xì)胞因子與急性期蛋白轉(zhuǎn)錄水平變化利用qPCR技術(shù)檢測(cè)免疫應(yīng)激組肝組織細(xì)胞因子與急性期蛋白轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，免疫應(yīng)激組肝組織IL-1β表達(dá)量極顯著增加(P<0.01)；IL-6相對(duì)表達(dá)量極顯著增加(P<0.01)；TNF-α相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性差異；CRP、HP、SAA、AGP表達(dá)量無(wú)顯著性改變；Apo-A1相對(duì)表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)；pig-MAP相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。

圖3 免疫應(yīng)激組仔豬肝組織細(xì)胞因子與急性期蛋白mRNA的表達(dá)分析

2.4 免疫應(yīng)激組血清中細(xì)胞因子與急性期蛋白濃度變化通過(guò)ELISA檢測(cè)免疫應(yīng)激組血清中IL-6、SAA、AGP、Apo-A1、pig-MAP濃度。結(jié)果如圖4所示，免疫應(yīng)激組血清中IL-6濃度極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；pig-MAP濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；Apo-A1極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；SAA、AGP濃度與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。

圖4 免疫應(yīng)激組血清中細(xì)胞因子與急性期蛋白的濃度測(cè)定

3 討論

本試驗(yàn)以最常見的免疫應(yīng)激與運(yùn)輸應(yīng)激為對(duì)象，檢測(cè)了在應(yīng)激中研究最多的3種細(xì)胞因子。IL-1β、IL-6、TNF-α由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞合成并分泌，可激發(fā)機(jī)體炎癥、參與免疫，并可以刺激肝細(xì)胞生成急性期蛋白，在應(yīng)激過(guò)程中有重要的作用[7]，因此本試驗(yàn)以其作為檢測(cè)指標(biāo)。運(yùn)輸應(yīng)激和免疫應(yīng)激時(shí)，IL-6 mRNA表達(dá)都出現(xiàn)改變，但變化規(guī)律不同，利用ELISA檢測(cè)血清中IL-6的濃度，結(jié)果顯示與mRNA水平的變化一致。在許多有關(guān)應(yīng)激的研究中，細(xì)胞因子在應(yīng)激中表達(dá)變化也不相同，沒有一個(gè)統(tǒng)一的變化規(guī)律。但是，也有研究表明IL-6可作為一個(gè)合適的應(yīng)激標(biāo)記物[8]?？偟膩?lái)說(shuō)，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)，受神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜調(diào)控，并受到應(yīng)激原種類及強(qiáng)度的影響，在應(yīng)激過(guò)程中處于一種動(dòng)態(tài)的變化，導(dǎo)致各種應(yīng)激研究中沒有一個(gè)統(tǒng)一的變化規(guī)律。綜上所述，細(xì)胞因子雖然在應(yīng)激過(guò)程中有所變化，但是變化的方向及幅度受眾多因素的影響，不適宜作為應(yīng)激的檢測(cè)指標(biāo)。本試驗(yàn)中IL-6雖然在2種應(yīng)激中出現(xiàn)了不同改變，但也可以作為豬場(chǎng)的一個(gè)預(yù)警指標(biāo)，高于或低于正常水平都預(yù)示著機(jī)體處于不健康的狀態(tài)。

本試驗(yàn)中，免疫應(yīng)激組和運(yùn)輸應(yīng)激組都出現(xiàn)了pig-MAP mRNA上調(diào)和Apo-A1 mRNA下調(diào)的現(xiàn)象，據(jù)此我們又利用ELISA檢測(cè)血清中的濃度，結(jié)果顯示與mRNA水平的變化一致。在前期試驗(yàn)中，通過(guò)滴鼻的方式使8周齡仔豬感染Ⅰ型胸膜肺炎放線桿菌引起豬應(yīng)激，發(fā)現(xiàn)Apo-A1在應(yīng)激時(shí)顯著下調(diào)，pig-MAP雖未發(fā)生顯著上調(diào)，但也有上升的趨勢(shì)，這也與本次試驗(yàn)中兩種應(yīng)激的研究結(jié)果基本一致[9]。許多研究也認(rèn)為急性期蛋白可作為豬應(yīng)激的檢測(cè)指標(biāo)，但具體急性期蛋白的種類及組合不盡相同。HEEGAARD等[10]研究了3種細(xì)菌(胸膜肺炎放線桿菌、豬鏈球菌、豬滑膜支原體)、1種寄生蟲(弓形蟲)、1種病毒(豬呼吸和生殖綜合征病毒)感染、1種無(wú)菌炎癥引起的豬應(yīng)激反應(yīng)急性期的變化規(guī)律，最終結(jié)果顯示最佳的3種蛋白質(zhì)組合分別是CRP、ApoA1、pig-MAP和CRP、Apo-A1、HP，其次是2種蛋白質(zhì)組合CRP、pig-MAP和Apo-A1、pig-MAP。本試驗(yàn)結(jié)果與之基本一致。CARPINTERO等[11]對(duì)非洲豬瘟和偽狂犬病的研究也發(fā)現(xiàn)，Apo-A1和pig-MAP 是適宜的檢測(cè)指標(biāo)。但SORENSEN等[12]對(duì)自然感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬肺炎支原體的豬的研究，以及對(duì)患有尾巴和耳朵咬傷、關(guān)節(jié)炎和其他急性炎癥的豬的研究表明HP是最佳的標(biāo)志物，但是其研究中沒有涉及Apo-A1的表達(dá)改變。CARPINTERO等[13]認(rèn)為Apo-A1是一種敏感的急性期蛋白，可作為檢測(cè)標(biāo)志物。本試驗(yàn)通過(guò)2種應(yīng)激模型及前期的感染試驗(yàn)得出MAP和Apo-A1是最適宜的應(yīng)激檢測(cè)指標(biāo)，其中MAP是正向急性期蛋白，Apo-A1是負(fù)向急性期蛋白，這2種急性期蛋白在應(yīng)激過(guò)程中的變化相反，也比只有正向或負(fù)向1種急性期蛋白更加有利的去檢測(cè)應(yīng)激。同時(shí)，急性期蛋白的半衰期比較長(zhǎng)，應(yīng)激發(fā)生后其濃度會(huì)迅速發(fā)生顯著性變化，并可在48 h甚至更久的時(shí)間內(nèi)維持較高水平，這也使其更便于檢測(cè)[14-15]。Apo-A1和pig-MAP的組合相對(duì)于單一檢測(cè)指標(biāo)可以增加應(yīng)激檢測(cè)的準(zhǔn)確性，相對(duì)于3個(gè)以上檢測(cè)指標(biāo)組合也可以節(jié)約時(shí)間和成本。